PLoS ONE: CDO, en Hh-co-receptor, formidler Lung Cancer Cell Proliferation og Tumorigenicitet gennem Hedgehog Signaling

Abstrakt

Hedgehog (Hh) signalering spiller væsentlige roller i forskellige udviklingsprocesser, og dens afvigende resultater regulering i genetisk lidelser eller maligniteter i forskellige væv. Hyperaktivering af Hh-signalering er forbundet med udvikling lungekræft, og der har været omfattende bestræbelser på at undersøge, hvordan man kan styre Hh signalvejen og regulerer kræft celleproliferation. I dette studie undersøgte vi en rolle CDO, en Hh coreceptor, i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC). Inhibering af Hh-signalering ved SANT-1 eller siCDO i lungecancerceller reduceret proliferation og tumorigenicitet, sammen med faldet i ekspressionen af ​​HH komponenter. Histologisk analyse med NSCLC mus væv viste, at CDO blev udtrykt i avanceret klasse af kræft, og præcist co-lokaliseret med GLI1. Disse data tyder på, at CDO er nødvendig for spredning og overlevelse af lungekræft celler via Hh signalering

Henvisning:. Leem YE, Ha HL, Bae JH, Baek KH, Kang JS (2014) CDO, en Hh-coreceptor , formidler Lung Cancer Cell Proliferation og Tumorigenicitet gennem Hedgehog Signaling. PLoS ONE 9 (11): e111701. doi: 10,1371 /journal.pone.0111701

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: Juni 2, 2014, Accepteret: 1 oktober 2014; Udgivet: November 4, 2014

Copyright: © 2014 Leem et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev finansieret af National Research Foundation Korea (NRF) tilskud finansieret af Sydkorea regering (MSIP) (2012R1A1A2005448 til YEL) og (NRF-2011 til 0.017.315 til JSK). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hh signalvej er et af de væsentlige signalveje, der er impliceret i embryonisk udvikling, morfogenese og proliferation [1], [2], [3], [4], [5], [6]. Den molekylære mekanisme, hvordan man regulere Hh-signalering er stadig under efterforskning. Generelt, når Hh ligand binder til dets primære receptor, Patched en (PTCH1), Smoothened (SMO) frigøres fra PTCH1-medieret hæmning og migrerer til primær cilium. Stimulering af SMO udløser sekventiel signaltransduktion, der aktiverer transkriptionsfaktorer i GLI familie. Den aktive form af GLI-protein translokeres til kernen og regulerer ekspressionen af ​​nedstrøms målgener, herunder PTCH1 og GLI1 [1], [7], [8].

Tabet af Hh-signalering under fosterudviklingen er forbundet med adskillige genetiske lidelser, herunder holoprosencephaly, som er den mest almindelige misdannelse af forhjernen [9], [10], [11]. I modsætning hertil har konstitutiv aktivering af Hh-signalering været kendt for at være involveret i initiering og progression af flere kræftformer i huden (sporadisk basalcellekarcinom, BCC), hjerne (medulloblastom), muskel (rhabdomyosarcoma, RMS), mavetarmkanal, prostata, pankreas og lunge [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23] . Linket af Hh vej til carcinogenese blev oprindeligt rapporteret i Gorlin syndrom, hvor mutationen i

PTCH1

gen er ansvarlig for kræfttilfælde [24]. Desuden afvigende opregulering af Hh signalering via tabet af PTCH1 eller gain-of-function mutation i

SMO

blev grundigt undersøgt i BCC og medulloblastom [13], [14].

betydningen af ​​Hh-signalering i carcinogenese blev også undersøgt i proliferationen af ​​småcellet lungecancer (SCLC), som er en meget aggressiv lungekræft udgør ca. 20-25% af alle lungekræfttilfælde [21]. Hæmning af aktiviteten af ​​Hh-signalering ved hjælp SMO antagonist, cyclopamin resulterede i alvorlige reduktion vækst i SCLC cellelinjer [21], [23], [25], [26]. Betragtninger, var det oprindeligt foreslået, at Hh signalering er mindre forbundet med NSCLC, den mest dominerende form for lungekræft og den mest dødbringende malignitet. flere beviser har imidlertid for nylig indikeret, at NSCLC er afhængig af Hh signalering aktivitet i proliferation samt [27], [28], [29], [30].

Selvom den store receptor mod Hh er PTCH1, der er yderligere co-receptorer, der bistår Hh signalering positivt, såsom CDO, BOC og GAS1 [31], [32], [33], [34], [35]. Hh-signalering er involveret i forskellige cellulære og udviklingsprocesser, og dermed stramme regler er absolut nødvendige for signalering til at genkende og kontrollere mikro-variation i cellulære miljø. I mellemtiden er mange lungekræft cellelinier producerer forskellige niveauer af Hh-ligand [25], [30]. Selv om et lavt niveau af Hh-ligand ses i nogle lungecancerceller, disse celler afslører stigningen i Hh målgenekspression indebærer opregulering af Hh-signalering. Under disse omstændigheder kan tilstedeværelsen af ​​Hh coreceptorer bidrager til amplifikation af den svage ekstracellulære cue i cancerceller foruden finjustering af Hh-signalering under embryogenese.

Blandt disse co-receptorer, CDO er et transmembrant protein, der tilhører immunglobulin (Ig) /fibronectin type III (FNIII) superfamilien og spiller en vigtig rolle i muskel differentiering, embryonisk udvikling og neuronal differentiering [36], [37], [38], [39]. Strukturel analyse viste, at fibronectin gentagelser i det ekstracellulære domæne af CDO er kritisk for Hh binding [39]. Den positive regulering af Hh signalvejen af ​​CDO blev oprindeligt identificeret i

Drosophila

. Det har været kendt, at ihog (ortolog af CDO i

Drosophila

) sammen med boi (ortolog BOC i

Drosophila

) er vigtig for aktivering af Hh-signalering i udviklingslandene fløj imaginære disk [ ,,,0],40], [41]. Hos mus, Cdo mangel udviser flere medfødte defekter, herunder holoprosencephaly, som er defekt almindeligt forbundet med mutationer i Hh-signalering [39], [42]. Endvidere CDO involveret i Hh-medieret ventrale neurale mønsterdannelse af det mammale neurale rør [31] og såvel som i Hh-medieret celleproliferation i cerebellare granula neuron progenitorer (CGNPs) [43].

Desuden til rollen som CDO i orgel udvikling og celledifferentiering, sammenslutningen af ​​CDO til Hh signalering, der er impliceret i tumorigenese fascineret os at belyse et rolle CDO i lungekræft celleproliferation. I den foreliggende undersøgelse søgte vi at afdække bidrag CDO til Hh signalering i NSCLCs og derudover på proliferation og tumorigenicitet i lunge tumorceller. Vi fandt, at niveauet for CDO var højere i NSCLC-celler, og at inhiberingen af ​​CDO ekspression nedreguleres Hh-signalering, og reduceret proliferation og tumorigenese i humane lungecancerceller. Derudover blev CDO udtryk observeret i fremskredent stadium af NSCLC væv. Taget sammen alle data antyder, at CDO, som en co-receptor for Hh, er afgørende for cancercelleproliferation og tumorigenicitet, og derfor kan betragtes som en god kandidat til anticancer terapeutiske anvendelser.

Materialer og metoder

Cellekulturer og reagenser

BEAS-2B og NSCLC cellelinjer, A549, H1299, H460 og H520 blev venligst stillet til rådighed af Prof. DH Kim (Sungkyunkwan University, Samsung Biomedical Research Institute, Korea) [44]. Den kultur af BEAS-2B fulgt ATCC retningslinjer. NSCLC-celler blev dyrket i en fugtig inkubator med 5% CO

2 i RPMI-1640-medium (Invitrogen) med 10% føtalt bovint serum (FBS) suppleret med penicillin og streptomycin. Til måling mRNA /protein-ekspression eller celledød i siCDO-transficerede celler, blev mediet skiftet til RPMI-1640 medium med 0,5% FBS en dag efter transfektion, og de transficerede celler blev dyrket i 2 dage yderligere. 50 uM Sant1 (S4572, Sigma-Aldrich) opløst i DMSO eller i et tilsvarende volumen af ​​køretøjets DMSO blev behandlet til celler dyrket i RPMI-1640-medium indeholdende 0,5% FBS ved angivne tidspunkt.

RNA interferenseksperimenter

Hver NSCLC cellelinje blev transficeret med siCDO hjælp Lipfectamine RNAiMAX reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Følgende sekvenser blev anvendt som siRNA mod CDO. siCDO # 1, Sense, 5′-GGAUCUUGGACCCUUAUGUUU-3 ‘, antisense, 5’ACAUAAGGGUCCAAGAUCCUU-3’. siCDO # 2, Sense, 5′-CUUCAAAGUCGAAUAUAAAUU-3 ‘, Antisense, 5’UUUAUAUUCGACUUUGAAGUU’. For

in vivo

tumorgenicitet assay, A549 celler, der stabilt udtrykker lille hårnål RNA (shRNA) mod CDO, blev fremstillet ved transfektion med pSUPER-puro-shCDO. pSUPER-puro-shCDO vektor blev tidligere rapporteret [42].

Total RNA fremstilling og real-time QRT-PCR

Samlet RNA blev isoleret under anvendelse easyBLUE total RNA-ekstraktion kit (intron Biotechnology Inc. , Korea), og cDNA blev syntetiseret under anvendelse PrimeScript RT reagenskit (TAKARA, Japan) ifølge producentens instruktioner. Real-time QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR Premix ExTaq kit (TAKARA, Japan) og termisk cykliseringsapparat Dice tidstro system (TP800, TAKARA, Japan) ifølge producentens instruktioner. Den forreste (F) og reverse (R) primere anvendt i denne undersøgelse, er angivet nedenfor.

SHH

F, 5′-CCAAAAAGCTGACCCCTTTA-3 ‘, R, 5′-GCTCCGGTGTTTTCTTCATC-3’;

PTCH1

F, 5′-CAGCACTGGAAAACTCGTCA-3 ‘, R, 5′-TCTGATGAACCACCTCCACA-3’;

GLI1

F, 5′-AAGGGGTTTCTATCCTTCCAGA-3 ‘, R, 5′-TCCTTTATTATCAGGAAACAGTGTCA-3’;

CDO

F, 5′-GGGAAATACATCTGCGAAGC-3 ‘, R, 5′-CTGAGCAGCATCAGGAAGTG-3’;

18S rRNA

F, 5′-GTAACCCGTTGAACCCCATT-3 ‘, R, 5′-CCATCCAATCGGTAGTAGCG-3’. Relativ kvantificering af en genekspression blev beskrevet som fold af relative ændringer i mRNA-niveauer sammenlignet med en kontrol, ved hjælp af 2

-ΔΔCt ligning, [ΔΔCt = ACt (målgenet) -ΔCt (anmodning genet)]. 18S rRNA blev anvendt som en reference-gen. Salg

celleproliferation og levedygtighed assay

Celler blev podet ved en koncentration på 5 x 10

3 eller 1 × 10

4 celler pr 96 brønde og dyrket i RPMI-1640 indeholdende 0,5% FBS. Trypsinerede celler blev farvet med trypanblåt (TB) opløsning, og de ikke-farvede levedygtige celler blev talt. For MTT-assay, 20 pi 5 mg /ml MTT (3- [4,5-dimethylthiazol-2-yl] 2,5-diphenyltetrazoliumbromid) blev tilsat til 5 x 10

3 eller 1 × 10

4 celler pr 96 brønde. Efter 4 timers inkubering ved 37 ° C, blev kulturen suppe skiftet til 200 pi DMSO. Absorbansen blev målt ved 595 nm. For BrdU assay blev cellerne dyrket med 10 uM bromdeoxyuridin (BrdU; Sigma-Aldrich Corp.) i 1 time. Fikserede celler med 4% PFA blev probet med anti-BrdU-antistof (Chemicon International Inc.). Fluorescens blev detekteret ved Alexa Fluor 488 gede-anti-muse-antistof (Molecular Probe).

flowcytometriassayet af apoptose

Apoptose blev målt ved hjælp ApoScan Annexin V FITC apoptosis afsløring kit (BioBud, Korea ) og BD FACS CANTO II flowcytometer (BD Biosciences) ifølge producentens instruktioner.

Western blot-

Western blot analyser blev udført som tidligere beskrevet [37]. Primære antistoffer anvendt i denne undersøgelse, er angivet nedenfor; Kløvet Caspase3 (# 9664, Cell Signaling), Caspase9 (sc-81.663, Santa Cruz), Cdk2 (sc-6248, Santa Cruz), cyclin D1 (sc-246, Santa Cruz), cyclin E (sc25303, Santa Cruz), GAPDH (AbFRONTIER, Korea), p21 (sc-6246), p27 (ab7961, Abcam).

Kolonidannelseseffektivitet assay

Fem tusinde celler blev forsigtigt blandet med 10% FBS RPMI-1640 medium indeholdende 0,35% agarose. Blandingen overlejret på den 0,5% nederste agarose med 10% FBS-medium i 6-brønds plader. De udpladede celler blev inkuberet ved 37 ° C i fugtet inkubator i 3 uger med fodring af medium hver anden dag. Den kolonidannelse blev visualiseret med 0,01% krystalviolet og analyseret med et dissektionsmikroskop. Kvantificeringen af ​​koloni antal pr felt blev bestemt ved anvendelse ImageJ. Hvert forsøg blev udført i tre eksemplarer og gentages to gange

I viv

o tumorgenicitet assay

5 × 10

6 af kontrollen (pSUPER-puro) -. Eller pSUPER-puro-shCDO-transficerede A549-celler blev subkutant injiceret i flankerne af 6- til 8-uger gamle nøgne hunmus. Tumorvolumen blev målt hver 4. dag, og beregnet som beskrevet [45]. Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af International Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM er en Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) international akkrediteret facilitet og overholder Institute for Laboratory Animal Research (ma-) vejledning.

Mus og immunhistokemi

LSL-K-ras

G12D

mus blev leveret af Dr. Tyler Jacks (MIT Cancer center) [46], [47]. De paraffinsnit fra

LSL-K-ras

G12D

mus blev immunreagerer med 2B3 (muse-ascites mod CDO) og anti-GLI1 antistof (1:100; ab49314, Abcam), og påvist under anvendelse af immunofluorescens. Konfokal mikroskopi blev udført ved SKKU School of Medicine-mikroskopi Shared Resource Facility med Zeiss LSM-510 Meta konfokalmikroskop. Alle dyreforsøg blev gennemgået og godkendt af International Animal Care og brug Udvalg (IACUC) af SKKU School of Medicine (SUSM). SUSM er en Association for Vurdering og akkreditering af Laboratory Animal Care (AAALAC) internationalt akkrediteret facilitet og overholder Institute for Laboratory Animal Research (ma-) vejledning.

Statistisk analyse

blev udført statistiske analyser hjælp Students

t

test. Data blev præsenteret som middelværdi ± SD fra mindst tre uafhængige forsøg og betragtet som signifikant, når

s

værdier var 0,05 (*) eller. 0,01 (**)

Resultater

Hh komponenter, som er involveret i lungekræft celleproliferation blev inhiberet af CDO udtynding i NSCLCs

Tidligere litteratur har vist, at CDO fungerer som tilbehør receptor for Hh ligand og positivt regulerer Hh signalering [39] , [48]. Den tætte relevans af aktiveringen af ​​Hh signalering til cancercelleproliferation bedt os først at teste CDO ekspression i NSCLC-celler. For at gøre dette, blev de samlede RNA isoleret fra A549, H1299, H460 og H520 NSCLC cellelinier samt fra BEAS-2B human non-kræft lunge celle, og anvendes til at analysere CDO udtryk ved at gøre real-tid QRT-PCR. Resultatet viste, at CDO blev udtrykt højere i A549, H1299 og H520 celler end BEAS-2B dog H460 afslørede relativt lavere CDO niveau (figur 1A). Derudover undersøgte vi ekspressionen af ​​Hh signalering komponenter i NSCLC-celler ved at udføre real-time QRT-PCR. Den højere ekspression af SHH blev set i alle fire NSCLC cellelinier end i ikke-kræft lunge celle. På samme måde blev de nedstrøms målgener af Hh-signalering, PTCH1 og GLI1 udtrykt højere i de NSCLC celler (figur 1A). A549 udviste relativt lavere niveau af Hh-ligand, sammenlignet med andre cellelinier imidlertid afsløret stigningen i Hh målgenekspression (PTCH1 og GLI1). I H520 blev CDO, SHH og PTCH1 udtrykt relativt højere end nogen andre cellelinjer men GLI1 udtryk var forholdsvis lav.

A. Real-time QRT-PCR for ekspressionsniveauerne af CDO og HH signaling komponenter (SHH, PTCH1 og GLI1) i BEAS-2B og NSCLC cellelinier (A549, H1299, H460 og H520). Hver ekspressionsniveauet blev normaliseret til det niveau af 18S rRNA. Den relative mængde af hver komponent i NSCLCs blev bestemt som mængden af ​​hver i BEAS-2B blev sat til 1,0. B. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved celletælling ved angivet tidspunkt i A549, H1299, H460 og H520 behandlet med eller uden 50 pM Sant1. C. Cellelevedygtighed blev vurderet ved MTT-assay ved angivet tidspunkt i A549, H1299, H460 og H520 behandlet med eller uden 50 pM Sant1. Absorbansen blev målt ved 595 nm. D. RT-PCR for CDO i A549, H1299 og H460 transficeret med scrambled siRNA eller siCDO # 1. E. Real-time QRT-PCR for Hh signalering komponenter i A549, H1299 og H460 transficeret med scrambled siRNA eller siCDO. Udtrykket for hver komponent blev normaliseret til niveauet af 18S rRNA. Den relative mængde af hver bestanddel i CDO-depleteret NSCLCs blev bestemt som mængden af ​​hver i kontrolcellerne blev sat til 1,0 (rød linje). Alle værdier repræsenterer hjælp af mindst tredobbelte bestemmelser ± 1 SD. *

s

0,05 og **

s

. 0,01

Vi først bestemmes hæmmende virkning af Sant1 på Hh-signalering ved at undersøge ekspressionen af hh signalering målgener efter Sant1 behandling. Sant1 binder direkte til SMO, hindrer signalering. Total RNA isoleret fra DMSO eller Sant1-behandlede A549, H1299 og H460 blev brugt til at analysere PTCH1 og GLI1 udtryk ved real-time QRT-PCR. Som forudsagt, tilsætning af Sant1 resulterede i reduktion af PTCH1 og GLI1 udtryk (figur S1 i File S1). For at bestemme virkningen af ​​Hh-signalering om spredning af NSCLCs, vi inhiberede Hh-signalering i A549, H1299, H460 og H520 ved hjælp SANT-1. Derefter blev TB celletælling og MTT-assay udført for at analysere celleproliferation og levedygtighed. Dataene viste, at tilsætning af 50 uM Sant1 resulterede i signifikant reduktion i cellevækst og levedygtighed fire individuelle NSCLC celler (Figur 1B og C). Virkningen af ​​Sant1-medieret inhibering var stærkere på sene tidspunkter. Disse data indikerer, at de testede NSCLC celler kræver Hh signalering aktivitet for at fastholde deres proliferation.

Dernæst spurgte vi, om CDO bidrog til aktiviteten af ​​Hh-signalering i NSCLCs. For at bestemme, at vi transficeret tre forskellige NSCLC cellelinjer, A549, H1299 og H460 med siCDO eller krypterede siRNA og vurderet effekten af ​​CDO mangel på udtryk for Hh signalering komponenter ved real-time QRT-PCR. Ekspressionen af ​​CDO blev væsentligt reduceret med siCDO i alle cellelinjer (fig 1D). At nedbryder CDO ekspression, vi udnyttet to forskellige sekvenser af siRNA, siCDO # 1 og # 2. Begge siCDOs var viser den tilsvarende CDO udtømning og resultaterne (data ikke vist), og vi præsenterer data fra siCDO # 1. Niveauerne af Hh signalering komponenter, SHH, PTCH1, og GLI1 blev væsentligt reduceret i CDO-udtømte lunge kræftceller sammenlignet med scrambled kontrol (figur 1E). Disse data angiver, at CDO fungerer som en positiv regulator for Hh-signalering i NSCLC celler, uanset dens udtryk niveau.

CDO udtømning førte til en hæmning af spredning og en induktion af apoptose i NSCLCs

som vist i figur 1B og C, observerede vi, at proliferation af NSCLC-celler var ganske følsomme over for Sant1. Således besluttede vi at bestemme virkningen af ​​den nedregulering af Hh-signalering af CDO knockdown på cancercelleproliferation. For at gøre dette, vi evaluerede hastigheden af ​​cellulær proliferation af A549, H1299, H460 og H520 under CDO-udtømte tilstand ved at udføre TB celletælling og MTT assay (figur 2A og D). Resultatet viste, at CDO knockdown i alle testede NSCLC-celler betydeligt formindsket celletal og levedygtighed sammenlignet med scrambled kontrol. Men omfanget af nedsættelsen proliferation var ikke stærkere end den, Sant1 behandling (sammenlign figur 2A og D til figur 1B og C). Hældningen af ​​graferne for celletal og levedygtighed i CDO-udtømte cancerceller stadig holdt stiger længere tidspunkt dag 5 sammenlignet med i Sant1 behandling, selvom niveauerne var absolut meget lavere end i de scrambled kontrol celler. For at vurdere virkningen af ​​CDO udtømning på proliferation yderligere, udførte vi BrdU-inkorporering assay. Resultatet viste, at CDO knockdown i NSCLC-celler førte til 20-40% af faldet i celleproliferation (figur 2B).

A. Antallet af levedygtige celler blev bestemt ved celletælling ved angivet tidspunkt i kontrol- eller CDO-depleteret A549, H1299, H460 og H520. B. Cell spredning af CDO knockdown A549 blev H1299, H460 og H520 bestemt af BrdU inkorporering. C. Western blot-analyse for ekspression af cellecyklus regulatorer (cyclin D1, cyklin E og Cdk2), repressorer (P27 og p21) og apoptotiske markører (kløvet caspase 3 og kløvet Caspase 9) i kontrolgruppen eller CDO knockdown A549 celler. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. D. MTT assay for cellen levedygtighed styre- eller siCDO-transficeret A549, H1299, H460 og H520 på angivne tidspunkt. Absorbansen blev målt ved 595 nm. E. Annexin V-FITC apoptose og flowcytometri-analyse med A549, H1299, H460 og H520 transficeret med scrambled siRNA eller siCDO. Alle værdier repræsenterer hjælp af mindst tredobbelte bestemmelser ± 1 SD. *

s

0,05 og **

s

. 0,01

Faldet i celledeling og levedygtighed i CDO-udtømte NSCLC celler kunne være på grund af nedsat cellecyklusprogression og /eller forøget celledød. For at verificere ekspressionsniveauerne af cellecyklus regulatorer /repressorer, A549-celler transficeret med krypteret eller siCDO blev undersøgt for immunblotting. Som følge heraf blev de proteinniveauer af cellecyklus regulatorer (cyclin D1, cyklin E, og Cdk2) faldt, medens udtrykkene for Cdk inhibitorer (P27 og p21) var forhøjet i siCDO-behandlede A549-celler sammenlignet med de krypterede-behandlede celler (Figur 2C). Disse data viser, at hæmning af CDO udtryk synes at forårsage cellecyklusstop i NSCLC celler.

Så vi spurgte, om CDO udtømning også var forbundet med celledød. Immunoblotting mod spaltede former af caspase-9 og -3 viste, at disse apoptotiske faktorer blev detekteret stærkere i siCDO-transficerede A549 end i kontrolgruppen (figur 2C). Konsekvent, flowcytometri profil for apoptose med A549, H1299, H460 og H520 udstillet, at højere procentdel af annexin-V og PI dobbelt positive celler blev fundet i fire individuelle CDO-udtømte NSCLCs (Figur 2E). Derfor er disse data antyder, at den nedsat proliferation af NSCLCs på CDO udtynding skyldes øget celledød samt svækket cellecyklusprogression.

Hæmning af CDO udtryk i NSCLCs viste reduktion af

in vitro

og

in vivo

tumorgenicitet

formindsket celleproliferation i CDO knockdown førte os til at undersøge indflydelsen af ​​CDO udtømning på maligne funktioner i NSCLC celler. Til det vurderede vi omfanget af kolonidannelse af siCDO-transficeret A549, H1299, H460 og H520 celler i blød agar (figur 3A og B). Resultatet viste en markant reduktion i clonogenicity

in vitro

når CDO-niveau blev reduceret.

A. Colony dannelsen af ​​kontrollen eller CDO knockdown A549, H1299, H460 og H520 i blød agar. B. Kvantitativ analyse af forsøget er beskrevet i A. Colony numre per felt blev bestemt ved ImageJ. Værdierne repræsenterer middelværdier af tredobbelte bestemmelser ± 1 SD. *

s

0,05 og **

s

0,01. C. repræsentant tumorvækst 50 dage efter subkutan injektion af nøgne mus med kontrollen eller shCDO-behandlede A549-celler. D. tumorvolumen af ​​de nøgne mus med kontrol A549 (n = 8) eller CDO-depleteret A549 (n = 10) som beskrevet i C. Organer er vist som fejlsøjler. E. Tumorer fra nøgne mus injiceret med kontrol A549 eller CDO-udtømte A549 celler er vist i C.

For at understøtte data fra

in vitro

tumorgenicitet, vi forberedt stabil cellelinie af A549 udtrykker shRNA mod CDO, og injiceret subkutant kontrol eller CDO-udtømte celler til flankerne af nøgne mus. Tumorstørrelsen blev målt periodisk. Som vist figur 3C, D og E, blev et signifikant fald i tumorvækst observeres i nøgne mus injiceret med CDO-knockdown A549. Tilsammen udgør disse data indikerer, at CDO er påkrævet til den

in vivo

vækst NSCLC celler.

CDO udtryk blev påvist med GLI1 sammen i fremskredne stadier af NSCLCs

For at bestemme CDO udtryk under lungekræft progression, tog vi fordel af et NSCLC musemodel,

LSL-K-ras

G12D

mus [46], [47]. Efter intranasal indånding af Ad-Cre at fremkalde spontan lunge tumorigenese i

LSL-K-ras

G12D

mus, vurderede vi CDO udtryk i lungerne tumorvæv viser fire individuelle kvaliteter af tumor progression af fluorescerende immunhistokemi. CDO udtryk var næsten ikke målbart i lønklasse-1, som er en tidlig fase af tumor progression byder atypisk adenomatøs hyperplasi (AAH) eller lille adenom (figur S2 i File S1). sit udtryk blev imidlertid beriget, da tumor progression er rykket frem. I klasse-2, ved hvilken der detekteres større adenomer med lidt forstørrede kerner blev CDO ekspression observeret i cytoplasmaet i celler i tumoren læsioner, og denne høje ekspression blev bibeholdt indtil klasse-3 (figur 4). Som tumorer skred at være invasive adenocarcinomer (grad-4), blev CDO ekspression faldt en smule og påvises i cellemembranen. Ekspressionen af ​​CDO i tumorbyrde førte os til at undersøge ekspressionen af ​​Hh pathway komponenter i tumorvævet. Konfokal immunofluorescens billeder viste, at GLI1, en af ​​Hh signalering faktorer blev colocalized med CDO, og derudover dens udtryk blev også meget observeret i klasse-2 og -3 tumor læsioner, ikke i lønklasse-4 (figur 4). Den mangel på GLI1 udtryk i lønklasse-4, som svarer til de resultater, som er blevet foreslået af flere tidligere studier [23], [29]. Resultaterne af disse forsøg viser, at CDO ekspression kan korreleres til opregulering af Hh-signalering i tumorlæsioner og CDO er også sandsynligt relateret til progressionen af ​​lungetumor, ikke i tumorinitiering.

Konfokal immunfluorescenspåvisningen af CDO (rød) og GLI1 (grøn) i lønklasse-2, -3, og -4 lunge tumorvæv fra

LSL-K-ras

G12D

model. Cellekerner blev visualiseret ved DAPI (blå) og fasekontrast billeder skal vises. Scale bar indikerer 50 um.

Diskussion

Faktisk betydningen af ​​CDO i kræft celledeling var noget udækket og henviste tidligere. Hayashi

et al.

[49] gjort en indsats for at frasortere gener, der koder transmembrane proteiner, som er højt udtrykt i prostata cancer cellelinjer. Blandt kandidaterne, fokuserede de på 83% af CDO-overudtrykt prostatakræft, og viste, at reduktion af CDO udtryk induceret apoptose og hæmmede celle invasion i prostatakræft. Imidlertid blev den molekylære mekanisme hvordan CDO er involveret i proliferation af prostatacancerceller ikke forklaret. I denne undersøgelse, vi viste, at fin-tuning og opregulering af Hh signalering ved CDO helt er nødvendig for celledeling i lungekræft. Vi har desuden observeret, at mRNA-niveauet af CDO i de testede lungekræft cellelinier undtagen H520 var højere end i BEAS-2B, men det var ikke signifikant. Især CDO mRNA-niveau i A549 var ca. 1,7 gange højere end det basale niveau af det i BEAS-2B. Selvom stigningen ikke er dramatisk høj, er det værd at bemærke, hvis vi mener, at CDO udtryk generelt fundet under udvikling og embryogenese, og næppe påvist i voksent væv [36].

Det var oprindeligt antaget, at Hh signalering blev sjældent forbundet med NSCLC, fordi Hh og GLI1 blev observeret på et relativt lavere niveau i NSCLC. Siden da dataene, herunder de foreliggende data, af inhiberingen af ​​NSCLC proliferation med en SMO antagonist foreslået, at aktiveringen af ​​Hh-signalering via det lave niveau af Hh sikkert er forbundet med tumorigenese i NSCLC. Under denne omstændighed kan CDO spiller en kritisk rolle som en ligand sensor til en lille mængde af Hh, understøtter den vigtigste receptor, PTCH1 og efter alle inducerer aktiveringen af ​​Hh-signalering.

mellemtiden funktionen af ​​CDO i celle proliferation synes at være ambivalent afhængigt Hh plan. Delloye-Bourgeois

et al.

[50] for nylig foreslået, at det Hh plan er vigtigt for CDO at fungere som en afhængighed receptor, som er tæt forbundet med induktionen af ​​proapoptotiske signal. Ifølge dem, når Hh ligand ret begrænset, er caspase 3/9 rekrutteres til caspasespaltningssted i intercellulære domæne af CDO og fremkalde proteolytisk spaltning. Denne caspase-medieret spaltning vinder udløser apoptose. Rolle CDO som afhængighed receptor dybest strid med funktionen af ​​CDO i cancerceller med Hh udtryk, hvad vi afdækket i denne undersøgelse. Derfor passende Hh ligand synes at være afgørende for at bestemme funktionen af ​​CDO som en positiv regulator af Hh-signalering eller en afhængighed receptor.

Inhiberingen af ​​Hh-signalering ved Sant1 i alle NSCLC celler viste mere væsentlig reduktion af celleproliferation og levedygtighed på længere tid end af inhiberingen af ​​CDO gen udtømning (sammenlign figur 1 B og C til fig 2A og D). Den begrænsede effekt af CDO knockdown på hæmning af celledeling kan skyldes, at andre Hh co-receptorer, såsom BOC og GAS1 stadig udtrykkes og aktiv, selv om vi ikke kan udelukke muligheden for forbigående CDO udtynding med siRNA. Det er blevet påvist, at alle Hh co-receptorer, CDO, BOC, og GAS1 tilsammen er nødvendigt for fuld aktivering af Hh-signalering. CDO, BOC og GAS1 individuelt lave et kompleks med PTCH1 og dannelsen af ​​komplekserne er kritisk for Hh-medieret CGNP proliferation [43]. Baseret på dette, forståelse roller BOC og GAS1 under Hh-medieret tumorigenese vil være behov senere.

Påvisning af CDO-ekspression i høj kvalitet tumor læsion af NSCLC musemodel, ikke i læsionen af ​​klasse-1 , ophidset vores nysgerrighed på den rolle, CDO-medieret Hh signalering i tumor progression. Det er blevet overvejende foreslået, at opregulering af Hh-signalering synes at være korreleret med tumorklassificering selv om det er kontroversiel i nogle typer af cancer. I prostatakræft, blev mRNA-niveauer af SHH, PTCH1 og GLI1 stærkt forhøjede i mere fremskredne stadier af kræft, og alle disse komponenter blev tæt knyttet til Gleason score [51]. På den anden side, Gialmanidis

et al.

[29] har immunohistokemisk analyseret paraffinindlejrede lung vævssnit på 80 NSCLC-patienter. De fandt, at aktivering af Hh-signalering var forbundet med tumorklassificering, og den høje aktivering af signalering blev hovedsageligt påvist i veldifferentieret og moderat differentieret tumorer. Den robuste ekspression af CDO i high-grade tumor kan føre til en mulighed, at CDO som en positiv regulator regulerer og resulterer i uregelmæssig aktivering af Hh-signalering i tumorudvikling og progression.

Hidtil bestræbelserne på at finde anticancer behandling er blevet rettet mod primært SMO, og faktisk flere SMO-hæmmere har anvendt til klinikken [52]. Ekspressionen af ​​CDO er generelt begrænset i udvikling og embryogenese, ikke i voksne stadium. Unormal ekspression af CDO i kræft betingelse er eventuelt associeret med afvigende celleproliferation.