PLoS ONE: inhibitoriske virkninger af Salinomycin på Cell Survival, Colony Vækst, migration og invasion for Human Ikke-småcellet lungekræft A549 og LNM35: Inddragelse af NAG-1

Abstrakt

En stor udfordring for onkologer og farmakologer er at udvikle mere potente og mindre giftige stoffer, der vil mindske tumorvækst og forbedre overlevelse lungecancerpatienter. Salinomycin er en polyether antibiotika anvendes til at dræbe grampositive bakterier, herunder mycobakterier, protozoer, såsom Plasmodium falciparum, og parasitterne ansvarlige for fjerkræsygdom coccidiose. Denne gamle middel er nu en alvorlig anti-cancer lægemiddelkandidat, der selektivt inhiberer væksten af ​​cancer stamceller. Vi undersøgte effekten af ​​salinomycin på overlevelse, koloni vækst, migration og invasion af de differentierede humane ikke-småcellet lungekræft linjer LNM35 og A549. Salinomycin forårsagede koncentrations- og tidsafhængig reduktion i levedygtighed LNM35 og A549-celler gennem en caspase 3/7-associerede celledød pathway. Tilsvarende salinomycin (2,5-5 uM i 7 dage) faldt betydeligt væksten af ​​LNM35 og A549 kolonier i blød agar. Metastase er den vigtigste dødsårsag relateret til lungekræft. I denne sammenhæng salinomycin inducerede en tids- og koncentrationsafhængig inhibering af cellemigration og invasion. Vi demonstrerede også for første gang, at salinomycin inducerede en markant stigning i ekspression af det pro-apoptotiske protein NAG-1 fører til inhibition af lungecancer celleinvasion men ikke celleoverlevelse. Disse fund identificerer salinomycin som et lovende hidtil ukendt terapeutisk middel til lungecancer

Henvisning:. Arafat K, Iratni R, Takahashi T, Parekh K, Al Dhaheri Y, Adrian TE et al. (2013) inhiberende virkninger af Salinomycin på Cell Survival, Colony Vækst, migration og invasion for Human Ikke-småcellet lungekræft A549 og LNM35: Inddragelse af NAG-1. PLoS ONE 8 (6): e66931. doi: 10,1371 /journal.pone.0066931

Redaktør: Ramon Andrade de Mello, University of Porto, Portugal

Modtaget: 16. december 2012; Accepteret: 11 maj 2013; Udgivet den 21. juni, 2013 |

Copyright: © 2013 Arafat et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Terry Fox fond for Cancer Research (SA og TA) og dels af UAEU-Grundforskningsfond fond til SA. De finansieringsorganer havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er den mest almindelige form for kræft med en af ​​de højeste dødelighed i verden. De kemoterapeutiske midler i øjeblikket i brug for lungekræft er utilfredsstillende på grund af associeret manglende effekt, lægemiddelresistens, og co-lateral toksicitet. Målrettede behandlinger for udvalgte undergrupper af patienter udgør en bemærkelsesværdige fremskridt i behandlingen af ​​lungecancer. Men mere end 50% af lungecancere ikke nogen specifik genetisk profil og er således ikke gode kandidater til målrettet terapi. På trods af disse fremskridt kan de nuværende behandlinger af lungekræft forlænge livet ved måneder, men ikke helbrede [1] sygdom; [2]; [3].

salinomycin er en polyether-antibiotikum anvendes til at dræbe grampositive bakterier, herunder mycobakterier, protazoans såsom Plasmodium falciparum, og parasitterne ansvarlige for fjerkræsygdom coccidiose. Det er også almindeligt gives til drøvtyggere til forbedring optagelse af næringsstoffer og fodereffektivitet [4]; [5]. Denne gamle middel er nu en alvorlig anti-cancer lægemiddelkandidat [6]; [7]. For det første er det blevet vist, at salinomycin selektivt inhiberer brysttumor stamceller, hvilket antyder, at det kan bruges som et anticancerlægemiddel [8]. Salinomycin blev også identificeret som en selektiv inhibitor af leukæmi stamceller, osteosarkom stamceller samt kræft i bugspytkirtlen stamceller [9]; [10]; [11].

Det er blevet rapporteret, at en række cancer behandlinger, såsom gamma-bestråling, cytotoksiske lægemidler, NSAID’er, markant øge ekspressionsniveauet af NSAID-aktiverede gen NAG-1 [12]. NAG-1, også kendt som makrofag-inhibitorisk cytokin (MIC-1), og vækst og differentiering faktor-15 (GDF-15), er et medlem af transformerende vækstfaktor beta (TGF-β) super-familien, som kan mediere apoptose induceret af non-steroide anti-inflammatoriske lægemidler i celler som ikke udtrykker cyclooxygenase [13]; [14]. Generelt NAG-1 virker som en tumor suppressor protein ved at hæmme tumorvækst og inducere apoptose i de tidlige stadier af cancer og viser flere undersøgelser NAG1 induktion blive associeret med cellecyklus og apoptose [15].

aktuelle undersøgelse undersøge virkningen af ​​salinomycin på overlevelse, koloni vækst, migration og invasion af differentierede humane ikke-småcellet lungekræft celler LNM35 og A549 og den potentielle konsekvenser af NAG-1 i disse effekter.

Materialer og Metoder

Cell kultur og reagenser

Menneskelig lunge kræftceller LNM35 [16] og A549 blev opretholdt i RPMI 1640 (Invitrogen, Paisley, UK). Alle medier blev suppleret med antibiotika (penicillin 50 U /ml; streptomycin 50 ug /ml) (Invitrogen, Cergy Pontoise, Frankrig) og med 10% føtalt bovint serum (FBS, Biowest, Nouaille, Frankrig). Salinomycin blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (Sigma-Aldrich, Saint-Quentin Fallavier, Frankrig).

Cellelevedygtighed

Celler blev podet ved en densitet på 5000 celler /brønd i 96-brønds plader . Efter 24 timer blev celler behandlet i yderligere 24 og 48 timer med forskellige koncentrationer af salinomycin (0,1-50 uM) i tre eksemplarer. Kontrolkulturer blev behandlet med 0,1% DMSO (lægemidlet køretøjet). Virkningen af ​​salinomycin på cellelevedygtighed blev bestemt ved anvendelse af CellTiter-Glo Luminescent Cell Levedygtighed assay (Promega Corporation, Madison, USA) baseret på kvantificering af ATP, som angiver tilstedeværelsen af ​​metabolisk aktive celler. Det luminescerende signal blev målt under anvendelse af GLOMAX Luminometer systemet. Data blev præsenteret som proportional levedygtighed (%) ved sammenligning af salinomycin-behandlede celler med DMSO-behandlede celler, levedygtigheden af, som antages at være 100%.

Caspase 3/7 aktivitet

celler blev podet ved densiteten på 5.000 celler /brønd i 96-brønds plade og behandlet med salinomycin (10 og 50 uM) i 24 timer, i tre eksemplarer. Kontrolceller blev eksponeret for DMSO ved en koncentration ækvivalent med den for de salinomycin-behandlede celler (0,1% DMSO). Caspase-3/7-aktivitet blev målt ved anvendelse af et luminescens caspase-Glo 3/7 assay kit ifølge producentens instruktioner (Promega Corporation, Madison, USA). Caspase-reagens blev tilsat, og pladen blev blandet og inkuberet i 2,5 timer ved stuetemperatur. Luminescens blev målt ved anvendelse af et GLOMAX Luminometer system.

Soft-agar kolonivækst assay

Et lag af agar indeholdende 1 ml 2,4% lavtsmeltende temperatur Noble agar opløst i destilleret vand blev hældt i brønde af en 6-brønds celledyrkningsskål og henstå ved 4 ° C i 5 minutter og derefter inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. Et andet lag (2,9 ml) indeholdende 0,3% af lavtsmeltende Noble agar opløst i dyrkningsmedier indeholdende celler (5 x 10

3 celler /ml) anbringes oven på det første lag og henstå ved 4 ° C i 5 minutter derefter overføre dem til den fugtig inkubator ved 37 ° C i 30 minutter til 1 time. Vækstmedium (2 ml) blev tilsat oven på det andet lag, og cellerne blev inkuberet i en fugtig inkubator ved 37 ° C i 14 dage og derefter behandlet i yderligere 7 dage med salinomycin (2,5 og 5 uM). Kontrolceller blev eksponeret for 0,1% DMSO. Mediet blev skiftet to gange om ugen. Ved slutningen af ​​forsøget blev kolonier farvedes i 1 time med 2% Giemsa farve og inkuberet med PBS natten over for at fjerne overskydende Giemsa farve. Kolonierne blev fotograferet og afsluttet. Data blev præsenteret som proportionale kolonier (%) ved at sammenligne de salinomycin-behandlede kolonier med DMSO-behandlede kolonier, kolonierne som antages at være 100%.

sårheling motilitet assay

LNM35 og A549-celler blev dyrket i seks-brønds vævskulturskåle indtil sammenflydende. Kulturer blev inkuberet i 10 min med Moscona puffer. En skraber blev foretaget gennem konfluent monolag med en plastik pipette spids af 1 mm i diameter. Bagefter blev skålene vasket to gange og inkuberet ved 37 ° C i frisk RPMI indeholdende 10% føtalt kalveserum i nærvær eller fravær af de ikke-toksiske koncentrationer af salinomycin (0,1-0,5 uM) for A549 og salinomycin (0,05-0,1 uM ) for LNM35 celler. Kontrolceller blev eksponeret for 0,1% DMSO. Ved undersiden af ​​hver skål blev to vilkårlige steder markeret hvor bredden af ​​såret blev målt med et inverteret mikroskop (objektiv x 4). Motilitet blev udtrykt som middelværdien ± SEM af forskellen mellem målingerne ved 0, 6, 24 og 30 timer efter sår.

Matrigel invasion assay

invasiv af lungekræft celler LNM35 behandlet med salinomycin (0,05-0,1 uM) og A549-celler behandlet med salinomycin (0,1-0,5 um) blev testet under anvendelse af BD Matrigel invasion Chambers (8 um porestørrelse, BD Biosciences, Le Pont de Claix, Frankrig) ifølge producentens protokol. Kort beskrevet blev celler (1 x 10

5 celler i 0,5 ml medium og den angivne koncentration af salinomycin) blev podet i de øvre kamre i systemet, de nederste brønde i systemet blev fyldt med RPMI suppleret med 10% føtalt bovint serum som kemo-tiltrækningsstof og derefter inkuberet ved 37 ° C i 24 timer. Kontrolceller blev eksponeret for 0,1% DMSO. Ikke-penetrerende celler blev fjernet fra den øvre overflade af filteret med en vatpind. Celler, der er migreret gennem Matrigel blev fikseret med 4% formaldehyd, farvet med DAPI og tælles i 25 tilfældige felter under et mikroskop. Assayet blev udført in duplo og gentaget tre gange til kvantitativ analyse. Data blev præsenteret som proportional invasivitet (%) ved sammenligning af salinomycin-behandlede celler med DMSO-behandlede celler, invasionen af ​​som antages at være 100%.

PCR amplifikation for NAG-1-mRNA

Isolering af totalt RNA fra celler blev udført under anvendelse af en Maxwell 16 Research System (Promega) med en total RNA-oprensningskit (Promega) ifølge producentens instruktioner. Koncentrationen og renheden af ​​RNA-prøver blev bestemt ved at måle absorbansen ved 260 nm (A260), og forholdet mellem absorbansen ved 260 nm og 280 nm (ND-1000, NanoDrop Technologies Inc, Wilmington, DE, USA).

Gene Expression analyse blev udført under anvendelse af to trin RT-PCR-reaktion. Først Totalt RNA blev omdannet til cDNA under anvendelse af en høj kapacitet cDNA Reverse Transcription Kit (Life Technologies, Integrerede Gulf Biosystems, Dubai, UAE # 4.374.966) i en endelig koncentration på 50 ng RNA i en 20 pi PCR-reaktion med 10 × RT Buffer 2.0 pi , 25 × dNTP Mix (100 mM) 0,8 pi, 10 × RT vilkårlige primere 2,0 pi, MultiScribe ™ revers transkriptase 1,0 pi, RNase-inhibitor 1,0 pi, Nuclease-free water 3.2 pi. Revers transkription blev udført på en Veriti termocykler (Life Technologies) under anvendelse af følgende parametre: 25 ° C i 10 minutter, 37 ° C i 120 min, og 85 ° C i 5 minutter. Kvantitativ realtids-PCR-assay for genet af interesse blev udført tre gange på en Fast ABI Prism 7900HT Detektionssekvensen systemet (Life Technologies) under anvendelse af en foruddefineret Taqman genekspression assay for NAG-1 (GDF15 Life Technologies # Hs00171132_m1) og den humane Hypoxanthin phosphoribosyltransferase (Hprt1 rRNA) som den endogene kontrol (Life Technologies # 4326321E). Fra den fortyndede cDNA, blev 4 pi (20 ng), der anvendes som en skabelon i en 10 pi singleplex PCR reaktion indeholdende 2X TaqMan ® Hurtig Universal PCR Master Mix, nr AmpErase ® UNG (5 pi) (Life Technologies # 4.352.042), 20 × TaqMan® Gene Expression Assay (0,5 pi), RNase-frit vand 0,5 pi. PCR termisk cyklisering parametre blev kørt i Fast tilstand som følger 50 ° C i 2 minutter, 95 ° C i 20 s efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 1 s og 60 ° C i 20 s. Resultaterne blev oprindeligt analyseret med ABI Prism 7900HT SDS program v2, 4, blev alle resterende beregninger og statistisk analyse udført af SDS RQ manager 1.1,4 software ved hjælp af 2-ΔΔCt metoden med en relativ kvantificering RQmin /RQmax tillid sat til 95%

Ekspression af det pro-apoptotiske protein NAG-1

LNM35 og A549-celler blev podet i 100 mm skåle ved 3 × 10

6 celler /skål i 24 timer og med stigende koncentrationer af salinomycin (1-50 uM) i yderligere 24 timer. Kontrolceller blev eksponeret for 0,1% DMSO. Samlede mængde celleproteiner blev isoleret under anvendelse af RIPA-puffer (25 mM Tris.HCl pH 7,6, 1% nonidet P-40, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% SDS, 0,5% proteaseinhibitorcocktail, 1% PMSF, 1% phosphatase inhibitor cocktail) fra kontrol og behandlede celler. Hele Cellelysatet blev udvundet ved centrifugering ved 14.000 rpm i 20 minutter ved 4 ° C for at fjerne uopløseligt materiale og 30 ug af proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE-gel for NAG-1 ekspression (Cellular Signaling Technology, MA, USA). Efter elektroforese blev proteinerne overført på en nitrocellulosemembran, blokeredes med 5% fedtfri mælk og probet med NAG-1 (1:200) og β-actin (1:1000) antistoffer natten over ved 4 ° C. Blottet blev vasket, udsat for sekundære antistoffer og visualiseret ved hjælp af ECL-systemet (Pierce).

Etablering af stabil NAG-1 lyddæmpning i lungekræft celler og dens indvirkning på hæmning af cellernes levedygtighed og invasion induceret af salinomycin

A549-celler blev podet ved en densitet på 20.000 celler /brønd i 96-brønds plader i nærvær af serum og tillades at binde i 24 timer. Celler blev transficeret med tre forskellige udformninger af SMARTvector 2,0 Lentiviral shRNA partikler målrettet NAG-1 eller SMARTvector 2.0 Ikke-Targeting kontrol partikler (Dharmacon Thermo Scientific, USA), der indeholdt en puromycin-resistensgen til selektion og GFP til identifikation af positive kloner og puljer af kloner. Selektion af celler, der stabilt udtrykker NAG-1 shRNA og Control shRNA startede 72 timer efter transfektion ved at følge producentens instruktioner (Dharmacon Thermo Scientific, USA). Kort fortalt blev vækstmediet aspireret fra cellerne og erstattet med frisk selektionsmedium indeholdende 10 ug /ml puromycin. Puromycin medium blev erstattet hver 2-3days med frisklavet udvælgelse medium, og selektion af stabile celler, der udtrykker NAG1-shRNA eller Kontrol shRNA blev afsluttet i ca 4 uger fra påbegyndelse af selektion. Flere kloner og puljer af kloner blev ekspanderet, og GFP-positive puljer af kloner blev analyseret ved anvendelse af western-blot at undersøge ekspressionen af ​​NAG-1 efter behandling med salinomycin 5 uM. Dernæst undersøger vi invasiv og levedygtigheden af ​​A549 celler, der udtrykker NAG1-shRNA eller Kontrol shRNA som reaktion på salinomycin.

Statistik

Resultater blev udtrykt som gennemsnit ± S.E.M. af antallet af forsøg. Forskellen mellem eksperimentelle og kontrolværdier blev bedømt ved ANOVA efterfulgt af Dunnetts post-hoc multiple sammenligningstest. P 0,05 indikerer en signifikant forskel

Resultater

Salinomycin hæmmer lungekræft cellernes levedygtighed

Eksponering af LNM35 (figur 1A.) Og A549 (figur 1B.) Celler til. salinomycin koncentrationer (0,1-50 uM) i 24 eller 48 timer faldt cellelevedygtighed i koncentrations- og tidsafhængig måde. IC

50 koncentrationer ved 24 timer var i området fra 5 til 10 pM salinomycin for begge cellelinier. Efter 48 timer behandling, IC

50 koncentrationer faldt til området fra 1,5 til 2,5 uM salinomycin med 90% hæmning af cellelevedygtighed i begge celler i en koncentration på 50 uM.

Eksponentielt voksende LNM35 (A , c) og A549 (B, D) -celler blev behandlet med vehikel (0,1% DMSO) eller de angivne koncentrationer af salinomycin. Det venstre panel repræsenterer 24 timers udsættelse, mens det højre panel repræsenterer 48 timers udsættelse. Levedygtige celler blev analyseret som beskrevet i Materialer og Metoder. Induktion af caspase-3/7-aktivitet blev analyseret i LNM35 (E) og A549 (F) celler behandlet i 24 timer med salinomycin (10 og 50 uM), normaliseret til antallet af levedygtige celler per brønd og udtrykt som gange induktion sammenlignet med kontrolgruppen. Alle forsøg blev gentaget mindst tre gange. * Signifikant forskellig ved P 0,05, ** Signifikant forskellig ved P 0,01, *** Signifikant forskellig ved P . 0.001

Aktivering af caspase-3/7 er afgørende i apoptotisk celledød veje og blev analyseret i LNM35 og A549-celler behandlet i 24 timer med salinomycin (10-50 uM), og normaliseret til antallet af celler pr. Caspase 3/7 aktivitet steget med mere end 17 gange i LNM35 celler (figur. 1C) og 12 gange i A549-celler (figur. 1D), efter udsættelse for salinomycin 50 uM. Dette indikerer, at salinomycin inducere celledød via en caspase 3/7-associerede vej.

Salinomycin svækker koloni vækst i blød agar

Salinomycin stærkt hæmmet LNM35 (figur. 2A, 2C) og A549 ( Figur. 2B, 2D) kolonivækst i blød-agar i en koncentrationsafhængig måde.

LNM35 (a) og A549 (B) celler blev dyrket ved en densitet på 5000 celler /brønd i blød agar medium ind 6-brønds plader. Efter 14 dage blev dannede kolonier behandlet i 7 dage med forskellige koncentrationer af salinomycin (2,5 og 5 uM). Ved de endelige kolonier blev farvet med Giemsa og scorede. Repræsentative billeder af kolonierne dannet i blød agar fra LNM35 (C) og A549 (D) blev fotograferet.

Salinomycin svækker lungekræft celle migration og invasion

lungekræftpatienter er på høj risiko for udvikling af metastase, begyndende med cellemigrering i den primære tumor, hvilket fører til lokal vævsinvasion og ibrugtagning lymfe eller blodkar og endelig kolonisering af fjerntliggende organer. Evnen af ​​salinomycin at reducere den cellulære migration blev undersøgt ved anvendelse af sårheling model. Salinomycin reducerede cellulære migration af LNM35 (fig. 3A) og A549 (figur. 3B) celler i en koncentrations- og tidsafhængig måde. Tilsvarende salinomycin Hæmmede invasionen af ​​LNM35 (fig. 3C) og A549 (fig. 3D) celler i matrigel invasion assay. Salinomycin inhibering af den cellulære migration og matrigel invasion sket uden signifikant reduktion af cellelevedygtighed (figur. 1).

Sårene blev indført i LNM35 (A) og A549 (B) sammenflydende monolag dyrket i nærvær eller fravær (kontrol) af salinomycin (0,05-0,5 uM). Den gennemsnitlige afstand, at celler rejste fra kanten af ​​den skrabede areal til 6, 24 og 30 timer ved 37 ° C blev målt i et blindet måde, under anvendelse af et omvendt mikroskop. C) LNM35 celler blev inkuberet i 24 timer i nærvær eller fravær af salinomycin (0,05-0,1 uM). D) A549-celler blev inkuberet i 24 timer i nærvær eller fravær af salinomycin (0,1-0,5 uM). Celler, som invaderet i Matrigel blev bedømt som beskrevet i Materialer og Metoder.

salinomycin inducerer NAG-1-mRNA og proteinekspression

Først blev A549-celler udsat for forskellige koncentrationer af salinomycin ( 0,5-10 uM) i 2 og 24 timer total RNA blev ekstraheret og vurderet for NAG-1-mRNA-ekspression. Som vist i figur 4A, salinomycin inducerer en markant tids- og koncentrationsafhængig induktion af NAG-1-mRNA-ekspression med en ti gange stigning blev opnået på 24 timer efter udsættelse for 10 uM salinomycin (fig. 4A). Dernæst blev LNM35 og A549-celler udsat for forskellige koncentrationer af salinomycin (1-50 uM) i 24 timer og totale proteiner blev bedømt for NAG-1-ekspression. I begge LNM35 og A549-celler, salinomycin inducerer en markant koncentrationsafhængig induktion af NAG-1-protein-ekspression (fig. 4B). Salg

Celler blev eksponeret for forskellige koncentrationer af salinomycin, og totalt RNA blev ekstraheret efter 2 og 24 timer og analyseret for NAG-1 mRNA-ekspression i A549-celler (A), og efter 24 timer til proteinekspression i både A549 og LNM35 celler (B).

NAG-1 lyddæmpning ophæver anti invasiv virkning af salinomycin

Som vist i figur 5A, inaktivering af NAG-1 (NAG-1-shRNA1) vendt induktionen af ​​NAG-1-protein-ekspression efter behandling med 5 uM salinomycin. Lignende resultater blev opnået med de to andre udformninger af shRNA (NAG-1-shRNA2 og NAG-1-shRNA3) (data ikke vist). Selektiviteten af ​​denne lyddæmpning blev bekræftet af det faktum, at ingen indvirkning på NAG-1-protein-ekspression blev observeret i celler transficeret med shRNA kontrol partikler (kontrol-shRNA) i sammenligning med de ikke-transficerede celler. Inaktivering af NAG-1 induktion under anvendelse af tre forskellige udformninger af NAG-1-shRNA (1, 2 og 3) ikke at falde evne salinomycin til induceret A549 celledød (figur 5B), men helt omvendte anti-invasiv virkning salinomycin (figur 5C). Tilsammen disse resultater antyder kraftigt, at NAG-1 medierer anti-invasive, men ikke celledød virkning salinomycin.

Silencing af NAG-1 undertrykte forøget ekspression af NAG-1 induceret af salinomycin (A ) uden virkning på inhibering af A549 cellelevedygtighed induceret af salinomycin (B), der fører til fuldstændig undertrykkelse af anti-invasiv potentiale salinomycin (C).

Discussion

Lungekræft er den mest almindelige form for kræft i hele verden og har også den højeste dødelighed. Der var 1.61 millioner tilfælde af lungekræft (12,7% af den samlede kræft byrde) i 2008 med 1,38 millioner dødsfald (18,2% af alle kræftdødsfald) i samme år [17]. Desværre, på trods fremskridt inden for molekylærbiologi for lungekræft, forbedret diagnosticering og selv de optimale målrettede terapier, de nuværende protokoller til behandling af lungekræft stadig utilstrækkelige til at producere klare og vedvarende kliniske fordele og helbredelse af lungecancerpatienter forbliver resultatløs. Patienter ofte udvikle resistens over for de nuværende målrettede terapi medicin, og disse stoffer er også meget dyrt og ikke tilgængelig for flertallet af patienter med lungecancer i verden [18].

I den foreliggende undersøgelse, undersøgte vi virkningen af salinomycin på to differentierede humane ikke-små lunge kræftceller (LNM35 og A549) overlevelse, koloni vækst, migration og invasion og den potentielle rolle NAG-1 i de potentielle anti-cancer effekter af salinomycin.

salinomycin ( 0,1-50 uM) faldt levedygtighed LNM35 og A549 differentierede celler i en koncentrations-, tidsafhængig og caspase-associeret måde. Disse resultater er på linje med tidligere offentliggjorte resultater, der viser, at lave koncentrationer af salinomycin inhibere levedygtighed brystcancer stamceller, leukæmi stamceller, osteosarcom stamceller, såvel som pancreas cancer stamceller [8]; [9]; [10]; [11]. Under udarbejdelsen af ​​denne undersøgelse, viste en anden gruppe anticancer aktiviteter salinomycin

in vitro

mod stamcelle delpopulation i A549 celler [19]. For at bekræfte denne anticancervirkning af salinomycin, undersøgte vi dens effekt på væksten af ​​etablerede kolonier. Vi viste, at syv dages behandling med lav koncentration af salinomycin stærkt hæmmet LNM35 og A549 kolonivækst i blød agar. Disse resultater

in vitro

er i overensstemmelse med andre undersøgelser, der viser, at salinomycin hæmmer brystkræft, osteosarkom, kræft i bugspytkirtlen, samt hepatocellulært carcinom vækst i mus [8]; [10]; [11]; [20]. De doser af salinomycin anvendes i disse

in vivo

studier var mellem 4 og 8 mg /kg /IP, der er lavere end den LD

50 dosis salinomycin som var 18 mg /kg intraperitonealt og 50 mg /kg oralt [4]. Alt sammen tyder på, at salinomycin kan være en gyldig og sikker anti-cancer middel og yderligere undersøgelser vil fastslå virkningen af ​​lav dosis af salinomycin på LNM35 og A549 tumorvækst

in vivo

i nøgne mus.

i den aktuelle undersøgelse, kun den højeste koncentration af salinomycin (50 uM) var i stand til at inducere en aktivering af caspase 3/7 fører til celledød i både lungecancerceller LNM35 og A549. Disse resultater er i overensstemmelse med vores nyligt offentliggjorte arbejde viser, at høj koncentration af salinomycin (50 uM) inducerede en aktivering caspase 3/7 og PARP spaltning fører til apoptose af bryst kræftceller MDA-MB-231 [21]. begge undersøgelser af lungecancerceller og den tidligere publicerede undersøgelse om brystcancerceller viser imidlertid, at lave koncentrationer af salinomycin (≤10 uM) resulterede mere i inhibering af celleproliferation i stedet celledød [21]. Ligeledes er det blevet vist, at salinomycin inhiberer proliferation og incudes apoptose af humant hepatocellulært carcinom [20].

Cancer progression er forbundet med ophævelse af de normale kontroller, der begrænser cellemigration og invasion, i sidste ende fører til metastase. Da metastaser er den hyppigste dødsårsag hos cancerpatienter, udvikling af nye behandlingsmetoder, der reducerer invasion og metastase er meget vigtigt for cancerterapi. I denne sammenhæng har vi demonstreret, at salinomycin inducerede en stærkt signifikant tids- og koncentrationsafhængig inhibering af cellemigration og invasion

in vitro

af de to differentierede lungekræft cellelinier LNM35 og A549. Disse resultater er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at salinomycin hæmmer selektivt brystkræft stamceller metastaser

in vivo

[8] og prostatakræft celle migration

in vitro

[22].

anti-cancer molekylære virkningsmekanisme af salinomycin er undersøgt i flere undersøgelser. I denne sammenhæng er det blevet vist, at salinomycin er et effektivt middel mod cancer, som inducerede apoptose i humane cancerceller er uafhængige af aktivering tumorsuppressorprotein p53 og caspaser [9]. Disse resultater er i overensstemmelse med vores nylige undersøgelse, der viser, at salinomycin signifikant nedsat levedygtighed af vildtype-p53 MCF-7 og T47D samt mutant p53 MDA-MB-231 og T47D humane brystcancercellelinier i tids- og koncentrationsafhængig manerer [21]. Det blev også vist, at salinomycin udløser apoptose af PC3-prostatacancerceller ved at løfte det intracellulære ROS niveau, der fører til translokation af Bax protein til mitokondrier, cytochrom c-frigivelse, aktivering af caspase-3, og spaltning af PARP [23]. Salinomycin inducerer også caspase afhængig celle-død i RKO, SW480 og SW620-kolon kræftceller [24]. Det er også blevet påvist, at salinomycin er en effektiv inhibitor af osteosarcom stamceller samt lymfatisk leukæmiceller delvist gennem nedregulering af Wnt /μ-catenin selvfornyelse pathway [10]; [20]; [25]. En anden undersøgelse viste, at salinomycin hæmmede prostatakræft cellevækst ved at reducere aldehyd dehydrogenase og nukleare faktor-μB aktiviteter [22]. Ligeledes er det blevet vist, at salinomycin hæmmer Akt /NF-KB-vejen, der fører til apoptose i cisplatin-resistente ovariecancerceller [26]. Det er også blevet påvist, at salinomycin inducerer autophagy i kolon og brystkræft celler [24]. Øget fosforylering af DNA skader-relaterede proteiner (fx pH2AX, p53BP1, pBRCA1, pChk1) proteiner indikerer større DNA brud og skader [27]. Salinomycin øger DNA streng brud og inducerer fosforylering af DNA-skader-relateret protein, H2AX [28].

NSAID-aktiverede gen (NAG-1, GDF-15, og MIC-1) induceres af flere apoptose-inducerende midler i colon, prostata og lunge cancerceller [15] [29]. NAG-1 var involveret i den synergistiske induktion af apoptose ved kombineret behandling af natriumsalicylat og PI3K /MEK1 /2-inhibitorer i A549 human lunge-adenocarcinom-celler [30]. NAG-1 ekspressionsniveauer væsentlig forøgelse i cancerceller, serum og /eller cerebrospinalvæske under progressionen af ​​menneskets forskellige aggressive cancere, såsom intrakranielle hjernesvulster, melanom, gastrointestinal, pancreas, colorektal, prostata, bryst og lunge epiteliale cancere . Af klinisk interesse, har en forbedret NAG-1-ekspression er blevet positivt korreleret med dårlig prognose og patient overlevelse [29]; [30]; [31]; [32].

Vi hypotese, at NAG-1 er involveret i anti-cancer effekter af salinomycin og vi viste for første gang, at salinomycin inducerede en klar tids- og koncentrationsafhængig induktion af NAG-1-ekspression . Vi har også tydeligt vist, at NAG-1 bidrager til inhibering af lungecancer celleinvasion men ikke til induktion af celledød, medieret af salinomycin. I modsætning hertil er det blevet rapporteret, at NAG-1-ekspression var forbundet med en mere invasiv mavekræft cellelinje fænotype og kunne forårsage øget gastrisk kræft celle invasion

in vitro

[33].

Det er blevet påvist, at salinomycin effektivisering af gemcitabin at udrydde pancreascancer [11]. Salinomycin sensibiliserer også brystcancerceller til virkningerne af doxorubicin og etoposid behandling ved at øge DNA-beskadigelse [28]. I samme forbindelse, kombinationsterapien af ​​octreotid modificeret paclitaxel aktive målretning miceller og salinomycin passive målretning miceller forbedre behandlingen af ​​brystcancer gennem udryddelse af brystcancerceller sammen med brystcancer stamceller [34]. Tilsvarende kombinationsterapi med trastuzumab og salinomycin var bedre end enkelt behandling med hvert medikament til behandling af HER2-positive brystcancerceller samt brystcancer stamceller [35]. Vi har for nylig rapporteret

in vitro

, at salinomycin var også i stand til at forstærke anticancer effekter af 4-hydroxytamoxifen og frondoside A på brystkræftceller MCF-7 og MDA-MB-231 henholdsvis [21]. Med udgangspunkt i disse førnævnte resultater, og at vide fra kliniske forsøg, at behandlinger enkelt agent sjældent resultere i kliniske fordele for kræftpatienter, og at kombinationsbehandlinger er i sædvanlig nødvendige for effektiv behandling af tumorer, undersøgte vi den terapeutiske fordel af en kombination af cisplatin, (en første linje terapeutisk for lungekræft), med salinomycin i både LNM35 og A549 celler. Desværre, fandt vi, at cisplatin ikke var i stand til at forbedre inhiberingen af ​​lungetumor cellelevedygtighed induceret af salinomycin (Attoub et al, upublicerede data).

Den nuværende manglen afslører salinomycin som et lovende hidtil ukendt terapeutisk middel, ikke blot for udtømningen af ​​cancer stamceller, men også for de differentierede lungetumorer

tak

Vi takker Dr. Katarina Hostanska fra Institute for komplementær medicin.; Universitetshospital Zürich, Schweiz for at levere A549 celler.