PLoS ONE: Samtidig Multi-antistof Farvning i ikke-småcellet lungekræft Styrker Diagnostisk Nøjagtighed Især i Lille Tissue Samples

Abstrakt

Histologisk underklassificering af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) har voksende terapeutisk effekt. I avancerede kræft stadier vævsprøver er normalt bioptically indsamles. Disse små prøver af ekstraordinær værdi siden molekylære analyser vinder frem for målrettede behandlinger. Vi studerede derfor muligheden, diagnostisk nøjagtighed, økonomiske og prognostiske virkninger af et væv besparende simultan multi-antistof-assay til underklassificering af NSCLC. Af 265 NSCLC-patienter væv multi arrays (TMA) blev konstrueret til at simulere biopsiprøver. TMA’erne blev farvet ved en samtidig bi-farve multi-antistof-assay, der består af TTF1, vimentin, P63 og neuroendokrine markører (CD56, chromogranin A, synaptophysin). Klassifikation var hovedsagelig baseret på det nuværende forslag af IASLC med en hierarkisk beslutningstræ for underklassificering i adenocarcinom (LAC), planocellulært karcinom (SCC), storcellet neuroendokrine karcinom (LCNEC) og NSCLC ikke andet er angivet. Undersøgelse af tumor heterogenitet viste en eksplicit lavere variation for immunhistokemisk analyser i forhold til konventionelle klassifikation. Desuden overlevelse analyse af vores kombinerede immunhistokemiske klassifikation afslørede tydelig adskillelse af de enkelte enheds overlevelse kurve. Dette var statistisk signifikant for terapeutisk vigtige undergrupper (p = 0,045). Som morfologiske og molekylære kræft test er ved at opstå, vores multi-antistof-assay i kombination med standardiseret klassifikation leverer nøjagtig og pålidelig adskillelse af histomorfologisk diagnoser. Derudover er det tillader klinisk relevant subtypning af NSCLC herunder LCNEC. Vores multi-antistof-assay kan derfor være af særlig værdi, især ved diagnosticering små biopsier. Det leverer videre nord betydelig prognostisk information med terapeutiske konsekvenser. Integration af immunhistokemisk subtypning herunder undersøgelse af neuroendokrine differentiering i standard histopatologisk klassifikation af NSCLC må derfor betragtes

Henvisning:. Kayser G, Csanádi A, Otto C, Plönes T, Bittermann N, Rawluk J, et al . (2013) Samtidig Multi-antistof Farvning i ikke-småcellet lungekræft Styrker Diagnostisk Nøjagtighed Især i små vævsprøver. PLoS ONE 8 (2): e56333. doi: 10,1371 /journal.pone.0056333

Redaktør: Marc burg, Boston University Medical Center, USA

Modtaget: August 18, 2012; Accepteret: 8. januar 2013; Publiceret: 13. februar 2013 |

Copyright: © 2013 Kayser et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Undersøgelsen er blevet støttet af Deutsche Forschungsgemeinschaft, SFB 850. finansieringskilderne havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

Lungekræft udviser den højeste samlede dødelighed af malign sygdom hos mennesker over hele verden [1], [2]. Trods enorme fremskridt i moderne medicin, dødeligheden i lungekræft er stadig i en stabil tilstand afspejler det presserende behov for stærke målrettede kemoterapeutiske midler i behandlingen af ​​denne udbredte sygdom. Blandt adskillelsen af ​​småcellet lungecancer (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), kan sidstnævnte blive yderligere underklassificeres i henhold til dens morfologiske udseende i tre hovedgrupper: adenocarcinomer (LAC), pladecellecarcinomer (SCC) og storcellede carcinomer (LCC). Udover forskellige morfologi seneste undersøgelser har afsløret biologiske forskelle mellem de histologiske NSCLC undertyper. Disse omfatter forskellige ekspressionsmønstre for m-RNA og immunhistokemisk påviselige proteiner, såsom thymidylatsynthetase (TS). TS, der er involveret i DNA-reparationsmekanismer, er et af de vigtigste mål for pemetrexed og væsentligt højere udtrykt i SCC i forhold til LAC og LCC. Scagliotti et al. kunne vise, at patienter, der lider af LAC og LCC gavn af platin kemoterapi i kombination med pemetrexed. I modsætning hertil SCC patienter gavn af en kombination af platin med gemcitabin [3]. Hovedsagelig baseret på denne undersøgelse blev anbefalinger til nøjagtig subtypning af NSCLC indført i nationale retningslinjer lungekræft [4] – [6]. Dilemmaet for patologer i denne indstilling er, på den ene side, den gældende WHO klassifikation indført i 2004. Ifølge WHO, underklassificering af NSCLC skal foretages hovedsageligt ved hematoxilin-eosin (H E sektioner alle tumorer blev omklassificeret selvstændigt af tre erfarne patolog (GK, AC, MW) i henhold til den gældende WHO klassifikationen [2]. Ingen immunhistokemiske farvningsresultater var blevet taget i betragtning ved denne omklassificering. 5 disharmoniske og vanskelige sager, igen, gennemgås og drøftes i fællesskab. Ved tilstedeværelsen af ​​WHO kriterier, blev konsensus defineret for yderligere analyser. TNM-etaper blev ensartet revurderet efter den nuværende UICC klassifikation (7

th udgave) [15]. For at eliminere fordomme, histologisk omklassificering og UICC genopsætning af alle tilfælde blev udført forud for immunhistokemiske procedurer og deres evaluering. Fra alle patienter, klinisk-patologiske data, herunder rygevaner og var til rådighed samlet overlevelse (tabel 1).

væv multi-arrays (TMA) blev konstrueret ved at tage tre kerner af hver tumor tilfældigt fra tre forskellige fjerntliggende områder. Core diameter var 2 mm. I H DAKO forestiller FLEX +, kode 8012). Endelig blev objektglassene kontrastfarvet med hematoxilin. Proceduren for farvning blev udført på en DAKO Autostainer for alle dias (detaljeret trin-for-trin-protokol Document S1).

Evaluering af den multi-antistof-assay

I synopsis med den histologiske vækstmønster en kombineret histologisk-IHC diagnose for hver kerne blev foretaget i overensstemmelse med de i foreslåede IASLC retningslinjer [9]: Herved klare kirtel vækstmønstre definerede LAC uafhængig af ekspressionen af ​​IHC markører. Det samme blev defineret for SCC, hvis ceratinization og /eller intercellulære broer var til stede. I tumorer uden konkret morfologiske H 0,001; korrelationskoefficient -0,300; Kendall-tau-b). Signifikant negativ korrelation kunne også påvises for TTF1 og P63 (p 0,001; korrelationskoefficient -0,262; Kendal-tau-b). Ingen andre positive eller negative inter-antistof-korrelationer blev detekteret. Disse resultater understøtter yderligere, at farvning mønstre og evaluering af hvert antistof er ikke kompromitteret af potentiel baggrund farvning eller kromogen krydsreaktioner. Ikke desto mindre, nukleare og /eller cytoplasmatisk dobbelt positivitet afspejler specifikke farvning for begge antigener, jeg. e. TTF1 kombineret med P63 og vimentin kombineret med neuroendokrine markører henholdsvis er stadig tydeligt adskiller (figur S2).

Normalt lungevæv (A), LAC (B), SCC (C) og LCNEC (D) farves med den kombinerede multi-antistof-assay (øverst) og hver enkelt inkluderet antistof. Røde kerner – TTF1; rød cytoplasma – vimentin; brune kerner – P63; brun cytoplasma – neuroendokrine markører. Under bi-colour IHC assay tilsvarende enkelt antistofanalyser vises i samme tumor område. Sammenligning af hvert enkelt antistof farvning og bi-farve multi antistof assay viser analog specifik positivitet i de samme celler og afslører ikke nogen uspecifik baggrundsfarvning eller kromogene krydsreaktivitet.

TTF1 og P63 er nyttige markører til vurdering af afstamning differentiering

den nuværende WHO klassifikation foreslår H tabel S1). Både, TTF1 og P63 afslørede meget signifikante resultater for klassificering af LAC og SCC, (p 0,001; tabel S1). Som forventet, AUC værdier var højere i IHC algoritme klassificering i forhold til H 0,001; korrelationskoefficient -0,262; Kendall-tau-b)

intratumoral heterogenitet er mindre fremtrædende i IHC markører. sammenlignet med morfologisk vækstmønstre

Som heterogenitet tumor morfologi er kendt for at være høj i NSCLC vi inkluderet tre TMA kerner af hver tumor. Disse kerner blev taget tilfældigt om tumor område at udelukke morfologiske bias. Som offentliggjort og internationalt accepteret, kan antages analyse af hvert TMA kerne kan sammenlignes med analyse af tumor biopsier i rutinemæssig diagnostisk patologi [20], [21]. Hvad angår diagnostiske veje i histopatologi, vi først klassificeret hvert TMA kerne i en rutinemæssig H . E morfologi, alene

Yderligere IHC analyser hæve diagnostisk nøjagtighed sammenlignet med konventionel H figur S5). På morfologisk evaluering, alle disse LCNEC sager derudover viste neuroendokrine vækstmønstre. Ved brug af kombineret IHC klassifikation LCNEC kan derfor diagnosticeres i et sofistikeret og standardiseret måde.

Kombineret morfologisk og multi-antistof-klassifikation i forbedrer kliniske betydning af NSCLC subtypning

Forskellige biologiske opførsel af maligne sygdomme er normalt afspejles i forskellige udfald i langsigtet opfølgning. At vurdere, om der er en bedre lagdeling ved anvendelse af en kombineret histologisk og IHC klassificering, gennemførte vi overlevelse analyser for begge klassifikationer, i. e. konventionelle H D) .

Bi-farve multi-antistof-assay sparer væv og økonomiske ressourcer

protokol, der bruges her til immunhistokemisk klassificere NSCLC består af en samtidig pletten med 6 forskellige antistoffer. Mængden af ​​væv nødvendigt til karakterisering af NSCLC biopsier omfatter således kun 16,7% i forhold til den, der er nødvendig for 6 enkelt antistof-assays. Derfor kun 1/6

th af glas sildes og dækglas er nødvendige. Da protokollen bruger antistof-blandinger af TTF1 og vimentin samt P63 i kombination med neuroendokrine cocktail, er der behov for 1/3

rd af farvning og blokerende reagenser. Det samme gælder for chromogene detektion hætteglas. På vores institution, er udgifter til reagenser beregnet til 3,30 € plus yderligere 0,20 € for objektglasset pr IHC pletten. I tal pr tilfælde resulterer dette i et samlet beløb på 6,80 € for vores multi-antistof-assay i forhold til 21,80 € for 6 enkelt antistof protokoller. Således brug af vores multi-antistof-assay sparer op til 68,8% af udgifter til laboratoriereagenser.

På grund af doublestaining procedure dog overordnet nødvendige tid til at færdiggøre protokollen tager ca. 4 timer i forhold til 1,5 til 2 time for enlige antistof pletter. Men, som let kan etableres protokollen om automatiserede immunhistokemiske farvning maskiner, ingen negativ effekt på arbejdsbyrden for laboranter opstår. Tværtimod, farvning automatisering er langvarig og teknikere kan udrette mere komplekse og tidskrævende opgaver under denne procedure. Derudover er tid til dias sortering helt udeladt.

For at diagnosticere patolog skal evalueres kun ét dias. Herved kan alle ICH farvede mønstre vurderes parallelt og endnu vigtigere i de samme celler. Mikroskopiske slides behøver ikke at blive ændret og diagnostiske områder, der ikke skal flyttes. Som diagnostiske evaluering gange i diagnostisk patologi er meget variabel, kan mængden af ​​tid sparet ved at bruge vores multi-antistof-assay kun skønnes. Ifølge vores erfaringer multi-antistof-assay sparer cirka to tredjedele af den nødvendige tid til evaluering af de tilsvarende 6 enkelt antistof pletter.

Diskussion

Worldwide, lungekræft er den største dødsårsag blandt alle ondartede sygdomme [1], [22]. Selv om der har været fremskridt i moderne kræftbehandling, har dødeligheden af ​​NSCLC patienter ikke ændret sig væsentligt i løbet af de seneste årtier [1], [2], [22]. Med udviklingen af ​​forskning i personlig ledelse kræft, har flere biomarkører blevet tilskrevet en prædiktiv værdi for specifikke kemoterapeutiske stoffer [23] – [27]. Scagliotti et al. beskrev en fordel af gemcitabin i en platin-baserede kemoterapeutiske ordning for patienter med fremskreden NSCLC hvis histologi viste en fremherskende skællede differentiering. Desuden patienter, hvis histologi viste en fremherskende LAC differentiering havde en større fordel, hvis de får pemetrexed [3]. Derfor er anbefalinger til kemoterapeutiske regimer nu baseret på histologisk differentiering af NSCLC og er blevet implementeret i flere nationale retningslinjer NSCLC behandling [4] – [6]. I den nuværende WHO klassifikation, er histologisk typning af lungekræft 1) vid udstrækning baseret på standard H & E farvning og 2) skal histopatologisk undersøgelse af resektion prøver, især have for øje, at næsten 50% af lungekræfttilfælde udviser mere end én større histologisk undertype [2]. På den anden side er arbejdet i Scagliotti baseret på en kohorte af NSCLC-patienter diagnosticeret i avanceret UICC trin III B og IV. Her histologiske typning skal foretages på små vævsprøver, som for det meste resektion prøver er ikke tilgængelige i disse patienter. Derfor har IHC markører og paneler blevet foreslået af flere forfattere til subtypning af NSCLC [8], [28], [29]. Blandt disse TTF1 til påvisning af glandulær og P63 for pladedifferentiering synes at være de mest pålidelige markører for underklassificering af NSCLC [8], [9]. Af disse grunde, vi valgte TTF1 og P63 som markører for afstamning differentiering i NSCLC, og etableret en diagnostisk sti kombinerer konventionelle morfologi og IHC ekspressionsmønstre analogt til forslag fra [9] IASLC. Senest har den afkortede P63 protein DeltaNp63 (p40) blevet beskrevet at have en højere specificitet for skællede differentiering i forhold til den fulde længde protein [XPATH FEJL:. Ukendt variabel “START2”], [31]. Men begge antigener, fuld længde P63 og DeltaNp63, har den samme følsomhed for planocellulært karcinom [30], [31]. Da udtryk for P63 diagnostisk evalueres efter TTF1 (figur 2), kan det antages, at begge antistoffer ville give de samme klassificering resultater i vores multi-antistof-assay. Hvis du vil medtage LCNEC, vi udvidet vores antistof panel ikke kun med vimentin, der kan tjene som en markør for sarcomatoid karcinom [8], men også med neurendocrine markører (CD56, synaptophysin, Chromogranin A). Positivitet af en eller flere af disse markører er påkrævet til diagnosticering af neuroendokrine differentiering [2]. For at skåne finite væv af biopsi materiale, vi med succes gennemført en bi-farve multi-antistof-farvning assay, som ikke kun tillader samtidig farvning af 6 antistoffer på samme vævssnit, men også veritabel samtidige evaluering. For at demonstrere, at der ikke er nogen interferens mellem antistofferne, er der foretaget en række validering eksperimenter: En test sæt blev farvet med vores multi-antistof-assay og serielle snit er blevet farvet med hvert antistof, individuelt. Her kunne ingen forskelle i farvningsmønstre eller kromogen baggrund reaktioner observeres (figur 2, figur S1). For at undersøge mulig cross-farvning af den anden DAB-baseret påvisningssystem assayet blev udført på testsættet mens udelade den anden primære antistoffer (P63, Chromogranin A, synaptophysin, CD56). Hvis frie og /eller tilgængelige bindingssteder af de første antistoffer blev eksisterende, ville disse være synlig i brun farve. Gennemgå de farvede objektglas, disse forsøg beviser, at alle bindingssteder af den første primære antistoffer (vimentin, TTF1) blokeres af AEC-baseret påvisningssystem som ingen brown DAB farvning var synlig (figur S1). Ej heller kunne vi belyse nogen positiv statistisk sammenhæng mellem antistofferne bliver visualiseret ved samme kromogene påvisningsmetode. Hvis der var baggrund farvning, enten nukleare eller cytoplasmatisk af tilsvarende markører, der fører til falsk fortolkning, ville det have vist sig i positive statistiske sammenhænge. Tværtimod vi opdaget statistisk signifikant negativ korrelation af P63 med neuroendokrine markører, samt med TTF1. For nylig, Sterlacci et al etableret dobbelte pletter bestående af TTF1 /CK7, P63 /CK5 /6 og TTF1 /CK5 /6 for klassificering af NSCLC og afslørede resultater ligner vores [10]. Yanagita et al. har offentliggjort en kommercielt tilgængelig multi-antistof-assay indeholder 4 antistoffer, TTF1, napsin A, P63 og CK5 /6 [11]. Disse tidligere etablerede antistof cocktails vise sig at være nyttig, men kun tjener til at skelne LAC fra SCC. Muligheden for at undersøge for LCNEC tages ikke i betragtning. Men især denne enhed i LCNEC bebor ikke kun en infavourable prognose, men kemoterapeutiske regimer svarende til dem, der anvendes i SCLC skal overvejes [14]. I den nuværende litteratur, LCNEC kun at blive diagnosticeret hvis NSCLC viser neuroendokrine vækstmønstre i kombination med ekspression af mindst en af ​​de neuroendokrine markører CD56, chromogranin A eller synaptophysin [2].