Abstrakt
Baggrund
Stammer fra primordiale kønsceller /gonocytes og udvikle via en forløber læsion kaldet Carcinoma
In Situ
(CIS), Germ Cell Kræft (GCC) er den mest almindelige kræftform hos unge mænd, opdelt i seminom (SE) og ikke-seminom (NS). Under fysiologiske kønsceller dannelse /modning, epigenetiske processer vagt homeostase ved at regulere tilgængeligheden af DNA til at lette transskription. Epigenetisk deregulering gennem genetiske og miljømæssige parametre (dvs. genvironment) kunne forstyrre embryonale kønsceller udvikling, hvilket resulterer i forsinket eller blokeret modning. Denne potentielt letter dannelsen af CIS og progression til invasiv GCC. Derfor bestemme epigenetiske og funktionel genomisk landskab i GCC-cellelinjer kunne give indsigt i patofysiologien og ætiologi for GCC og vejlede målrettede funktionelle eksperimenter.
Resultater
Denne undersøgelse har til formål at identificere epigenetiske fodspor i SE og EF cellelinier i genom-dækkende profiler ved at studere interaktionen mellem genekspression, DNA CpG-methylering og histon modifikationer, og deres funktion i patofysiologien og ætiologien af GCC. To godt karakteriserede GCC-afledte cellelinjer blev sammenlignet, en repræsentant for SE (TCAM-2) og den anden til EF (NCCIT). Data blev erhvervet ved hjælp af Illumina HumanHT-12-v4 (genekspression) og HumanMethylation450 BeadChip (methylering) microarrays samt chip-sekventering (aktiverende histon modifikationer (H3K4me3, H3K27ac)). Resultaterne indikerer kendte kim cellemarkører ikke kun skal skelnes mellem SE og NS på udtrykket niveau, men også i den epigenetiske landskab.
Konklusion
Den overordnede lighed mellem TCAM-2 /NCCIT support en slettet embryonisk kønsceller anholdt i begyndelsen gonadal udvikling som fælles celle af oprindelse selv om den nøjagtige udviklingstrin, hvorfra tumorcellerne stammer kan afvige. Faktisk subtil forskel i (integrerede) epigenetiske og udtryk profiler indikerer TCAM-2 for at udvise en mere kønsceller-lignende profil, mens NCCIT viser en mere pluripotent fænotype. Resultaterne giver indblik i den funktionelle genom i GCC-cellelinjer
Henvisning:. Van der Zwan YG, Rijlaarsdam MA, Rossello FJ, Notini AJ, de Boer S, Watkins DN, et al. (2014) seminom og Embryonale Carcinoma Footprints identificeret ved analyse af integrerede Genome Wide Epigenetisk og Expression Profiler af Kimcelle kræftceller. PLoS ONE 9 (6): e98330. doi: 10,1371 /journal.pone.0098330
Redaktør: Amr H. Sawalha, University of Michigan, USA
Modtaget: Marts 13, 2014 Accepteret: April 30, 2014; Udgivet: Juni 2, 2014
Copyright: © 2014 van der Zwan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Array og chip sekventering data er tilgængelige på Gene Expression Omnibus under tiltrædelsen nummer GSE56454
Finansiering:. Dette arbejde er støttet af midler fra European Society for Pediatric Endocrinology Research Fellowship (YZ). MR er understøttet af en Translationel Grant, Erasmus MC. SB er støttet af APA og intellektuelle ejendomsrettigheder stipendier fra Monash University. Dette arbejde blev støttet af midler fra Monash University (SW). MIMR modtager støtte fra den victorianske regering Operative Support Infrastructure Program. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Type II (testikler) kønsceller tumorer, her benævnt Germ Cell kræft (GCC), er den mest almindelige malignitet i kaukasiske teenagere og unge voksne, og deres forekomst er stadig stigende [1] – [3 ]. GCC stammer fra primordiale kønsceller eller gonocytes, og er opdelt i seminomer (SE) og ikke-seminomer (NS), med carcinom
in situ
(CIS) af testis som deres fælles precursor læsion [1], også kendt som intratubulær Kimcelle neoplasi Uklassificeret (IGCNU) [3]. I modsætning til CIS og SE, stamcelle komponent i NS (dvs. embryonal carcinoma, EF) er kendetegnet ved pluripotente potentiale [4]. EF kan differentiere til somatiske slægter og ekstra-embryonale væv (teratom vs blommesæk tumor og choriocarcinoma henholdsvis), herunder kimcellens afstamning [4]. Forskellige kliniske, miljømæssige og genetiske risikofaktorer for GCC er blevet identificeret, men er ikke helt klart den nøjagtige rolle af disse faktorer. Kliniske risikofaktorer udgør urologiske /andrologiske /gonadale afvigelser [5] – [8], mens miljømæssige faktorer fokuserer på hormonforstyrrende stoffer og androgen – østrogen balance [9] – [11]. Genetiske risikofaktorer omfatter en række modtagelighed Single-polymorfier, sandsynligvis relateret til tidlig gonadal udvikling [12] – [15], og en forening med familiær disposition [16]. Somatiske mutationer findes sjældent i GCC [17]. Der er stærke tegn på, at mikro-miljø i udviklingslandene testiklerne er af væsentlig betydning i patogenesen af GCC. Patienter med testikel dysgenese syndrom (TDS) og specifikke former for Sygdomme i Sex Development (DSD) er kendt for at have en øget risiko for at udvikle GCC grund af unormal gonadal udvikling, dvs. hypovirilization [18].
Epigenetisk processer en klar rolle i både initiering og beskyttelse af pluripotens [19]. Deregulering af disse stramt styrede processer vides at være involveret i dannelsen og udviklingen af forskellige cancertyper [20] – [24], herunder GCC [25]. Under fysiologiske kimcelle dannelse og modning, epigenetiske processer (fx DNA-methylering, histon modifikationer) vagt homeostase ved at regulere tilgængeligheden af DNA til at lette transskription [25], [26]. Den epigenome er meget dynamisk, og ændringer forekomme, afhængigt af celletype og udviklingsstadiet, påvirket af /afspejler (mikro-) miljø. På trods af denne viden, er lidt kendt om den rolle, histon ændringer og DNA methylering vedrørende genekspression i GCC i almindelighed, og de mulige ligheder og forskelle mellem SE og EF [25], [27]. Epigenetisk deregulering gennem genetiske og miljømæssige parametre (benævnt genvironment) kunne forstyrre fysiologisk embryonale kønsceller udvikling, hvilket resulterer i forsinket eller blokeret modning, hvilket letter dannelsen af CIS, og potentielt progression til en invasiv GCC [25], [28] – [30]. Derfor bestemme epigenetiske og funktionel genomisk landskab i GCC-cellelinjer kunne give indsigt i patofysiologien og ætiologi GCC. Resultaterne kunne vejlede målrettede funktionelle eksperimenter.
I denne undersøgelse epigenetiske fodspor af SE og EF-cellelinier blev identificeret ved at studere samspillet mellem genekspression, DNA methylering og histon modifikationer. To godt karakteriserede GCC-afledte cellelinjer blev anvendt, en repræsentant for SE (TCAM-2) [31], [32] og den anden til EF (NCCIT) [33]. To typer af epigenetiske ændringer blev undersøgt og relateret til genome wide udtryk analyse:. CpG DNA methylering status, og berigelse af aktiverende histon mærker (H3K4me3, H3K27ac)
Metoder
Cell kultur
TCAM-2 [31], [32], [34] og NCCIT [33] celler blev dyrket i DMEM-medium (# 31.966-021, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) indeholdende 10% føtalt kalveserum (FCS, GE Healthcare Life Sciences, HyClone Laboratories, Utah, USA) i T75 cm
2 kolber til 75-90% sammenløb. For RNA-fremstilling, blev frisk medium tilsat 24 timer før høst. Celler blev vasket en gang med Hanks balancerede saltopløsning (HBSS, # 14.175-053, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA), og lyseret med 7 ml iskold RNA-Bee (# Cs-105B, TEL -test Inc, Friendswood, Texas, USA). For methylering, genekspression (biologiske dubletter) og chip-seq analyser blev forskellige kulturer af celler fra en enkelt kilde brugt (LEPO lab, Patologisk Institut, Erasmus MC Rotterdam). Biologiske replikater blev startet som uafhængige kulturer på forskellige dage og behandlet på lignende måde.
Methylering profilering
DNA blev isoleret under anvendelse af DNeasy kit ifølge producentens instruktioner (# 69.504, QIAGEN, Hilden, Tyskland). Omdannelse med bisulfit (EZ DNA-methylering Gold Kit, Zymo Research, Irvine, CA, USA) og påvisning methylering blev udført ved ServiceXS (ServiceXS B.V., Leiden, Holland). Illumina s HumanMethylation450 BeadChip blev brugt (Illumina, Inc., San Diego, CA, U.S.A, forarbejdning og hybridisering i overensstemmelse med producentens anvisninger). Billedbehandling fandt sted den iScan systemet og dataene blev ekstraheret ved hjælp GenomeStudio med indstillinger standard analyse (herunder baggrund korrektion og normalisering baseret på interne kontroller) og v 1.2 i annotation manifest (https://support.illumina.com/downloads /humanmethylation450_15017482_v12.ilmn). Yderligere behandling blev udført i R ved hjælp af (https://www.bioconductor.org/) pakke LUMI [35] efter den optimerede “lumi: QN + BMIQ” rørledning [36] Dette omfatter udelukkelse af dårligt fungerende sonder (p 0,01), farvejustering, fraktil normalisering og korrektion for sonde typen bias (Infinium i vs II) ved hjælp af BMIQ algoritmen [37]. Alle rå og forarbejdede datafiler indsendes som en GEO SuperSeries og tilgængelige via GSE56454 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Differentielt methylerede regioner blev identificeret ved hjælp af DMRforPairs algoritme, der anvender standardindstillingerne [38]. DMRforPairs er tilgængelig via BioConductor: (https://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DMRforPairs.html). Kort fortalt DMRforPairs definerer genomiske regioner ved hjælp af lokale sonde massefylde og eventuelt funktionel homogenitet (for eksempel alle prober i en region bør gen associeret). Det kvantificerer, test og visualiserer (differential) methylering mønstre mellem unikke prøver. Forskelle blev beregnet som NCCIT versus TCAM-2.
genekspressionsprofilering
Ca. 20 ug af RNA blev behandlet med RNase-fri DNasel (# 2238, Ambion, Ambion Inc., Austin, TX , USA) i 30 minutter ved 37 ° C og efterfølgende oprenset ved anvendelse af RNeasy mini kit (# 74.104, Qiagen, Hilden, Tyskland) ifølge producentens instruktioner. Pure RNA blev elueret i 50 pi vand, og kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop (Thermo Scientific). Kvalitetskontrol, RNA mærkning, hybridisering og data ekstraktion blev udført ved ServiceXS B.V. (Leiden, Holland) i overensstemmelse med deres interne protokol. Biotinyleret cRNA blev fremstillet under anvendelse af Illumina TotalPrep RNA Amplification Kit (# AMIL1791, Ambion Inc., Austin, TX, USA) i overensstemmelse med producentens specifikationer med et input på 200 ng totalt RNA. Per prøve, blev 750 ng af det biotinylerede cRNA hybridiseret på Illumina HumanHT-12 v4 (Illumina, Inc., San Diego, CA, USA) ifølge Illumina Manual “Direkte hybridiseringsassay Guide”. Billedbehandling fandt sted den iScan systemet og dataene blev ekstraheret ved hjælp GenomeStudio (standardindstillinger). Yderligere behandling blev udført i R ved hjælp af LUMI pakken (https://www.bioconductor.org/) [35]. Efter retningslinjerne i [39], blev robust spline normalisering påføres log2 forvandlet intensitetsværdier. Sonder med p
afsløring 0,05 i 50% af prøverne blev udelukket fra analysen (n = 27.964 ud af 47.323). Gennemsnitlige log2 intensiteter af biologiske replikater og pr genet, blev anvendt til at vurdere ekspressionsniveauer (GEO accessionsnummer GSE56454). Log2 forhold (R) af gennemsnittet intensiteter i de to cellelinier (NCCIT /TCAM-2) blev anvendt til at identificere betydeligt differentielt udtrykte gener. Gener med ekspressionsniveauerne uden for 99% konfidensintervallet (CI) i denne log forhold blev identificeret som differentielt udtrykt mellem NCCIT og TCAM-2.
histon modifikation profilering (H3K27ac, H3K4me3)
chip assay blev udført ifølge det lave celleantal chip protokol fra Diagenode (Liege, Belgien), med mindre modifikationer. Kort fortalt, 1 × 10
6 celler blev tværbundet i otte minutter ved tilsætning af formaldehyd til en slutkoncentration på 1%, efterfulgt af neutralisering med 1,25 M glycin. Cellerne blev derefter lyseret, og chromatin blev klippet til ~500 bp fragmenter ved hjælp af Covaris sonikator under følgende betingelser; duty cycle 20%, peak indfaldende effekt 200 watt, cykler /burst 200, tid 5 min, temperatur 4 ° C. Protein A-coatede Dynabeads (# 10002D, Invitrogen, Thermo Fisher Scientific /Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev inkuberet med 7 ug af følgende antistoffer: H3K4me3 (Diagenode pAb-003-050) eller H3K27ac (Ab4729, Abcam, Cambridge, UK). Perlerne blev kombineret med kromatin fra 1 × 10
6 celler natten over på en roterende hjul. De immunoperler blev vasket, og DNA blev oprenset ved anvendelse af iPure DNA-oprensningskittet (AL-100-0100, Diagenode, Liège) ifølge producentens instruktioner. DNA-fragmenter blev klippet en anden gang under anvendelse af en Covaris sonikator (duty cycle 10%, peak incidens effekt 175 watt, cykler /burst 200, tid 5 minutter, temperatur 4 ° C). Massivt parallelle sekventering af chip-DNA (chip-Seq) blev udført under anvendelse af 5500xl solid ™ sekventering platform (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) ved Monash Health Oversættelse Precinct Medicinsk Genomics Facility. De sekventering forsøgene var single-ende med 50 nt læse længde (300 nt gennemsnitlig fragment størrelse). Sekventering læser blev justeret til den fuldstændige hg19 humane genom (UCSC udgave februar 2009) ved hjælp LifeScope ™ Genomisk Analysis Software v2.5 (https://www.lifetechnologies.com/lifescope). Chip-Seq eksperimentelle prøver blev normaliseret til i alt 10
7 entydigt kortlagte sekventering tags. Dataene blev behandlet i HOMER ([40], https://homer.salk.edu/homer/chipseq/) at opdage toppe og motiv berigelser ved hjælp standardindstillingerne (undtagen “fold berigelse løbet input” brugte 2 tærskel for p -værdi 0,01) (GEO accessionsnummer GSE56454). Peak højder fra Homer blev korrigeret for baggrund (laveste tophøjde påviselig). Heights blev derefter summeret pr gen (ΣP) som kommenteret af Homer og gener uden påviselig top blev sat til 0. Forskellen i summerede tophøjder (ΔΣP = ΣP
TCAM-2-ΣP
NCCIT) blev anvendt til kvantificere forskelle mellem cellelinierne. Gener med betydeligt differentieret histon modifikation mønstre blev identificeret for begge mærker separat (uden 99% CI af ΔΣP). Foreningen af en top med TSS blev brugt som kommenteret af HOMER (1 kb opstrøms for TSS – 100 bp nedstrøms)
MLPA-DNaseI analyse
MLPA sonder blev designet efter tidligere beskrevne kriterier [. ,,,0],41]. Baseret på differentierede modifikation mønstre i NCCIT og TCAM-2 prober blev designet til følgende loci: NCCIT: CHR3: 181425532-181425720, CHR5: 146.699.813-146.699.953, CHR3: 181.577.755-181.577.830, CHR6: 15.240.050-15.240.160, chr15: 93.191.596-93.191.696 , CHR3: 178.908.801-178.908.966, CHR5: 101.550.991-101.551.125, TCAM-2: CHR11: 10.613.134-10.613.220, CHR1: 201.278.163-201.278.251, chr12: 3.091.402 til 3.091.483, CHR19: 13.985.162-13.985.322, CHR2: 38.323.813-38.323.931, chr9: 843.018 -843.110, CHR5: 140.762.378-140.762.475. MLPA-DNasel blev udført som tidligere beskrevet [42], med mindre modifikationer. Kort fortalt kerner fra 1 × 10
6 celler blev isoleret og behandlet med en række DNasel koncentrationer (0, 2 og 5 enheder). Spaltet genomisk DNA blev oprenset, og 50-100 ng blev anvendt i en MLPA reaktion. Efter PCR-amplifikation af ligerede prober, blev produkter separeret på en ABI3700 DNA-sekventeringsapparat. Dataene blev analyseret som tidligere beskrevet, med en reduktion til 75% af tophøjde i ufordøjet DNA anvendt som en tærskel for at definere DNasel-overfølsomhed [43].
Software
Analyser blev udført i R 3.0.1 (Windows 7 × 64) og 2.15.2 (Redhat Linux × 64). De netværk /berigelse analyser blev udført i IPA (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com). Genomisk positioner rapporteret i dette manuskript er baseret på GRch37 /hg19 forsamling.
Resultater
For at undersøge epigenetiske egenskaber for SE og EF, og deres forhold til genekspression, genom-dækkende histon modifikation og DNA methylering mønstre blev undersøgt i cellelinjer TCAM-2 (SE) og NCCIT (EF), og matches til genekspression profiler. Forskellene mellem de to cellelinier over for histon modifikation og DNA-methylering status blev først undersøgt separat. Efterfølgende blev de resulterende datasæt integreret til at identificere (mål) gener med en stærk sammenhæng mellem primet DNA konfiguration og højere ekspressionsniveauer.
Histon modifikation
Histon modifikation mønstre blev vurderet ved anvendelse af kromatin immunopræcipitation kombineret med high throughput sekventering (chip-seq). Dataanalyse blev udført som beskrevet i materialer og fremgangsmåder afsnittet. Ændringer i H3K4me3 og H3K27ac blev undersøgt, som er markører associeret med promotor aktivering (transkriptionsstartstedet (TSS), H3K4me3 og H3K27ac) og enhancer aktivering (primært H3K27ac) [44], [45]. Ud over analysen af (differential) ændring mønstre, blev motiv berigelse af de modificerede områder undersøgt og sammenlignet mellem de cellelinjer.
H3K4me3 og H3K27ac viser ikke forskellen berigelse nær transcription start-sites og deres tophøjder korrelerede i gener.
Afhængigt af cellelinjen, 10,2 /11,3% af H3K27ac beriget loci var placeret inden for 1 kb af en TSS mod en sammenlignelig 14,7 /16,8% af H3K4me3 loci (TCAM-2 /NCCIT) . Dette er i overensstemmelse med observationer i andre celletyper, der viser, at selv om H3K4me3 er direkte relateret til promoter aktivering, er et stort flertal af H3K4me3 loci placeret distalt for TSS [46]. H3K27ac har ingen rapporteret fortrinsret lokalisering til TSS [47]. Niveauet af summerede toppe pr gen (ΣP, se fremgangsmåder) blev anvendt til at sammenligne histon modifikation mønstre mellem de to histon varemærker. Der var signifikant sammenhæng i begge cellelinier mellem peak niveauer på gener, hvor både var til stede (ρ
TCAM-2 = 0,62, p
TCAM-2 0,001, n
TCAM-2 = 1837; ρ
NCCIT = 0,37, p
NCCIT 0,001, n
NCCIT = 746; Spearmans ρ). Dette er i overensstemmelse med deres overlappende funktion: åben kromatin konfiguration er forbundet med både mærker [19], [22] og tillod os at kombinere histon modifikation resulterer i den efterfølgende analyse
H3K4me3 og H3K27ac berigelse mønstre i. TCAM-2 og NCCIT er i overensstemmelse med kendt SE /EF markører specificitet.
Vi har tidligere vist, at aktive kromatin modifikation mønstre for
SOX17
SOX2
i cellelinjer TCAM-2 og NCCIT matche det forventede mønster, baseret på gen og protein udtryk og histologiske forfatning (
SOX17
aktiv i TCAM-2,
SOX2
aktiv i NCCIT) [25]. I tråd med dette,
SOX17
SOX2
blev forskelligt beriget for både H3K4me3 og H3K27ac i TCAM-2 og NCCIT henholdsvis (figur 1).
OCT3 /4
viste ingen berigelse inden den kodende sekvens, men der var berigelse af begge mærker tæt på TSS i NCCIT og TCAM-2. Dette er i overensstemmelse med kendt OCT3 /4 mRNA og proteinekspression i begge cellelinier [31], [48]. NANOG var mere beriget for begge markører i TCAM-2, i overensstemmelse med forskelle i ekspression (se nedenfor).
Pile angiver retningen for transkription. Grønne bokse angiver markører specifikke for den histologiske subtype repræsenteret af cellelinjen. Sorte kasser = ingen forskel mellem cellelinjer; røde kasser = ikke en markør for denne celletype. Bemærk de forskellige intervaller på y-aksen for H3K4me3 og H3K27ac.
På en genom-plan, blev 29,428 H3K4me3 beriget loci identificeret i TCAM-2 og 19.015 i NCCIT. 25-41% mere beriget loci blev identificeret for H3K27ac end for H3K4me3 (n
TCAM-2 = 41.569, n
NCCIT = 23.763). Gener med betydelige forskelle i summeres tophøjde pr gen (ΔΣP, se metoder) blev udvalgt til yderligere analyse. For TCAM-2, gener, der viser differentierede histon modifikationer var højere i nummer for H3K27ac (n
TCAM-2 = 433, N
NCCIT = 28). For NCCIT, der var væsentligt flere gener udvalgt til H3K4me3 forhold til H3K27ac (n
TCAM-2 = 215, N
NCCIT = 325). For begge mærker, 86/11 gener overlappede mellem top differentierende lister i TCAM-2 og NCCIT hhv. Disse omfattede SE markør
SOX17
i TCAM-2 og EF markør
SOX2
i NCCIT (figur S1, tabel S1). Funktionsmæssigt gen lister over begge cellelinier viste signifikant berigelse for (embryonal) stamcelle vedligeholdelse /pluripotens (tabel S2). Berigelse af biologiske funktioner i TCAM-2 angivet lighed til mere modne kønsceller, som mangler i listen over NCCIT (GO kategorier TCAM-2 omfattede udvikling af normal testikel morfologi og kønsceller vedligeholdelse). Desuden to kønsceller-specifikke kanoniske veje IGF1 signalering (log
p = 3,42) og kønsceller-Sertolicellen Junction Signaling (log
p = 2,11)) viste berigelse. I TCAM-2 blev to funktionelle netværk identificeret inkorporere AR vej og lipid metabolisme (tabel S2).
Germ cellemarkører AP-2α og AP-2γ er top beriget motiver i TCAM-2, mens embryonale stamceller celle specifikke motiver SOX2 /OCT4 /TCF /NANOG er beriget i begge cellelinier.
Markant beriget motiver blev identificeret for hver cellelinje og histon-mærket (HOMER værktøj, se Methods). Der var stærk overlapning mellem de top-rangerede berigede motiver i NCCIT og TCAM-2. Dette var tilfældet for begge aktiverende markører. For eksempel til H3K4me3 toppen beriget motiv var MAZ for både TCAM-2 og NCCIT, en transskriptionsfaktor forbundet med MYC (binder til to steder i sin promotor) og vides at være involveret i transkriptionsinitiering og afslutning [49] ( Figur 2A, B;. tabel S3)
Alle motiver var signifikant beriget i mål i løbet af baggrunden sekvenser (p 0,01). Fold berigelse er angivet i forhold til baggrunden. (A, B) Top ranking motiver i begge cellelinier viste stærk overlapning (top 10). (C, D) Motiver, der afveg stærkt mellem cellelinierne, hvad angår deres berigelser blev udvalgt. Et motiv blev vurderet positivt, hvis dens placering var høj (≤20) for én cellelinje og lav for den anden cellelinje (eller var fraværende i den anden liste over berigede motiver). Score: Forskellen i ranking blev vurderet baseret på forskellen i relativ position på listen (
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.