PLoS ONE: Aktivering af c-myc og cyclin D1 ved JCV T-antigen og β-Catenin i Colon Cancer

Abstrakt

I det sidste årti, montering beviser har impliceret den menneskelige neurotropisk virus JC virus i patologi for tyktarmskræft. Men mekanismerne af JC-virus-medieret onkogenese stadig ikke er fuldstændig bestemt. En kandidat til at mediere disse effekter er det virale tidlige transkriptionelle produkt T-antigen, som har evnen til at inaktivere regulerende proteiner såsom p53. I medulloblastomer, har T-antigen blevet vist at binde Wnt signalvejen protein β-catenin; Virkningerne af denne interaktion på nedstrøms regulerende proteiner fortsat ukendt. I lyset af disse bemærkninger, vi undersøgt sammenhængen mellem T-antigen og nuklear β-catenin i Colon kræfttilfælde og virkningerne af dette kompleks i aktivering af transskription og cellecyklus regulatorer c-myc og cyclin D1

in vitro

. Gene forstærkning viste tilstedeværelsen af ​​virale sekvenser i 82,4% af tilfældene, og vi opdaget udtryk for T-antigen i 64,6% af tilfældene ved immunhistokemi. Endvidere fandt vi, at T-antigen og β-catenin co-lokaliseret i kernerne i tumorceller og vi bekræftede den fysiske binding mellem disse to proteiner

in vitro

. Den nukleare forekomsten af ​​T-antigen og β-catenin resulterede i signifikant forøgelse af TCF-afhængig promotoraktivitet og aktivering af β-catenin downstream mål, c-Myc og cyclin D1. Disse observationer giver yderligere bevis for en rolle JCV T-antigen i dysregulering af Wnt signalvejen og i patogenesen af ​​tyktarmskræft

Henvisning:. Ripple MJ, Parker Struckhoff A, Trillo-Tinoco J, Li L, Margolin DA, McGoey R, et al. (2014) Aktivering af c-Myc og cyclin D1 af JCV T-antigen og β-Catenin i Colon Cancer. PLoS ONE 9 (9): e106257. doi: 10,1371 /journal.pone.0106257

Redaktør: Shao-Jun Tang, University of Texas Medical Branch, USA

Modtaget: May 10, 2014; Accepteret: 30 Juli 2014; Udgivet: 17 September, 2014

Copyright: © 2014 Ripple et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde var muligt takket at yde P20 RR021970 fra National Institutes of Health, at LDV. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

colorectalt carcinom (CRC) er fortsat et alvorligt sundhedsproblem i hele verden trods af fremskridt i diagnose og behandling. Det rangerer tredje i den samlede forekomsten af ​​kræft og er den anden mest almindelige årsag til dødelighed af kræft i USA, hvor der er en anslået 140.000 nye tilfælde og 50.000 CRC-relaterede dødsfald hvert år [1]. Risikoen for at udvikle sporadisk tyktarmskræft i den almindelige befolkning er 5%, men dette forekomsten stiger med alderen på grund af ophobning af genetiske og epigenetiske ændringer [2]. Nogle af disse ændringer kan være forårsaget af miljømæssige faktorer, herunder virus, der har været impliceret i flere andre former for kræft. Flere uafhængige studier har fastslået, at ca. 20% af alle cancere er forårsaget af infektiøse midler [3], [4]. Et sådant middel er den menneskelige neurotropisk JC virus (JCV), et medlem af

Polyomaviridiae

familie, som også omfatter SV-40, BK-virus (BKV) og den nyopdagede Merkel Cell Polyomavirus (MCPyV), fundet skal klonalt integreret i en høj procentdel af Merkel celle carcinomer. JCV er blevet etableret som den agens af progressiv multifokal leukoencefalopati (PML), en demyeliniserende sygdom, der påvirker HIV-patienter [5], og senere hos patienter i immunmodulerende behandling [6]. I det sidste tiår, har flere laboratorier vist, at JCV er associeret med forskellige humane cancere, herunder hjernetumorer [7], [8], lungecancer [9], og maligniteter af de øvre og nedre fordøjelseskanalen [10] – [12 ].

JCV er en allestedsnærværende virus, der inficerer en stor del af den almindelige befolkning. Ifølge sero-epidemiologisk undersøgelser, primær infektion med JCV opstår i den tidlige barndom og over 70-90% af voksne individer er positive for anti-JCV antistoffer [13], [14]. Selvom primær infektion er asymptomatiske, den foreslåede rute for transmission er via luftvejene, hvorefter JCV etablerer en latent infektion i nyrerne. I cirka 30% af raske seropositive individer, er JCV skur i urinen under normale forhold [15], [16]. Som følge heraf har intakte JCV partikler blevet isoleret fra prøver af rå urbane spildevand fra hele verden [17], [18], som tilsammen med konstateringen af ​​viralt DNA i epitelceller fra den øvre og nedre fordøjelseskanalen [19], foreslår en ekstra indgangssted for virus gennem GI-kanalen via eksponering for forurenet vand eller mad. Vigtigere, Bofill-Mas,

et al

viste, at virale partikler isoleret fra spildevand forblev intakte efter behandling ved et pH på 1 i 30 minutter, hvilket indikerer, at indtagelse af forurenet vand eller fødevarer kan være tilstrækkeligt til JCV infektion i mavetarmkanalen [20]. Mange undersøgelser siden, har vist tilstedeværelsen af ​​JCV genomiske sekvenser og ekspression af T-antigen i væv fra gastrointestinale tumorer, herunder esophageal carcinoma [11], gastrisk karcinom [12], [21], [22], sporadisk adenomatøs polypper [ ,,,0],23], og colorektale adenocarcinomer [10], [24] – [30]

JCV genom er ca. 5,2 kb i størrelse og kan opdeles i tre regioner:. den tidlige virale genomiske region (EVGR), den sene virale genomiske region (LVGR), og den ikke-kodende kontrolregion (NCCR), som indeholder replikationsstartområdet, og er placeret mellem tidlige og sene genomiske regioner. Den EVGR koder for et kraftfuldt onkogent protein, stort T-antigen, mens LVGR koder de virale capsidproteiner VP1, VP2 og VP3, samt Agnoprotein, en lille tilbehør produkt [31]. Den nuværende model for JCV-medieret onkogenese involverer integrationen af ​​dele af JCV-genomet, især T-antigen-gen, der foreslås at øge risikoen for at udvikle kræft som følge af den efterfølgende ekspression af T-antigen. Til støtte for denne model, Theodoropoulos

et al

viste, at JCV virusmængde var 10 til 50- fold højere i kolon adenomer og adenokarcinomer i forhold til matchede normale væv [32]. Derudover Coelho

et al

nylig vist, at CRC væv har en signifikant højere relativ hyppighed af JCV genomiske sekvenser end tilstødende normal slimhinde og fjern normal slimhinde [33].

transformerende evner JCV T -Antigen

in vitro

er velkendte [34].

In vivo

T-antigen forårsager en række centralnervesystemet tumorer, når injiceres ind i hjernen på gnavere og primater, lige fra medulloblastomer til gliale tumorer [35] – [37]. Transgene mus, der udtrykker JCV T-antigenet fra NCCR udvikle tumorer af neuroectodermal oprindelse, herunder medulloblastomer, gliale tumorer og maligne perifere nerve sheath tumorer [38] – [40]. Denne transformation proces sker gennem interaktion mellem T-antigen med centrale regulerende proteiner, herunder p53, Rb, og den centrale signalmolekyle i Wnt signalvejen, β-catenin [41] – [43].

β-catenin ofte dysreguleret i tyktarmskræft [44], [45]. Niveauer af β-catenin er stramt styret af dens ødelæggelse kompleks, der består af proteinerne APC, Axin, GSK3, og CK1, som markerer det for ubiquitinering. Mutationer i komponenterne af ødelæggelse komplekset kan resultere i afvigende kernelokalisering af β-catenin, et veletableret mekanisme af carcinogenese i colorektal cancer [44], [46], som fører til aktivering af Wnt-vejen målgener i fravær af Wnt signalering og resulterer i ukontrolleret cellulær proliferation [2]. Mens Wnt-vejen aktiveres af genetiske mutationer i over 90% af tyktarmskræft tilfælde [47], nuklear β-catenin-ekspression detekteres kun i ca. 50% af tilfældene [48], hvilket antyder, at der er andre faktorer, der bidrager til den nukleare lokalisering af β-catenin i coloncancer. Det er blevet påvist, at JCV T-Antigen har evnen til at binde β-catenin gennem en interaktion med C-terminalen af ​​β-catenin [41], og at T-antigen kan stabilisere β-catenin i glioblastomceller [49]. Desuden T-antigen har en klassisk nukleært lokaliseringssignal (NLS) og udtrykkes stærkt hovedsagelig i kerner af neoplastiske celler [10], [42], [50]. Derfor søgte vi at bestemme virkningen af ​​JCV T-antigen på den nukleare lokalisering af β-catenin og den rolle, dette kompleks i aktiveringen af ​​β-catenin målgener som en mekanisme i udviklingen og progressionen af ​​tyktarmskræft.

i den aktuelle undersøgelse, måler vi forekomsten af ​​T-antigen-genomiske sekvenser og proteinekspression i humane coloncancer væv under anvendelse af en samling af velkarakteriserede biopsiprøver. Vigtigere udviser vi en sammenslutning af T-antigen og nuklear β-catenin i humane coloncancer prøver og uddybe dette associering ved at belyse de molekylære virkninger af denne interaktion i dysregulering af Wnt signalering kaskade og aktiveringen af ​​β-catenin mål ved anvendelse af tyktarmskræft cellelinjer.

Materialer og metoder

kliniske prøver

i alt 113 de-identificerede paraffinindlejrede prøver af kolorektal carcinom og præ-neoplastiske polypper blev indsamlet fra de patologi arkiver følgende institutioner: LSUHSC-New Orleans (34 prøver) og Ochsner Clinic (79 prøver). De tumorer var blev histologisk sorteres og immunhistokemisk karakteriseret ifølge WHO klassifikation af tumorer i mave-tarmkanalen.

DNA ekstraktion og analyse

En dedikeret mikrotom blev brugt til afsnittet paraffinblokke for at undgå forurening. Endvidere blev blokken og bladholderen periodisk autoklaveret, og en ny, engangs klinge blev anvendt til hver prøve. DNA blev ekstraheret fra ca. 10 dele af 10 um i tykkelse fra hver af vævsprøverne ved hjælp af QIAamp Tissue Kit ifølge producentens instruktioner (Qiagen). PCR-amplifikation af T-antigen-genet blev udført under anvendelse af Pep1 og PEP2 primere (nukleotider 4255-4272 og 4408-4427, henholdsvis), som forstærker sekvenser i den N-terminale region af JCV T-antigen (pEP1 sekvens: AGTCTTTAGGGTCTTCTACC; PEP2 sekvensen : AGGTGCCAACCTATGGAACA). Til amplifikation af kontrolområdet (CR), vi brugte NCRR1 og NCRR2 primere svarende til nukleotider 4993-5004 og 258-279, henholdsvis (NCRR1 sekvens: GCAAAAAAGCGAAAAACAAGGG; NCRR2 sekvens: CAGAAGCCTTACGTGACAGCTGG). Amplifikation blev udført på 250 ng af template-DNA med FailSafe PCR-system (Epicentre) i et totalt volumen på 25 pi. PCR blev kørt ved følgende betingelser: denaturering ved 95 ° C i 10 minutter, efterfulgt af 30 cykler af denaturering ved 95 ° C i 15 s, annealing ved 62 ° C i 30 s og ekstension ved 72 ° C i 30 s. Som afslutning trin blev forlængelsen tidspunktet for den sidste cyklus øges til 7 min. Prøver amplificeret i fravær af template-DNA tjente som en negativ kontrol, mens DNA ekstraheret fra T-antigen-positive BSB8 celler blev anvendt som en positiv kontrol for hver procedure. Southern blot blev udført ved at løse 10 pi af hver PCR-reaktion på en 2% agarosegel. Gelen blev derefter behandlet i 15 minutter hver med 0,2 M HCI i depurinering, 1,5 M NaCl /0,5 M NaOH til denaturering, og 1,5 M NaCl /0,5 M Tris-HCI (pH 7,4) til neutralisering, efterfulgt af overførsel af de amplificerede fragmenter fra gelen til nylonmembraner (Hybond-N; Amersham). Membranerne blev derefter præhybridiseret i 1 time i EasyHyb opløsning (Roche), efterfulgt af hybridisering i den samme opløsning indeholdende 2 ug DIG-mærket oligonukleotid specifikt for JCV T-antigen (nucleotiderne 4304-4405) natten over. Primere anvendt til syntese af DIG-mærket probe er PEP INT 1 (TTGGGATCCTGTGTTTTCATC) og PEP INT 2 (AATGGGAATCCTGGTGGAAT). På CR proben udnyttede vi primere fra nucleotiderne 62-81. Prober blev syntetiseret ved hjælp af DIG DNA-mærkning og Detection Kit (Roche). Membraner blev hybridiseret natten, vasket og udviklet ved hjælp af DIG Vask og Block Buffer Set følge producentens instruktioner (Roche).

DNA sekventering af kontrolområdet blev udført under anvendelse ABI Prism 3730x /DNA-analysator. Til amplifikation af DNA fra husholdning gen, GAPDH, blev følgende primere anvendt:.

5 ‘TTC TCC CCATTC CGT CTT CC 3’ og 3 ‘GTA CAT GGT ATT CAC CAC CC 5’

Histologisk og immunhistokemisk analyse

paraffinindstøbt væv tidligere fastsatte i 10% bufferet formalin blev sektioneret ved 4-um tykkelse og monteret på ladede dias. Snit blev anbragt i en ovn ved 65 ° C for at smelte paraffin og derefter afparaffineres i tre skift af xylen i 30 minutter hver. Snit blev derefter rehydreret gennem en gradueret række af alkoholer op til vand, og ikke-enzymatisk antigen hentning blev udført i 0,01 M natriumcitrat (pH 6,0) ved 97 ° C i en vakuumovn i 35 min. Efter en afkølingsperiode på 25 minutter, blev snit skyllet med PBS, og endogen peroxidase blev standset ved at inkubere objektglassene i methanol /3% H

2O

2 i 30 minutter ved stuetemperatur. Snit blev blokeret i 2% hesteserum og inkuberet natten over med primære antistoffer ved stuetemperatur i et fugtigt kammer. Antistoffer der anvendes til påvisning af virale proteiner indeholdt et monoklonalt muse-antistof mod SV40 stort T-antigen, der krydsreagerer med JCV T-antigen (klon pAb416, 1:100 fortynding Calbiochem) og et monoklonalt muse-anti-β-catenin antistof (klon E -5, 1:100 fortynding Santa Cruz Biotechnology). Efter skylning sektionerne i PBS blev objektglassene inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med biotinyleret anti-muse sekundære antistoffer og derefter blev skyllet i PBS. Vævet blev efterfølgende inkuberet med avidin-biotin-peroxidase komplekser i 1 time ved stuetemperatur i overensstemmelse med producentens instruktioner (Vector Laboratories), og endelig blev snittene fremkaldt med et 3,3′-diaminobenzidin-substrat (Sigma), modfarvet med hematoxylin, og dækglas med Permount (Fisher). For at vurdere den del af immunmærket celler i prøver fra hver patient tilfælde mærkningsindeks defineres som procentdelen af ​​positive celler i det samlede antal af tumorceller talt blev bestemt.

Dobbelt-mærkning Immunofluorescens

til immunofluorescens og dobbelt mærkning af paraffin indlejrede sektioner, afparaffinering, antigen-genvinding, endogen peroxidase quenching og blokering blev udført som beskrevet ovenfor. For immunfluorescerende dobbelt mærkning af HCT116 celler i kultur blev cellerne vasket med PBS, fikseret i kold acetone, og blokeret i PBS indeholdende 5% hesteserum og 0,1% BSA i 2 timer. Sektioner eller celler blev derefter inkuberet med muse-anti-T-antigen-antistof (klon pAb416, 1:100 fortynding, Oncogene Science) og kanin-anti-β-catenin antistof (klon D13A1, 1:100 fortynding Cell Signaling) i 16 timer efterfulgt af vask i PBS og inkubation i anti-muse rhodamin-antistof og anti-kanin-Fluorescein-antistof (1:200 fortynding Vector Laboratories). Endelig blev snit vasket i PBS og monteret i vandig montering medier med DAPI (Vector Laboratories) og visualiseres i et konfokalt mikroskop (Olympus FV1000). Salg

transient transfektion og Luciferase-konstruktioner

HCT116 celler blev venligst stillet til rådighed af Dr. Hamid Boulares. Celler blev transficeret ved hjælp Xtreme Gene-HP (Roche). De følgende konstruktioner blev anvendt til luciferaseassays: M72 Super 16x TOPflash reporterkonstruktion: Addgene plasmid 17165; M51 Super 8x FOPflash: Addgene plasmid 12457; c-Myc-promotor: Addgene plasmid 16595; Cyclin D1-promotor: Addgene plasmid 32727. Disse reporterkonstruktioner blev transficeret alene eller sammen med pcDNA-T-antigen og /eller pcDNA-β-catenin og undersøgt for luciferaseaktivitet under anvendelse af et Luciferase Assay System (Promega) ved 24 timer efter transfektion.

protein Extraction, Co-Immunpræcipitation og analyse

cytoplasmisk og nukleare proteinekstrakter fra HCT116 celler blev opsamlet i anvendelse af cytoplasmatisk lysepuffer og lysepuffer nukleart som tidligere beskrevet [51]. Kort beskrevet blev cellerne trypsiniseret, pelleteret ved 2000 g i 5 minutter, og re-suspenderet i 500 ul cytoplasmatiske lysepuffer i 10 minutter på is. Efter lysis af cellemembranen, blev kerner pelleteret ved 14.000 g i 10 minutter. Kerner blev vasket en gang i cytoplasmatisk lysepuffer, pelleteret og lyseret i 250 ul lysepuffer nuklear i 20 minutter ved 4 ° C under omrystning. 500 pg totalt proteinekstrakt blev inkuberet med 10 ug anti-T-antigen eller anti-β-catenin antistof natten over ved 4 ° C under omrystning. Antigen-antistof-komplekser blev derefter immunopræcipiteret med protein A /G magnetiske perler (Pierce), vasket i HNTG buffer (20 mM HEPES, 150 mM NaCl, 10% glycerol, 0,1% Triton X-100), denatureret og analyseret ved SDS-PAGE .

Etik Statement

Denne undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med Louisiana State Universitets Institutional Review Board retningslinjer og godkendelse. Alle 113 paraffinindstøbte prøver menneskelige af kolorektale karcinomer og præneoplastiske polypper, som blev indsamlet fra de patologiske arkiver LSUHSC New Orleans (34 prøver) og Ochsner Clinic (79 prøver). Den Louisiana State University Institutional Review Board (IRB) frafaldes behovet for skriftlige samtykke, som prøverne er arkivering, de-identificeret og følg under NIH retningslinjer for fritagelse som væv, der ville blive kasseret, og kan ikke spores tilbage til patienter (IRB protokol # 8077).

Resultater

Ekspression af T-antigen og β-catenin i tyktarmskræft prøver

Den tidlige transkriptionelle produkt af JCV, T-antigen, er et godt -known potent onkogen protein, som er blevet påvist i en række tumorer. For at fastslå tilstedeværelsen af ​​JCV T-antigen, vi udførte immunhistokemiske eksperimenter i alt 113 formalinfikserede, paraffin indlejrede tilfælde af tyktarmskræft fra 2 af New Orleans største medicinske institutioner. De fleste af disse prøver indeholdt normale slimhinde, præneoplastiske polypper og begge

in situ

og invasive carcinom. Vi fandt ekspression af T-antigen ved immunhistokemi i kernerne i tumorceller i 73 af prøverne (64,6%). Interessant, T-antigen fandtes også i kernerne i epitelceller fra præneoplastiske polypper, men helt fraværende i den normale tyktarmsepitelet (figur 1, venstre paneler).

Immunhistokemi på områder af normale tyktarmsepitel er negativ for T-antigen, mens β-catenin udtrykkes i cytoplasmaet og membranen (Paneler og B). T-antigenekspression findes i kerner af epitelceller i polypper og neoplastiske celler i områder med invasive tumor (panel C og E, henholdsvis). På hinanden følgende sektioner af de samme eksempler viser, at β-catenin nu ligger til cytoplasmaet og kerner af epitel- og tumorceller (Paneler D og F henholdsvis). I T-antigen-negative tilfælde imidlertid β-catenin forbliver i cytoplasmaet (Panels G og H). Statistisk analyse viser, at 67,6% af T-antigen-positive tyktarmskræft tilfælde udtrykker nuklear β-catenin, mens kun 40,4% af T-antigen-negative tilfælde udtrykker nuklear β-catenin (G; p = 0,006) (Panel I). Den procentvise andel af kerner positive for β-catenin i et afsnit blev scoret på en skala fra 0-4. T-antigen-positive tilfælde viste signifikant flere kerner positive for β-catenin end T-antigen-negative prøver (F; * p 0,05) (Panel J). Dobbeltmærkning immunofluorescens viser co-lokaliseringen af ​​T-antigen (Rhodamin) og β-catenin (Fluorescein) i kerner af neoplastiske celler i en lomme af neoplastiske celler nedenunder en epitelforingen af ​​T-antigen-negative celler, hvori β-catenin forbliver cytoplamic (Panel K). Oprindelig forstørrelse af alle immunhistokemi paneler er 600x, og immunfluorescens er 1000x.

Vi har tidligere påvist, at i medulloblastomer, T-antigen er i stand til fysisk at binde og translokere β-catenin, den centrale molekyle Wnt signalvejen, ind i kernen [45], [52]. For at bestemme om β-catenin er til stede og er forbundet med T-antigen i coloncancer, udførte vi immunhistokemi i de samme 113 prøver og analyseret ekspressionen af ​​nukleare β-catenin i T-antigen-positive og negative grupper. Vi fandt, at af de 71 samlede T-antigen-positive coloncancer prøver, 48 viste nuklear ekspression af β-catenin (67,6%), mens kun 17/42 (40,5%) af T-antigen-negative prøver var positive for nuklear β-catenin (p≤0.005, fig 1I). I alle T-antigen-negative tilfælde, β-catenin forblev i cytoplasmaet. Interessant nok var de samme observationer stede i de polypper, hvor det nukleare β-catenin korrelerede med ekspression af T-antigen. I den normale slimhinde, β-catenin forblev lokaliseret til sin sædvanlige placering i cytoplasmaet og membranen. β-catenin nukleare positive celler blev bedømt på en skala fra 0-4, med en score på 0 angiver, at ~ 5% eller færre celler, og en score på 4 angiver -75% eller flere celler med nuklear β-catenin. T-Antigen positive prøver havde en gennemsnitlig score på 1,463 (SD 1,164) for nuklear β-catenin, mens T-antigen negative prøver havde en gennemsnitlig score på 0,8182 (SD 0,9580, p ≤ 0,05, figur 1J).

Endelig udførte vi dobbeltmærkning immunofluorescens i en positiv sag, der indeholdt de tre områder (normal colon, polyp og cancer) og fandt, at i den normale colon, hvor T-Antigen er negativ, er β-catenin udtrykt i cytoplasmaet; dog i polypper og neoplastiske celler, som udtrykker T-antigen, β-catenin er co-lokalisere med JCV onkoprotein i den nukleare rum. Figur 1, felt K viser et område, som indeholder normalt epitel i toppen, med ingen ekspression af T-antigen og cytoplasmatiske β-catenin, mens en underliggende lomme af neoplastiske celler, som robust udtrykker T-antigen viser nuklear co-lokalisering af β catenin.

Påvisning af JC virus T-antigen genomiske sekvenser i kolorektal cancer prøver

for at bekræfte tilstedeværelsen af ​​T-antigen-gen, udførte vi PCR-amplifikation efterfulgt af Southern blot ved hjælp af et højt specifik og følsom probe for JCV T-antigen i et udvalgt antal 34 tyktarmskræft sager, der indeholdt høj kvalitet DNA. En skematisk repræsentation af JCV-genomet er vist, indeholder placeringen af ​​primere til Southern blot-amplifikation og probesyntese (figur 2A). Regionen sonde anerkendelse i JCV genom (basepar 4304-4405) varierer meget mellem JCV, BKV, og SV40, med 20 nukleotid uoverensstemmelser mellem JCV og BK-virus, og 33 nukleotid uoverensstemmelser mellem JCV og SV40 i denne region. Mens Pep1 og PEP2 primere amplificerer både JCV og BKV T-antigen vores sonde erkender området mellem Pep1 og PEP2 primere er yderst specifik for JCV og ikke binder til BKV eller SV40 [53].

En skematisk repræsentation af Mad-1 stamme af JCV genomiske struktur viser virale gener i røde, tidlige og sene transkripter i grå, og placeringen af ​​primere anvendt til T-antigen amplifikation (pEP1 og PEP2) og Southern blot-probe syntese (PEP INT1 og PEP int2) (Panel A). Genomiske sekvenser af den virale tidlige område, der koder for T-antigen blev påvist i 28 af 34 udvalgte prøver. Et repræsentativt Southern blot præsenteres, med case Tallene over hver bane. Negative resultater blev observeret, når de samme sager blev testet med prober til BKV og SV40. Negative kontroller viser resultater fra reaktioner indeholdende intet DNA og positiv kontrol repræsenterer genamplifikation under anvendelse pBJC, et plasmid indeholdende JCV DNA som en skabelon eller plasmider indeholdende BKV og SV40 T-antigener. PCR for GAPDH og agaroseelektroforese blev anvendt til at bekræfte tilstedeværelsen af ​​intakt genomisk DNA i alle tilfælde. (Panel B). Southern blots af plasmider indeholdende T-antigenet af JCV, BKV og SV40 blev testet med specifikke prober for hver polyomavirus, viser specificiteten af ​​proberne (Panel C). Et repræsentativt Southern-blot af PCR-amplifikation af kontrol regulatoriske region er vist (Felt D, venstre). Sekventering afslørede tilstedeværelsen af ​​Mad-1 og Mad-4 stammer med punktmutationer i de forskellige prøver. En repræsentativ sekvens er vist i blå, under den kendte sekvens af Mad-4 CR region (sort); punktmutationer er fremhævet med rødt (Panel D, til højre).

Vi forstærket genomiske sekvenser fra T-antigen kodende region i 28 prøver af de 34 prøver (82,4%), 21 hvoraf demonstrerede T -Antigen proteinekspression ved immunhistokemi. I kun seks tilfælde fandt vi tilstedeværelsen af ​​viralt DNA, men intet protein ekspression, og ingen af ​​disse tilfælde havde T-antigenekspression i fravær af virale genomiske sekvenser. Vi testede de amplificerede sekvenser med specifikke prober for BKV og SV40, hvilket resulterer negativ i alle tilfælde. Højkvalitets genomisk DNA blev bekræftet i hver prøve ved PCR for GAPDH. (Figur 2B). Endelig har vi også testet vores sonder med plasmider indeholdende T-antigener fra JCV, BKV en SV40, der bekræfter specificiteten af ​​vore prober, og tyder på, at immunhistokemi afslører T-antigenet af JCV og ikke en fra de andre polyomavira (figur 2C ).

Dernæst udførte vi PCR-forsøg med primere og prober specifikke for den regulatoriske region af JCV. Vi amplificerede virale sekvenser i 14 af de 34 tilfælde. Figur 2D viser et repræsentativt Southern-blot indeholder en af ​​disse tilfælde, hvilket også var positive for T-antigen region. Sekventering af disse ampliconer afslørede, at Mad-1 og Mad-4 var de to detekterede pletter af JCV. Men alle af disse sekvenser indeholdt individuelle punktmutationer, er forskellige fra hinanden, hvilket tyder på, at disse er faktisk unik og kassere muligheden for forurening laboratorium. En repræsentativ sekvens er vist i blå, under know sekvensen af ​​Mad 4-stammen af ​​JCV i sort. Punktmutationer er fremhævet med rødt (figur 2D). Desuden er en detaljeret oversigt over de tilfælde og resultaterne af PCR-amplifikation og sekventering, samt immunhistokemi præsenteret i tabel 1.

T-antigen og β-catenin co-lokalisere til kernen i kolon kræftceller og co-immunprecipitatet

in vitro

Tidligere undersøgelser tyder på, at T-antigen og β-catenin interagere direkte ændre den normale cytoplasmatisk subcellulære lokalisering af β-catenin. For at underbygge disse resultater

in vitro

at bestemme, om T-antigen og β-catenin er til stede i det samme cellulære rum i colon cancerceller, udførte vi dobbelt immunofluorescens mærkning for disse to proteiner i HCT116 kolon cancercellelinie transient transficeret med T-antigenet. Vi fandt, at celler, der udtrykker oncoproteinet viser en stærk nuklear ekspression af β-catenin (figur 3D-E, pile), mens der i celler, som ikke fare transficeres og udtrykker ikke T-antigen, β-catenin forbliver i cytoplasmaet (figur 3D-E, pilespidser).

Dobbelt immuncytokemi for β-catenin mærkning (Panel B, Fluorescein), og T-antigen (panel C, rhodamin), udført i HTC116 tyktarmscancerceller transient transficeret med T-antigen viser co-lokaliseringen af ​​begge proteiner i kernerne i de fleste celler (panel E, pile), medens i ikke-transficerede celler, i hvilke der ikke er nogen ekspression af T-antigen, β-catenin fortsat udelukkende i cytoplasmaet (Panel E, pilespidser).

for yderligere at definere den subcellulære placering af fysisk interaktion mellem T-antigen og β-catenin, vi udførte en co-immunoprecipiation om nukleare og cytoplasmatiske ekstrakter af HCT116 celler transficeret med en T-antigen ekspressionsvektor eller tom vektor som kontroller. Nukleare og cytoplasmatiske lysater blev inkuberet med et anti-T-antigen-antistof og immunkomplekserne blev analyseret via Western blot med antistoffer mod T-antigen og β-catenin. T-antigen-immunpræcipitater fra kernen og cytoplasmaet show co-udfældning af β-catenin i begge rum (figur 4A). Vi bekræftede denne interaktion i den omvendte eksperiment (β-catenin IP, T-antigen vestlige blot- figur 4B). Specificiteten af ​​nukleare og cytoplasmatiske fraktioner blev bekræftet ved sondering input baner for GRB-2 (cytoplasmatisk) og lamin A /C (nuklear).

HCT116 celler transficeret med T-antigen eller tom vektor blev fraktioneret til at isolere nukleare og cytoplasmiske rum og immunpræcipiteret med et antistof mod T-antigen (A) eller β-catenin (B). T-Antigen trækker ned β-catenin i cytoplasmaet (øverste panel, bane 6) og i kernen (øverste panel, bane 8). Den inverse eksperiment (IP β-catenin) bekræfter interaktionen mellem T-antigen og β-catenin i cytoplasmaet (nederste panel, bane 6) og nucleus (bundpanel, bane 8).

T -Antigen aktiverer TCF-afhængig transskription

Efter bekræftelse på, at T-antigen og β-catenin co-lokalisere og interagere i kernen, undersøgte vi virkningerne af denne interaktion på aktiveringen af ​​β-catenin målgener. Vi udnyttede den TOPflash reporterkonstruktion at måle ændringer i β-catenin /TCF-medieret transkription. Den TOPflash konstruktionen indeholder 16 TCF bindende elementer (TBE-enheder), der driver ekspression af luciferasegenet. HCT116-celler blev transficeret med TOPflash og enten T-antigen, β-catenin, eller både T-antigen og β-catenin. Luminescens blev målt ved 24 timer efter transfektion. Alle grupper blev separat transficeret med FOPflash at måle baseline luminescens. T-antigen eller β-catenin alene signifikant aktiveret TOPflash med 2 gange og 5 gange over tom vektor kontrol hhv. Slående, celler, der udtrykker T-antigen og exogene β-catenin viste en 113 gange forøgelse i TOPflash aktivitet i forhold til baseline (figur 5A, p≤0.001). Disse data viser evnen hos T-antigen og β-catenin til synergistisk aktivere promotorer af β-catenin målgener. Værdier er normaliseret til FOPflash-transficerede celler.

HCT116-celler blev co-transficeret med Wnt-vejen reporterplasmidet TOPflash konstruere og T-antigen, β-catenin, eller begge dele. Celler transficeret med T-antigen eller β-catenin alene øgede TOPflash aktivitet ca. 2 til 5 gange over baseline. Co-transfektion med både T-antigen og β-catenin resulterede i 113 gange stigning i TOPflash aktivitet. Værdier er normaliseret til FOPflash (baseline) grupper (Panel A). For at måle aktivering af specifikke β-catenin mål, blev udført tilsvarende forsøg under anvendelse af luciferase konstruktioner indeholdende c-myc (panel B) eller cyclin D1 (Panel C) promotorer. Ekspression af T-antigen øger c-myc og cyclin D1 promotoraktivitet i HCT116-celler.