PLoS ONE: synergistiske virkninger af Apigenin og Paclitaxel på apoptose af cancerceller

Abstrakt

Baggrund

Det var velkendt, at den kliniske anvendelse af kemoterapeutiske stoffer er begrænset af alvorlige bivirkninger og narkotika modstande. Derfor er det nødvendigt at finde ud af en strategi for at øge den specifikke anti-tumor effektivitet kemoterapeutiske lægemidler. Apigenin, en slags flavonoider, er blevet rapporteret at besidde anticancer aktiviteter med meget lav cytotoksicitet til normalt væv.

Metodologi /vigtigste resultater

Vores resultater fra celleviabilitetstest, western-blots og TdT -medieret dUTP-biotin nick endemærkning (TUNEL) assay demonstrerede de synergistiske pro-apoptotiske virkninger af en lav dosis af apigenin og paclitaxel i humane cancercellelinier. For at analysere den underliggende mekanisme, vi undersøgte reaktive oxygenarter (ROS) farvning efter celler blev behandlet med en kombination af apigenin og paclitaxel, eller hver af dem alene. Data fra flow-cytometri viste, at superoxider men ikke reduktion af peroxider akkumuleret i HeLa-celler behandlet med apigenin eller en kombination af apigenin og paclitaxel. Apigenin og paclitaxel-induceret HeLa celle apoptose var relateret til niveauet af ROS i cellerne. Vi vurderes yderligere aktivitet og protein niveau af superoxiddismutase (SOD). Apigenin hæmmede markant SOD aktivitet, men ændrede ikke den SOD proteinniveauet antyder, at apigenin fremmet ROS ophobning gennem undertrykke enzymaktivitet af SOD. Tilsætning af Zn

2+, Cu

2+ og Mn

2+ til celle lysater hæmmede apigenin virkning på SOD aktivitet. Samtidig, data fra caspase-2 overekspression og bankede-down forsøg viste, at caspase-2 deltog i apigenin og paclitaxel-induceret HeLa celle apoptose.

Konklusioner /Signifikans

Taget sammen, vores undersøgelse viste, at apigenin kan sensibilisere cancerceller for paclitaxel apoptose gennem undertrykke SOD-aktivitet, som derefter førte til akkumulering af ROS og spaltning af caspase-2, hvilket antyder, at den kombinerede anvendelse af apigenin og paclitaxel var en effektiv måde at reducere den dosis af paclitaxel taget

Henvisning:. Xu Y, Xin Y, Diao Y, Lu C, Fu J, Luo L, et al. (2011) synergistiske virkninger af Apigenin og Paclitaxel på apoptose af kræftceller. PLoS ONE 6 (12): e29169. doi: 10,1371 /journal.pone.0029169

Redaktør: Fazlul H. Sarkar, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 27, 2011; Accepteret: November 22, 2011; Udgivet: December 21, 2011

Copyright: © 2011 Xu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Nature Science Foundation of China (nr. 81.072.433 og 31.071.000), Jiangsu Major Nature Science Foundation of High Education (nr 07KJA18026) og et projekt finansieret af Priority Academic Program Udvikling af Jiangsu højere uddannelsesinstitutioner. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kemoterapi er en af ​​de mest anvendte behandlinger for cancer. Men mange kemoterapeutiske lægemidler kan producere ubehagelige bivirkninger, især når det tages i høje doser. En af de kemoterapeutiske lægemidler, paclitaxel, et mitotisk inhibitor, kan føre til overfølsomhedsreaktioner [1], neutropeni [2], neurotoksicitet [3], hjerterytmen disorder [4] og diverse andre toksiske virkninger [5], som i alvorlig grad forværrer livskvalitet kræftpatienter og resultater i dosisreduktion og afbrydelse af behandlingen. Det er derfor vigtigt at mindske de negative bivirkninger af kemoterapeutiske midler i klinisk behandling af cancer. Desuden resistens i klinisk terapi ofte forstyrrer effektiviteten af ​​kemoterapeutiske midler.

Reaktive ilt arter (ROS), herunder superoxid radikal, hydrogenperoxid (H

2O

2), hydroxyl radikal, nitrogenoxid, og forskellige nitrogenoxid-afledte reaktive nitro arter (RNS) er udformet som naturlige biprodukter af normal metabolisme af ilt i humane celler og væv. På grund af deres meget reaktive karakter, har de tendens til at blive involveret i uønskede reaktioner, der forårsager skader på celler og i sidste ende føre til sygdomme. Cancerceller udviser forøget glykolyse i kombination med en nedsat respiration og disse ændringer i metabolisme har vist sig at være associeret med øget oxidativt stress [6] – [8]. En høj celle redox status kunne stimulere tumordannelse ved at skabe en forbedret celle-proliferativ miljø, overtalelse DNA-skader, og slukke tumor undertrykkelse funktioner [9], [10]. Tumor vækst og migration kunne hæmmes

in vitro

ved ændring af miljøet omkring tumorceller til en mere reducere en. I modsætning til dette, ville en stor celle redox tilstand også støtter øget apoptose, hvilket ville hæmme tumor dannelse. Således i cancerceller, kunne den høje redoxtilstand forbedre deres tolerance for miljøbelastninger og kemoterapeutiske lægemidler. Tumor celler udtrykte et højere niveau af MnSOD indikere en dårlig prognose [11], [12]. Det er blevet vist, at ROS have potentiale evne til at behandle caspase-2 [13], [14], som er en initiator caspase førte til mitokondrisk membranpermeabilisering [15] og er også et vigtigt element i apoptose signalforstaerkning sløjfe [16]. Desuden har tidligere undersøgelser i caspase-2 slået-out-mus vist, at caspase-2 aktivering blev relateret til ROS akkumulering [17]. Reduceret apoptose rate blev også påvist i

caspase-2

– /-.

Oocytter [18]

Apigenin (4 ‘, 5, 7-trihydroxyflavone) er almindeligt indeholdt i mange frugter og grøntsager. For nylig blev det rapporteret, at apigenin havde en potentiel antitumorvirkninger på adskillige humane cancercellelinier med lav cytotoksicitet og ingen mutagen aktivitet. [19] – [21]. Apigenin kunne øge den intracellulære akkumulering af ROS og havde den pro-oxidant potentiale [22], [23] og mindske SOD aktivitet i lungekræft celler [24].

I det nuværende arbejde, vi demonstreret, at apigenin kunne sensibilisere cancerceller for paclitaxel apoptose gennem undertrykke SOD-aktivitet og fører til akkumulering af ROS og spaltning af caspase-2, hvilket tyder på den kombinerede anvendelse af apigenin og paclitaxel var effektive til cancerterapi. Salg

Materialer og Metoder

Cellekultur og transfektion

humane cervikale epitel karcinom cellelinie HeLa, human lunge epitelcarcinoma cellelinje A549, human negroid hepatocyt carcinom cellelinie Hep3B, og humane embryonale nyre 293A (HEK293A) celler opnået fra Institute of biokemi og Cell Biology, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, PR China), blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (Invitrogen) indeholdende 10% føtalt kalveserum (Hyclone) og antibiotika (100 ug /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin) med 5% CO

2 ved 37 ° C. Transient transfektion blev udført med en modificeret calciumphosphat-metoden eller ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. I alle tilfælde blev den samlede mængde DNA normaliseret ved de tomme kontrol plasmider.

Antistoffer, regenter og DNA-konstruktioner

Mus monoklonalt antistof mod Flag-tag blev købt fra Sigma. Kanin polyklonale antistoffer mod poly ADP-ribose polymerase (PARP), blev caspase-3 og β-actin opnået fra Cell Signaling Technology. Muse polyklonalt antistof mod caspase-2 kom fra Santa Cruz Biotechnology. Kanin polyklonale antistoffer mod kløvet caspase-3 kom fra Bioworld Technology, Inc. Mouse monoklonalt antistof mod SOD1 og kanin polyklonale antistoffer mod SOD2, blev Endo G og AIF opnået fra Abcam. Caspase-2-inhibitor benzyloxycarbonyl-Val-Asp (OMe) -Val-Ala-Asp (OMe) -fluorom ethylketon (z-VDVAD-FMK) blev opnået fra Calbiochem. ROS detektionsreagenser (CM-H

2DCFDA og dihydroethidium (DHE)) og apoptotiske afsløre regent (FITC-Annexin V og propidiumiodid-buffer) var fra Molecular Probes ™ (Invirogen). Dimethylsulfoxid var fra Amresco. Apigenin, paclitaxel og DETC blev indkøbt fra Sigma.

pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT) og pRNAU6-caspase2 blev konstrueret ved anvendelse af standardteknikker. pcDNA3.1 blev fordøjet med Xhol og Kpnl. De primere (sense: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG) var designet til at generere pcDNA3.1-flag-caspase2 (WT).

Caspase-2 Hotel (NM_032982.2) genet blev syntetiseret af Invitrogen. pRNAU6 blev fordøjet med Bam HI og Hind III, og de annealede målretning oligonukleotider ACAGCTGTTGTTGAGCGAA for

caspase-2

blev ligeret ind i vektoren [25].

Cellelevedygtighed og TUNEL-assay

for at evaluere paclitaxel-induceret cytotoksicitet, blev Kolorimetrisk Cytotoksisk 96-radioaktiv cytotoksicitet assay (Promega) udført ifølge producentens protokol. Cellelevedygtigheden blev påvist ved måling af endogene lactatdehydrogenase kvantitativt.

TdT-medieret dUTP-biotin nick endemærkning (TUNEL) assay blev udført i HeLa-celler ved hjælp Guava® TUNEL Kit som tidligere beskrevet [26]. Cellerne blev detekteret på en Guava EasyCyte ™ System, og data blev analyseret ved anvendelse af Guava TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). Alle analyser blev udført for tre gentagelser.

Annexin V /PI assay

Annexin V /PI assay, ved hjælp af annexin V /PI dobbelt farvning af ikke optagne celler, skelner mellem tidlige apoptotiske celler og sent apoptotiske /nekrotiske celler. Både flød og vedhæftede celler blev suspenderet i 500 pi bindingspuffer (10 mM Hepes, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2, 0,1% BSA). Annexin V-FITC (5 pi) og PI (5 pi) blev derefter tilsat til hver prøve. Efter 15 minutters inkubering i mørke, blev flowcytometrisk analyse udført ved hjælp af Guava EasyCyte ™ System. For hver prøve blev analyseret 5000 celler. Data blev analyseret ved anvendelse af Guava TUNEL Software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA).

ROS påvisning

HeLa-celler blev podet i plader med 6 brønde, og efter 24 timer blev celler inkuberet med ROS specifikke farvestoffer, dihydroethidium (DHE, 5 uM) eller CM-H

2DCFDA (5 uM), i 30 minutter. Celler blev efterfølgende behandlet med apigenin (15 uM), paclitaxel (4 nM) eller dem begge i yderligere 30 minutter. ROS blev påvist ved hjælp af en Guava EasyCyte ™ og analyseret med Guava Express Pro Software (Guava Technologies, Hayward, CA, USA). DHE blev fundet under en emission inden 580-583 nm (PM1) og CM-H

2DCFDA blev fundet under en emission på 525 nm (PM3).

Isolering af mitokondrier og måling af mitokondrie membranpotentiale ( MMP)

Intact mitochondriet blev separeret fra cytosolisk komponent i HeLa-celler til yderligere protein analyse under anvendelse Mitokondrier Isolation Kit fra Thermo-Pierce Dounce homogenisering og differentialcentrifugering blev udført ifølge producentens protokol.

mitokondrie membran potentiale (MMP) af HeLa-celler blev målt ved hjælp af Guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit (Guava Technologies, Hayward, CA, USA) i henhold til fabrikantens anvisninger. Fluorescens-baseret farvestof 5, 5 ‘, 6, 6′-tetrachlor-1, 1’, 3, 3 ‘-tetrethyl benzimidalyl carbocyanin iodid (JC-1) blev anvendt til at evaluere MMP ændringer. Cellen impermeabel farvestof 7-AAD blev anvendt til samtidig monitorering cellemembranpermeabilitet ændringer. Farvede celler blev analyseret på en Guava EasyCyte ™ System.

Assay af superoxiddismutase-aktivitet

Enzymaktiviteten af ​​SOD i HeLa-celler blev målt ved anvendelse af kommercielle kits ifølge producentens protokol. I dette assay blev tetrazoliumsaltet anvendes til påvisning af superoxidradikaler genereret af xanthinoxidase og hypoxanthin. Til måling MnSOD aktivitet, blev cellelysater centrifugeret ved 10.000 x g for at separere MnSOD fra CuZnSOD, og ​​CuZnSOD blev inhiberet i nærvær af kaliumcyanid.

RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret ved hjælp af høj Pure RNA Isolation Kit (Roche) ifølge protokollen beskrevet af producenten. RT-PCR blev udført under anvendelse af M-MLV revers transkriptase (Invitrogen) med angivne primere (

caspase-2

, sense: TTTTCTCGAGACCATGGACTACAAGGACGACGATGATAAGGCGGCGCCGAGCGCGGGGT, anti-sense: ATATGGTACCTCATGTGGGAGGGTGTCCTG; GAPDH, sense: CATATGGGGAAGGTGAAGGTCGGAGTC, anti-sense: GAATTCTTACTCCTTGGAGGCCATGTGG). PCR blev udført ved Tm på 58 ° C i 30 cykler i reaktionsblandingen af ​​25 ml individuelt for hvert protein. PCR-produkter blev derefter resolveret på 1% agarosegeler og farvet med ethidiumbromid. Huset holder genet GAPDH blev anvendt som kontrol.

Western-blot-analyse

Cellelysater blev centrifugeret (15.000 g) ved 4 ° C i 15 min. Western blot-analyse blev udført som tidligere beskrevet [27]. Antistof-antigen-komplekser blev visualiseret ved LI-COR Odyssey Infrarød Imaging System ifølge fabrikantens instruktioner ved anvendelse IRDye800 Fluorofor-konjugeret antistof (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE).

Bestemmelse af Synergi

kombinationen lægemiddel blev bestemt ved Chou-Talalay-metoden. CI blev beregnet af Chou-Talalay ligningen, der tager hensyn til både styrken (IC

50 eller D

m) og den skarpe af dosis-effekt-kurve (m værdi) [28], [29 ]. Den klassiske isobolgram (CI = 1) er givet ved: (A)

I nævnere, (D

x)

1 og (D

x)

2 er koncentrationer for D

1 (apigenin) og D

2 (paclitaxel) anvendes alene, der giver hæmning x%, mens der i de tællere, (D)

1 og (D)

2 er doserne af apigenin og paclitaxel anvendes i kombination, isoeffectively inhiberer x%. CI 1, CI = 1, og CI . 1 tyder synergisme, additiv og antagonisme henholdsvis

Fra median-effekt ligning af Chou og Chou et al. [29], [30], (D

x)

1 og (D

x)

2 kan let beregnes. (B)

Her D

m er medianen-effekt dosis, som fås fra anti-log af X-skæringspunktet for median-effekt plot, X-log (D) versus Y = log [f

a /(1-f

a)] eller D

m = 10

– (Y-skæringspunkt) /m, og m er hældningen af ​​median-effekt plot. Automatiseret beregning af m, D

m, D

x, og Cl-værdier er også tilladt med computersoftware.

Statistisk analyse

Data var repræsenteret som middelværdi ± SD. T-test blev anvendt til at analysere den statistiske signifikans af varians parvis sammenligning. I alle analyser, P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Kombinationsbehandling af apigenin med paclitaxel markant forbedrer cytotoksicitet til humane kræftceller

Siden toksicitet af paclitaxel er. koblet til dets antitumoraktivitet og apigenin er blevet rapporteret at have antitumorvirkning med lav toksicitet, vi først observeret co-virkninger af comcination paclitaxel med apigenin. HeLa-celler blev behandlet med forskellige doser af apigenin, paclitaxel eller dem begge, og derefter blev påvist cellen levedygtighed. Som vist i fig. 1A og B, både apigenin og paclitaxel dosisafhængig cytotoksicitet med ca. 29% reduktion af cellelevedygtighed induceret af apigenin i en dosis på 25 uM (fig. 1A) og 24% reduktion induceret af paclitaxel i en dosis på 10 nM (fig. 1B) henholdsvis. Da vi behandlede HeLa-celler med 15 pM apigenin og 4 nM paclitaxel, blev påvist over 50% reduktion af cellelevedygtighed, imidlertid var mindre end 20% fald i cellelevedygtighed observeret i celler behandlet med apigenin eller paclitaxel (fig. 1C). Vi udførte Chou-Talalay beregning at bekræfte synergistiske virkninger af apigenin og paclitaxel på HeLa-celler. Kombinationen index (CI) var 0,3918 ± 0,0436 i en dosis på 15 uM apigenin og 4 nM paclitaxel indikerer synergistiske virkninger af apigenin og paclitaxel. Disse resultater viste en signifikant øget cytotoksicitet når apigenin og paclitaxel blev administreret til HeLa-celler samtidigt. Også vist i fig. 1C, kombination af apigenin med paclitaxel inducerede lignende resultater i andre end Hela celler, herunder Hep3B og A549 celler kræftceller. Men 15 uM apigenin, 4 nM paclitaxel eller deres kombination, ikke resultere i cytotoksicitet til HEK293A celler (fig. 1C). Disse data antydede der var synergistiske virkninger af apigenin og paclitaxel til specifikt at dræbe cancerceller

A blev HeLa-celler behandlet med forøgede koncentrationer af apigenin (0-100 uM) i 24 timer. Celle vitalitet blev målt. Forsøget blev uafhængigt gentaget tre gange, og data blev vist som middelværdi ± SD. B, HeLa-celler blev behandlet med forøgede koncentrationer af paclitaxel (0-50 nM) i 24 timer. Celle vitalitet blev detekteret og analyseret som beskrevet i A. C, HeLa, A549, Hep3B og HEK293A celler blev underkastet behandling med apigenin (15 uM) kombination med paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Celle vitalitet blev detekteret som beskrevet i A. D, blev HeLa-celler behandlet med apigenin eller paclitaxel henholdsvis desuden i andre grupper blev apigenin tilsat til HeLa-celler 2 timer før eller efter paclitaxel behandling eller apigenin og paclitaxel blev tilsat til HeLa-celler på samme tid. TUNEL-farvning blev udført og påvist med et Guava® TUNEL Kit. Numbers afbildet procenten af ​​TUNEL-positive celler. E, Celler blev enten efterladt ubehandlede eller behandlet som tidligere beskrevet i D. På det angivne tidspunkt blev celler farvet med annexin V /PI farvestof. Analyser blev udført på 5.000 celler i hver sti. F, HeLa-celler blev behandlet med forøgede koncentrationer af apigenin eller paclitaxel henholdsvis eller begge i 24 timer. Derefter cellelysaterne blev underkastet Western blot for at bestemme proteinindholdet af caspase-3 og PARP. V betegner køretøj (dimethylsulfoxid). * P 0,05 sammenlignet med ubehandlet gruppe; ** P. 0,01 sammenlignet med ubehandlet gruppe

Det er blevet rapporteret, at både paclitaxel [31], [32] og apigenin [21] kan inducere celle apoptose. Vi næste kontrollere, om kombinationen brug af apigenin og paclitaxel kunne fremkalde mere akut apoptose i HeLa-celler. I forhold til de grupper, der er behandlet med apigenin eller paclitaxel individuelt viste apigenin og paclitaxel co-behandlede grupper flere TUNEL positiv farvning celler. Satserne for TUNEL positiv farvning celler blev især steget fra 17,95% i paclitacel behandlede gruppe og 19,65% af apigenin behandlede gruppe til omkring 40% i grupperne behandlet med en kombination af dem (fig. 1D). For at kvantificere apoptose blev FACS analyse efter farvning af celler med FITC-annexin-V plus propidiumiodid (PI). Data vist i fig. 1E viste, at antallet af overlevende celler faldt gradvist efter co-behandling med apigenin og paclitaxel og kun mindre end 60% blev overlevede 24 timer efter apigenin og paclitaxel behandling.

Da aktivering af caspaser er en vigtig årsag til apoptose yderligere opdaget vi de spaltninger af caspase-3 og PARP anvendelse af Western blot-analyse. Som vist i fig. 1F, både de spaltninger af caspase-3 og PARP blev forbedret betydeligt ved apigenin /paclitaxel co-behandling sammenlignet med apigenin eller paclitaxel-behandling alene. Disse resultater bekræftede, at apigenin /paclitaxel samtidig behandling inducerede betydelig apoptotisk død HeLa-celler antyder, at kombinationen brug af apigenin og paclitaxel ville producere en bedre antitumorvirkning end anvendelse af apigenin eller paclitaxel alene.

ROS produceres ved apigenin er afgørende for apigenin /paclitaxel-induceret HeLa celle apoptose

mellemtiden flavonoider herunder apigenin blev bredt anerkendt som antioxidanter, deres pro-oxidant egenskaber er også blevet rapporteret [33]. Vi spekulerede anticancer virkninger af kombinationen apigenin /paclitaxel kan være relateret med produktion af ROS i HeLa-celler induceret af apigenin. Derfor observerede vi niveauerne i HeLa-celler behandlet med med apigenin, paclitaxel eller dem begge. To ROS-specifikke farvestoffer, DHE og CM-H

2DCFDA viste superoxid arter og H

2O

2 i target-celler henholdsvis [24]. CM-H

2DCFDA primært oxideres af hydrogen peroxid (H

2O

2) og hydroxyl radikal, er DHE oxideres af superoxidanioner (O

2

-). HeLa-celler blev farvet med DHE og CM-H

2DCFDA efterfulgt af flowcytometri. Som vist i fig. 2, DHE-specifik ROS forøget (fig. 2A), mens CM-H

2DCFDA-specifik ROS reduceret (fig. 2B) i HeLa celler behandlet med apigenin inden for de 30 minutter. Ingen ændring blev påvist i celler behandlet med paclitaxel alene. En lignende tendens og en mere betydelig ændring i ROS “status blev observeret i de celler behandlet med kombination af apigenin og paclitaxel sammenlignet med celler behandlet med apigenin alene (fig. 2). DHE-farvning observeret i disse eksperimenter resulterede fra oxidationen af ​​superoxid-arter tyder på, at apigenin øget superoxid specie relateret ROS i HeLa-celler.

A, blev HeLa-celler behandlet med apigenin (15 uM) alene eller sammen med paclitaxel (4 nM), for angivne perioder. DHE (5 uM) blev tilsat til cellekulturer 30 minutter før behandlingen. DHE-farvning i celler blev påvist og analyseret ved Guava EasyCyte ™ System. DHE farvning i ubehandlede celler blev anvendt som negativ kontrol. B, blev CM-H

2DCFDA (5 uM) farvning udført og analyseret som beskrevet i A.

Næste vi vurderet, om apigenin /paclitaxel-induceret apoptose var afhængig af ROS akkumulation. N-acetyl-L-cystein (NAC), en brønd godkendt ROS scavenger, er blevet anvendt til at antagonisere virkningen af ​​ROS. Forbehandling af HeLa-celler med 100 pM NAC undertrykkes effektivt generering af superoxid arter (fig. 3A) og signifikant inhiberede celle apoptose induceret af apigenin og paclitaxel co-behandling (fig. 3B). Ovenstående data antydede, at ROS været nødvendige for apigenin /paclitaxel-induceret HeLa celle apoptose.

Celler blev derefter opsamlet og påvises ved Guava EasyCyte ™ System som beskrevet i fig. 2A. B, blev HeLa-celler behandlet med NAC (100 uM) i 2 timer og derefter inkuberet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Celle apoptose blev målt ved TUNEL-assay som beskrevet i fig. 1.

Apigenin inducerer ROS akkumulering gennem undertrykke aktiviteten af ​​SOD

Vi observerede, at efter HeLa-celler blev behandlet med apigenin, overflod af superoxid arter steget, mens H

2O

2 faldt. I betragtning af SOD var en cellulær enzym, der kan konvertere superoxid til H

2O

2, spekulerede vi, at apigenin kunne reducere aktiviteten af ​​SOD og dermed førte til akkumulering af superoxid arter. Vi derefter undersøgte virkningen af ​​apigenin på proteinniveau samt enzymaktivitet SOD. En signifikant undertrykkelse af både CuZnSOD (SOD1) og MnSOD (SOD2) aktivitet blev observeret i HeLa-celler inden for 30 minutter efter apigenin eller apigenin /paclitaxel men ikke paclitaxel behandling (fig. 4A). Der var imidlertid ingen synlig ændring observeret i proteinniveauet af CuZnSOD og MnSOD efter apigenin administration (fig. 4B). Følgelig var det bevismateriale, at apigenin undertrykt SOD-aktivitet og således inducerede akkumulering af ROS.

A, blev HeLa-celler behandlet med apigenin (15 uM), paclitaxel (4 nM), eller dem begge i 30 minutter . SOD-aktivitet blev målt med Cayman SOD detektion kit. Forsøget blev uafhængigt gentaget tre gange, og data blev vist med middelværdi ± standardafvigelse. * P 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen; ** P 0,01 sammenlignet med kontrolgruppen. B, HeLa-celler blev behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 30 minutter. Cellelysater blev underkastet Western-blot Protein at bestemme niveauer af SOD1 og SOD2. C, HeLa-celler blev behandlet med apigenin (15 uM) i 30 minutter og lyseret ved lydbehandling. Cellelysater blev derefter inkuberet med CuCl

2 (8 uM), ZnCI

2 (8 uM) og MnC

2 (8 uM) i 30 minutter på is. SOD-aktivitet blev målt og analyseret som beskrevet i A. D, blev HeLa-celler lyseret ved lydbehandling og cellelysater blev derefter inkuberet med ovennævnte metalioner i 30 minutter på is. SOD-aktivitet blev målt som nævnt ovenfor. * P 0,05 sammenlignet med apigenin-behandlede gruppe; ** P. 0,01 sammenlignet med apigenin-behandlede gruppe

Som ovenstående resultater viste, at apigenin undertrykt SOD aktivitet, og det var blevet rapporteret, at apigenin kunne danne stabil kompleksdannelse med metalioner

in vitro

[34], vi derfor besluttet, hvis apigenin kunne danne kompleksdannelse med metalioner og undertrykke SOD aktivitet gennem forebyggelse SOD fra samle med sine cofaktorer. HeLa-celler blev behandlet med 15 pM apigenin i 30 minutter og lysaterne af celler blev inkuberet med 8 uM ZnC

2 (aq), CuCI

2 (aq) eller MnCl

2 (aq) henholdsvis is i yderligere 30 minutter. Aktiviteten af ​​SOD blev målt under anvendelse af Cayman superoxiddismutase Assay Kit, som beskrevet i Materiale og fremgangsmåder. Som forventet, apigenin betydeligt undertrykt aktiviteter både CuZnSOD og MnSOD, men aktiviteten CuZnSOD steget efter Cu

2+, Zn

2+, og Mn

2+ eksponering og aktiviteten af ​​MnSOD steg også tydeligvis efter Mn

2+ eksponering (fig. 4C). Derudover blev der ikke fundet signifikant ændring af SOD aktivitet, når cellelysater blev direkte udsat for Cu

2+, Zn

2+ eller Mn

2+ uden apigenin behandling (fig. 4D), hvilket indikerer, at disse metal ioner ikke forbedre basale SOD activity.These resultater antydede, at apigenin undertrykt SOD aktivitet sandsynligvis gennem at danne en stabil kompleksdannelse med disse metaller i celler [34], og apigenin kan have højere bindingsaffinitet til Mn

2+.

reduktion SOD-aktivitet er kritisk i apigenin /paclitaxel-induceret apoptose

apigenin inhiberede aktiviteten af ​​SOD og kombination af apigenin /paclitaxel var mere effektivt inducerer apoptose af cancerceller end hver af dem alene. For at bekræfte, at apigenin-induceret fald i aktiviteten af ​​SOD var kritisk ved apoptose udløst af apigenin /paclitaxel co-behandling, observerede vi paclitaxel-induceret apoptose efter blokering SOD enzymaktivitet. DETC (diethylthiocarbamat), en brønd godkendt inhibitor af både CuZnSOD og MnSOD blev påført i vores nuværende undersøgelse [35]. Så ens som apigenin, DETC undertrykt aktiviteten af ​​SOD og forbedret paclitaxel induceret apoptose samt (fig. 5A). Disse data kraftigt antydet, at reduktionen af ​​SOD-aktivitet ved apigenin er kritisk i styrkelsen af ​​paclitaxel-induceret apoptose.

A, blev HeLa-celler inkuberet med apigenin (15 uM) /paclitaxel (4 nM) eller paclitaxel ( 4 nM) sammen med eller uden 1 mM DETC (en hæmmer af SOD) i 24 timer og derefter celler blev underkastet TUNEL-assay som tidligere beskrevet. B, blev HeLa-celler forbehandlet med NAC (100 uM) i 2 timer, efterfulgt af behandling med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Spaltning af caspase-2 blev påvist ved Western-blot-analyse med kontrol af β-actin. C, HeLa-celler blev forbehandlet med z-VDVAD-fmk (25 pM), en specifik inhibitor af caspase-2, og derefter blev behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer. Proteinniveauer af spaltet PARP og procaspase-3 blev detekteret ved Western-blot-analyse. D, HeLa-celler blev forbehandlet med z-VDVAD-fmk (25 pM) i 30 minutter og derefter blev behandlet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 8 timer. Celler blev derefter høstet og mitochondriemembranpotential blev detekteret under anvendelse af et Guava EasyCyte ™ MitoPotential Kit og analyseret ved Guava EasyCyte ™ System. MMP var viste som optælling af depolariserede celler. Forsøget blev uafhængigt gentaget tre gange, og data blev vist som middelværdi ± SD. ** P 0,01 sammenlignet med ubehandlede gruppe. E, HeLa-celler blev inkuberet med apigenin (15 uM) og paclitaxel (4 nM) i 24 timer, og derefter blev cellerne underkastet RT-PCR-analyse. GAPDH mRNA blev anvendt som hus keeper gen.

Aktivering af caspase-2 er vigtig for apigenin /paclitaxel-udløst HeLa celle apoptose

Mitokondriel vej spiller en vigtig rolle i ROS udløste apoptose [36], [37] og caspase-2 har været betragtet som den apikale caspase i mitokondrie død signalforstaerkning sløjfe [38], [39]. ROS-induceret caspase-2-spaltning og feedback amplifikation af den apoptotiske signal er også blevet undersøgt [40]. For at undersøge virkningen af ​​apigenin på mitokondrie pathway af apoptose blev caspase-2 precursor spaltning detekteret i apigenin-behandlede HeLa-celler ved Western-blot-analyse. Samtidig behandling af HeLa-celler med apigenin og paclitaxel udviste meget lavt niveau af caspase-2 precursor. Da HeLa-celler blev forbehandlet med NAC, caspase-2 precursor niveau inddrives (fig. 5B). Caspase-2-inhibitor z-VDVAD-fmk reducerede signifikant spaltningen af ​​caspase-3 og PARP i HeLa-celler behandlet med apigenin kombineret med paclitaxel (fig. 5C). MMP kan være en skadegørende handling i fældning af apoptose. Dataene i fig. 5D viste, at apigenin men ikke paclitaxel inducerede en forøgelse af depolarisering af MMP antyder vigtigheden af ​​apigenin i apigenin /paclitaxel inducerede cancercelle apoptose. Som forventet, z-VDVAD-fmk inhiberede stigningen af ​​MMP i apigenin og apigenin /paclitaxel-behandlede grupper (fig. 5D). Fig. 5E viste, at behandling af apigenin, paclitaxel eller apigenin /paclitaxel ikke ændrede mRNA niveauet af caspase-2 angiver apigenin /paclitaxel co-behandling kun steg aktivering af caspase-2.

For at bekræfte betydningen af ​​caspase- 2 i apigenin /paclitaxel-udløst mitochondriemembran permeabilisering og apoptose, vi udfører caspase-2 overekspression og knock-down eksperimenter og målt AIF, Endo G og cytochrom c frigive fra mitokondrier i HeLa-celler. Overekspression af caspase-2 væsentligt forbedret apigenin eller apigenin /paclitaxel-induceret stigning i AIF, Endo G og cytochrom c i cytoplasma fraktion og fald i AIF, Endo G og cytochrom c i mitokondrie fraktion (fig. 6A). Som forventet, caspase-2 knock-down resulterede i modsat på apigenin eller apigenin /paclitaxel inducerede ændringer af AIF, Endo G og cytochrom c i HeLa-celler (fig. 6A). Som vist i fig. 6B, over-ekspression af caspase-2 tilsyneladende forøget apigenin /paclitaxel-induceret spaltning af caspase-3 og PARP og knock-down af caspase-2 inhiberede sådan virkning af apigenin /paclitaxel. Vi næste detekterede celle vitalitet at evaluere Mediated virkning af caspase-2 på apigenin /paclitaxel udløst HeLa celle apoptose. Over-ekspression af caspase-2 forårsagede omkring 10% reduktion af celle vitalitet både apigenin og co-behandlingsgrupper, og caspase-2 tavshed signifikant øget celle vitalitet.