PLoS ONE: Identifikation og karakterisering af CDH1 Kimcellelinje Varianter i sporadisk Gastric kræftpatienter og personer med risiko for mavekræft

Abstrakt

Målsætning

For at screene og karakterisere germline varianter for E-cadherin

(CDH1)

i ikke-arvelige gastrisk cancer (GC) patienter og i fag på risiko for GC.

Metoder

59 GCS, 59 første slægtninge (FDRs) i GC, 20 autoimmune metaplastisk atrofisk gastritis (AMAGs) og 52 bloddonorer (BDS) blev analyseret for

CDH1

ved direkte sekventering, strukturel modellering og bioinformatik. Funktionel virkning på splejsning blev vurderet for intron-mutationer. E-cadherin /β-catenin immunhistokemisk farvning og E-cadherin mRNA kvantificering ved hjælp af RT-PCR blev udført

Resultater

I GC’ers, 4 missense varianter (p.G274S,. P.A298T; p.T470I, p.A592T), en mutation i 5’UTR (-71C G) og en mutation i intron IVS12 (c.1937-13T C) region blev fundet. Først patogene effekt af p.A298T mutation blev forudsagt af protein 3D-modellering. Den nye p.G274S mutation viste en ingen klar funktionel betydning. Desuden første, intron IVS12 (c.1937-13T C) blev mutation påvist at medføre en afvigende

CDH1

udskrift med exon 11 sletning. Denne mutation blev fundet i 2 GC’er og i 1 BD. I FDRs, vi identificeret 4 varianter: det polymorfe (p.A592T) og 3 mutationer i uoversatte regioner med uidentificeret funktionel rolle bortset 5’UTR (-54G C), der var blevet anset for at mindske

CDH1

transkription. I AMAGs, vi har registreret 2 ændringer: 1 missense (p.A592T) og en roman variant (IVS1 (c.48 + 7C T)) uden effekt på

CDH1

splejsning. Flere tavse og polymorfe udskiftninger blev fundet i alle de undersøgte grupper.

Konklusioner

Samlet vores undersøgelse forbedrer den nuværende karakterisering af

CDH1

mutationer og deres funktionelle rolle i GC og hos personer med risiko for GC. Mutationer fundet i utranslaterede områder og data om splejsning effekter fortjener en særlig opmærksomhed som er forbundet med en reduceret E-cadherin beløb. Nytten af ​​

CDH1

screening, ud over identifikation af andre risikofaktorer, kan være nyttige for tidlig påvisning af GC i fag på risiko (dvs. FDRs og AMAGs), og warrants yderligere undersøgelse.

Henvisning: Garziera M, Canzonieri V, Cannizzaro R, Geremia S, Caggiari L, De Zorzi M, et al. (2013) Identifikation og karakterisering af

CDH1

Kimcellelinje Varianter i sporadisk Gastric kræftpatienter og personer med risiko for mavekræft. PLoS ONE 8 (10): e77035. doi: 10,1371 /journal.pone.0077035

Redaktør: Amanda Ewart Toland, Ohio State University Medical Center, USA

Modtaget: April 29, 2013; Accepteret: September 5, 2013; Udgivet: 29 Oktober 2013

Copyright: © 2013 Garziera et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro (AIRC De Re N. 10266 og AIRC Cannizzaro Special Program Molekylær Klinisk Onkologi 5×1000 N. 12214), og Direzione Centrale del Lavoro, Formazione, Università e Ricerca Della Regione Autonoma Friuli Venezia Giulia, Codice Progetto 200502027001. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Dr. Valli de Re erklærer, at han er medforfatter og Leder medlem af PLoS Board EN. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

mavekræft (GC) er fortsat den fjerde mest almindelige malignitet på verdensplan, selv om dens forekomst og tilhørende dødelighed er faldet i de seneste årtier. GC prognose er nært beslægtet med den fase af sygdommen på diagnosetidspunktet [1]. Tidlig debut mavekræft (EOGC) er defineret som GC præsentere i en alder af 45 eller yngre [2] og har en dårlig samlet overlevelse [3], [4]. De fleste GCS er sporadisk og ofte udvikles efter

Helicobacter pylori

(HP) associeret gastritis [5], [6]. Men familiær sammenlægning undersøgelser understreger også betydningen af ​​en genetisk disposition i sporadiske udvikling af GC. Hyppigheden af ​​familiær gastrisk sammenlægning er omkring 10%

Den mest almindeligt accepteret GC histopatologisk klassifikation (Laurens klassifikation) [7] skelnes der mellem to typer af GC:. Tarm type og diffus typen. Diffus GC viser en større arvelig basis og en generelt dårligere prognose sammenlignet med det intestinale subtype [8].

CDH1

genet kodende for E-cadherin er blevet identificeret til at have en forårsagende rolle i omkring 30% -50% af arvelig diffus GC (HDGC), en autosomal dominant GC og luftrør brystkræft modtagelighed syndrom udgør 1-3% af familiær gruppering af GCS [9], [10] og i diffust GC subtype [11] .

CDH1

germline mutationer (sådan mutation videre hver eneste celle i afkommet krop) er specifikt forbundet med HDGC (ca. 30% -40% af tilfældene); large

CDH1

sletninger er blevet fundet i omkring 6,5% af tilfældene [12]. Familiær tarm mavekræft (FIGC) med en positiv familiehistorie er også blevet beskrevet, men indtil videre, ingen kønscellelinie

CDH1

defekter er blevet forbundet med FIGC eller tarm GC’er. Denne mangel på beviser for

har CDH1

mutationer i tarm undertype ført til den hypotese, at familiær ophobning i disse tilfælde bestemmes af fælles miljømæssige faktorer, i modsætning til en arvelig genetisk disposition. Imidlertid seneste data viser, at

CDH1

somatiske ændringer (sådanne ændringer akkumuleres i cancercellerne i kroppen over en persons levetid) er som hyppige i intestinal som i diffust GC [13], hvilket tyder på en vigtig rolle

CDH1

i både histotypes. Ikke desto mindre, den nøjagtige forekomst af

CDH1

germline ændringer i intestinal GC’er er stadig ukendt.

CDH1

promotor hypermethylering er den mest almindelige anden genetisk hit i GC kræftfremkaldende proces [14], [15].

CDH1

mutationer er også forbundet med en øget modtagelighed for invasive og metastatiske [16], [17] colon, blære, prostata, bryst og gynækologisk cancer [18] – [20]. E-cadherin er et transmembrant glycoprotein, der spiller en rolle i opretholdelsen af ​​epitelvæv arkitektur ved at inddrage Ca

2+ afhængige celle-celle-interaktioner [21], [22]. E-cadherin omfatter et cytoplasmatisk domæne, en kort transmembrant domæne og fem ekstracellulære gentage cadherin-lignende domæner (EC1-5), der spænder exonerne 4-13, og som indeholder høj konserverede calcium-bindende regioner [23], [24] og konserverede cysteiner sandsynlige at danne disulfidbroer [25]

i denne undersøgelse analyserede vi

CDH1

germline mutationer i en række på hinanden følgende tilfældige GC sager og personer med risiko for GC.; hovedsageligt første grad GC-slægtninge (FDRs) og autoimmune metaplastiske atrofisk gastritis (amag) patienter dirigeret til vores institut for gastrointestinale symptomer og endoskopisk evaluering. At udforske rollen som E-cadherin udtryk, strukturelle, funktionelle og immunhistokemiske analyser blev udført i prøver med en

CDH1

kimcellelinje mutation. Formålet med den foreliggende undersøgelse var at vurdere forekomsten og karakterisere

CDH1

germline mutationer i en række efter hinanden følgende sporadiske GC patienter mangler kriterierne i HDGC klassificering, og i en udvalgt population med risiko for GC udvikling, for at teste dens anvendelighed som markør for at forbedre tidlig tumor opdagelse. Data kunne bruges til at udvikle et værktøj, der hurtigt og billigt detekterer

CDH1

mutationer hovedsageligt til stede i vores befolkning.

Resultater

Patient karakterisering og

CDH1

kimcellelinje genetisk screening

Kliniske og histopatologiske funktioner i GC, FDR og amag fag er opsummeret i tabel 1 og 2. Blandt de 59 GC patienter, 2 (3,4%) har en familie historie af GC (S15 er den bror til S16) uden at opfylde kriterierne for arvelig diffuse GC, som defineret af den Internationale Gastric Cancer Linkage Consortium (IGCLC) på tidspunktet for prøvetagningen. I vores GC serie, 5 sporadiske tidlig GC patienter (≤45 år) var til stede, men ingen

CDH1

ændringer blev fundet i disse patienter. Den mediane alder FDRs var 49 år (spændvidde, 28-78 år) og for AMAGs 56 år (range, 31-72 år). Blandt de 59 GC patienter, 16 forsøgspersoner havde en første grads slægtning indgår i undersøgelsen (16/59 FDRs). FDRs og AMAGs kom til vores institution for en gastroenterologi besøg og gastroskopi eksamen, de manifesterede forskellige symptomer, men hverken kræft eller tarm metaplasi /dysplasi var til stede i disse fag.

CDH1

genetiske screening resultater er anført i tabel 3 med

nye

mutationer: 1 intron (ID 5), en missense (ID 10), og to tavse (ID 13 og ID18). Samlede vi fundet 4 varianter, som koder for en aminosyre (AA) substitution (1 roman (ID10) og tre tidligere rapporteret i andre populationer (ID 11, ID 12, ID 15), 1 i 5’near gen regionen og 2 mutationer i uoversatte (UTR) regulatorisk element (ID 1, ID 3, allerede rapporteret) og 6 substitutioner i intron regioner (tre mutationer: ID 5, ID 9, ID 17; tre intron polymorfe varianter: ID 4, ID 6, ID 8, sandsynligvis uden effekt på GC cancerogenesis). ingen sletninger eller indsættelser blev fundet i exon grænser.

Andre ændringer resulterede fælles polymorfier (hyppighed på mindst 1% af befolkningen) eller stille mutationer som koder for den samme aminosyre end den oprindelige streng. Ingen statistisk sammenhæng blev observeret blandt de fire grupper af patienter testet for ID 4, ID 6 eller ID 19 varianter. Salg

RefSNP (rs) numre til at identificere genetiske varianter tidligere offentliggjorte samt de rapporterede frekvenser (NIEHS Environmental Genome Project, Seattle, WA (URL: https://evs.gs.washington.edu/niehsExome/Besøgt august 2013); ftp://ftp.1000genomes.ebi.ac.uk/vol1/ftp/phase1/analysis_results/paper/Tilgænglig december 2012) er rapporteret i Tabel 3.

Alle

CDH1

varianter var i heterozygot tilstand bortset fra ID 4 og ID 19, hvor en homozygot tilstand blev også opdaget.

Hyppigheden af ​​mutationer og varianter blev beregnet i fag uden GC eller AMAG sygdom (52BDs + 59FDRs, n = 111). Seksten FDRs var første slægtninge i vores GC-serien; når en af ​​varianten var til stede i GC og dets forbundne FDR tilfælde vi udelukkede FDR individ fra beregning frekvensen. ID4 for eksempel var til stede i 5 FDRs relateret til vores GC af vores serie; derfor kontrol befolkning frekvensen ændret fra alt 111 til 106 personer (7FDRs + 8BDs /106; 14,5%). Figur 1 illustrerer sekventering kromatogrammer af de hidtil ukendte mutationer, vi har fundet. Vi har tidligere rapporteret ID 10 kromatogram i et andet papir [26]

(A) ID 5, ny intron mutation tæt til exon 1 (IVS1 c.48 + 7C T). Fundet i en patient ramt af AMAG (S121). (B) ID 13, tavs mutation (c.1416C T) med bevaret Ala rest ved position 472 i

CDH1

exon 10 (p.T472T) fundet i en GC (S4). (C) ID 18, den tavse mutation (c.2073C T) med bevaret Ala rest ved position 691 i

CDH1

exon 13 (p.A691A) fundet i en GC (S48)

Bioinformatik prædiktiv rolle og strukturel modellering resultater af missense varianter fundet

de missense muterede rester fandt vi alle er lokaliseret til E-cadherin ekstracellulære domæne. Den kodonposition i den umodne og modne (efter de N-terminale spaltningssteder) proteiner og data fra PolyPhen-2 og SIFT

in silico

analyser er anført i tabel 4. Alle fire missense varianter er potentielt skadelige ved PolyPhen -2, men kun den p.A298T (ID 11) og p.A592T (ID 15) substitutioner kan påvirke proteinfunktion ved SIFT analyse (tabel 4). De p.G274S (ID 10), som vi for nylig beskrevet [26], dog ikke forstyrrer det lokale miljø, men introducerer en potentiel rest for phosphorylering og glycosylering, der kan have mulige virkninger på stabilitet og integritet E-cadherin, som vi hypotese [26]. Den patogenetiske effekt af ID 11 substitution er tidligere etableret [27], men blev her først påvist ved strukturel analyse. Som illustreret i figur 2A, er AA ændring i exon 7 i p.A298T (ID 11) placeret nær den interaktive område mellem protomerer EC1 og EC2. Således kan alanin-threonin polær restsubstitution drive dannelse H-binding gennem dens oxydrilic gruppe og dette kan forstyrre den lokale struktur af proteinet i en region, der er grundlæggende for Ca

2 + interaktioner. Threonin i position 144 er sterisk demonstreret påtrængende, fordi det interagerer med to asparaginsyrerester (Asp136 og Asp 138), der er direkte involveret i Ca

2+ bindende. Desuden er obligations- længder især understreget, er mindre end 3 Å (figur 2B)

I A-B PyMOL og Coot programmel repræsentationer af EC1-EC2 protomerer baseret på human sekvens. (PDB-kode: 2O72); i C-F, EC3 og EC4 protomerer baseret på murine E-cadherin (PDB-kode: 3Q2W) ved Coot-software. (A) Cartoon repræsentation højdepunkter A144 (

Gul

) position: A144 er tæt på calcium sites (

lilla

) og i nærheden af ​​det dimeriseringsgrænseflade mellem EC1 (

blå og ) -EC2 (

grøn

) domæner. (B) Strukturel repræsentation af A144T substitution i EC2 domæne. Placering af AT144 er spotlighted i gult. Threonin i position 144 er ganske dramatisk for lokal struktur, fordi det interagerer med to asparaginsyrerester (

grøn

) direkte involveret i calcium sites, og disse obligations- længder er særligt stressede er mindre end 3 Å. (C) Den T316 (

gul

) er

O

-glycosilated (

blå og) og til stede på overfladen af ​​EC3 domæne. (D) Den hydrofobe laterale kæde af I316 (

Gul

) kan ikke være

O

-glycosilated og fremmer protein-protein interaktioner. (E) Den methylenic sidekæde af A438 (

Gul

) tillader konformationel frihed på overfladen af ​​EC4 domæne. (F) T438 (

gul

) substitution er ikke dramatisk for lokal struktur, men det kunne udgøre en potentiel site for post-translationelle modifikationer. Calcium-ioner er fremhævet (

grøn

).

Med hensyn til de resterende to missense mutationer, de har en mindre klar funktionel virkning også rapporteret i tabel 4. p .T470I (ID 12) substitution [28], ændres AA overflade af extradomain EC3 i det modne protein (figur 2C). I både den murine E-cadherin og N-cadherin sekvens (PDB-kode: 3Q2W) threonin er normalt findes

O

-glycosylated antyder en vigtig rolle for denne rest i strukturen af ​​proteinet. Men som vist i figur 2D, skiftet til isoleucin, en ikke-polær AA med en hydrofob sidekæde, som ikke kan undergå posttranslationel modifikation, antyder ingen særlig intermolekylær spændinger. Vi hypotesen, at i det ekstracellulære medium, tilstedeværelsen af ​​en isoleucin-rest ved den samme position end threonin kan begunstige protein-protein interaktioner, og denne mutation kan således antage en beskyttende betydning. Den sidste mutation rapporteret, p.A592T (ID 15), blev fundet i alle testede grupper (se tabel 3), hvilket tyder på en usandsynlig virkning på GC patogenese. I dette tilfælde alanin om extradomain EC4 af det modne E-cadherin (fig 2E) tilvejebringer konformationel frihed, selv når i nærheden af ​​de Ca

2 + bindingssteder. En threonin substitution her har en begrænset effekt på den lokale struktur og torsions vinkler af proteinet. Men vi kan ikke udelukke, at oxydrilic laterale kæde kunne være post-translationel modificeret i særlige situation og dermed påvirke strukturen og funktionen af ​​

CDH1

(figur 2F).

Transcript analyse af intron germlinie mutationer

for at udforske, om intron mutationer fundet i vores GC-serie (tabel 3) potentielt kan fremkalde en effekt på splejsning, vi udførte

CDH1

transskription analyse. Polymorfe og tavse varianter blev udelukket fra denne analyse, da de sandsynligvis ikke har nogen patogen rolle. cDNA fremstillet fra perifert blod af de udvalgte GC individer huser intron ID 5, ID 9 eller ID 17 mutationer (tabel 3) blev sammenlignet med det fra to raske bloddonorer, man kun har den samme ID 17 mutation som GC patienter (BD kode S190 ), og en anden (BD kode S189) uden

CDH1

mutation.

for ID 5 og ID 7 intron-mutationer, vi forstærkede den region, der dækker en del af exon 1 til en del af exon 5, for ID 17 mutation, exon 10.-13 (figur 3). RT-PCR exon 1 til 5 fragmenter viste ingen forskelle når kørt på 4% agarosegel (figur 3A) eller efter tovejs sekventering (data ikke vist); ved converse ID 17 intron variant kan påvirke splejsning fører til en unormal mindre

CDH1

transkript (figur 3B). Efter isolering og sekventering, fandt vi, at det mindre bånd resulterede i en sprunget transkript mangler exon 11, med exon 10 forbundet direkte til exon 12. Denne afvigende transkript blev også påvist i BD S190 bærer samme kimcellelinje substitution (figur 3B).

Total mRNA blev ekstraheret fra PBMC’er af hver repræsenterede prøve og retrotrascribed til enkeltstrenget cDNA til amplifikation: (A) Exon 1-5 på ca. 768 bp. I den anden vognbane AMAG (S121) patient bærer ID 5 mutationen (IVS1 c.48 + 7C T); i tredje vognbane FDR (S97) bærer ID 9 mutationen (IVS4 c.532-18C T); (B) Exon 10-13 på ca. 686 bp. GC (S10), GC (S46) og BD (S190) bærer ID 17 mutationen (IVS12 c.1937-13T C). Gule pile bevis en mindre bånd svarende til afvigende transkripter mangler exon 11; (C) β-actin blev anvendt som intern forstærkning kontrol. MW: 1 Kb DNA-stige. PCR-produkter blev kørt i en 4% agarose og gel farvet med SYBR Green dyef

Analyse af

CDH1

protein overflod og mRNA-ekspression niveau hos forsøgspersoner viser

CDH1

introniske mutationer Salg

En sammenligning af E-cadherin-mRNA-ekspression niveau blev udført fra EBV immortaliserede lymfocytter opnået fra det perifere blod af S10 og S190 (mutation ID 17), S97 (ID 9) og S189 (ingen

CDH1

mutationer) emner. Emne S10 var påvirket af en gastrisk cancer, med forbehold S97 er første grads slægtning af en patient med en gastrisk cancer (FDR), mens S189 og S190 var begge bloddonorer. Vi observerede mellem kontrolgruppen bloddonor (S189) ikke har nogen

CDH1

mutation og patienter, et relativt kraftigt fald i E-cadherinekspression (ca. 60%, figur 4) i patient S10 har både ID 17 mutation og en GC, mens kun omkring en 2% reduktion i bloddonor S190 med samme ID 17 mutation (

s Restaurant 0,05, med hensyn til GC S10). For S97 (mutation ID 9, FDR emne), observerede vi en lignende e-cadherin udtryk som i kontrolgruppen S189.

Relativ kvantificering af E-cadherin mRNA-niveauer i EBV udødeliggjort lymfocytter (LCL). LCLS blev genereret fra såning af 2,5 × 10

6 PBMC’er udødeliggjort af B.95.8 EBV og dyrket i suspension. Omkring 8 millioner af celler blev høstet for hver prøve efter immortalisering. testede patienter var: GC S10 huser ID 17 variant (IVS12 c.1937-13T C), FDR S97 bærer ID 9 (IVS4 c.532-18C T), BD S190 med ID 17 og BD S189 uden

CDH1

mutation. S189 blev betragtet som reference (værdi på 1) Resultater er repræsentative for tre uafhængige forsøg. E-cadherin ekspressionsniveauet var normaliserede normaliseret til p-actin Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. *, P 0,05, **, p. 0,01

immunhistokemisk analyse af tumor gastriske væv af intron ID 17 tilfælde (patient kode S10, figur 5E) viste en reduceret ekspression af membran-bundne E-cadherin i signetring tumorceller (sorte pile), mens både membranen og cytoplasmatisk farvning var til stede i normalt epitel. Den samme patient viste reduceret β-catenin-farvning i signet ring celler sammenlignet med den stærke ekspression af dette protein i normale tilstødende celler (figur 5H). Tabet af både E-cadherin og β-catenin-farvning var også mærkbar for det andet patienter (S46) med samme intronisk ID 17 mutation og påvirkes af GC også (figur 5F og 5I henholdsvis for E-cadherin og β-catenin) .

(A) Hematoxylin og eosin-farvning i normalt gastrisk væv. (B) Hematoxylin og eosin farvning i tumorvæv af GC S10 med signetring celle karcinom: signetring celler er fremhævet med sorte pile. (C) Hematoxylin og eosin farvning beviser den diffuse histotype af GC S46. (D) E-cadherin farvning i normal gastrisk væv. (E) Reduktion af E-cadherin farvning i signetring celler GC S10 respekt til tilstødende normale celler; signetring celler er fremhævet med sorte pile. (F) Tab af E-cadherin-ekspression i de diffuse tumorceller GC S46 sammenlignet med normalt væv (på højre side af mikrofotografiet). (G) β-catenin-farvning i normalt gastrisk væv. (H) Svagt β-catenin farvning i signetring celler (sorte pile) i GC S10. (I) Tab af β-catenin farvning i tumorvæv hos GC S46 sammenlignet med normalt væv (på højre side af mikrofotografiet). Alle mikrofotografier blev taget ved 400 × forstørrelse.

Diskussion

GC patienter har typisk en dårlig prognose [29]. Identifikation af patienter med en øget risiko for at udvikle GC og tidlig påvisning af GC er lovende tilgange til at reducere sygelighed og dødelighed af GC. FDR af GC patienter er kendt for at have en 2-3 gange øget risiko for GC, sandsynligvis på grund af udsættelse for de samme miljømæssige risikofaktorer og /eller arvet modtagelighed for kræft [30].

ødelæggelse parietalcellerne findes i AMAG kombineret med den vigtige rolle, E-cadherin i epitelial polaritet og gastrisk glandulær arkitektur, tyder på, at germlinie ændringer af

CDH1

kunne være en yderligere risikofaktor for GC udvikling i AMAG patient [31].

i 1998 Guilford og kolleger beskrevet for de første gang germlinie mutationer af

CDH1

gen [28]. Efterfølgende er der blevet rapporteret forskellige typer mutationer i familier af varierende etniske grupper med diffus GC [32], [33]. Den første

CDH1

kønscellelinie mutation blev beskrevet i en italiensk familie i 2006, i en patient, som opfyldte IGCLC for HDGC [34]. Men rapporterer meget få undersøgelser

CDH1

germline mutationer i sporadiske GC tilfælde uden familiær sammenlægning eller i fag på risiko for at udvikle GC [35], [36]. Desuden er der i disse undersøgelser de funktionelle effekter af

CDH1

varianter ofte ikke undersøgt.

styrken i vores undersøgelse er den samling af 59 kaukasiske patienter med sporadisk GC, 59 FDRs og 20 AMAGs der deltog i vores gastroenterologi service i de seneste år for gastrisk symptomer og en diagnose eller udelukkelse af en GC efter endoskopisk og histologisk evaluering væv.

Som sammenfattet i tabel 3, forskellige forskellige germlinie

CDH1

varianter har blevet detekteret. I 59 GC-serien, bortset fra de polymorfe og tavse ændringer, der sandsynligvis ikke har nogen patogen rolle, fandt vi 6 forskellige udskiftninger hos 9 patienter (9/59 GC’er = 15,2%): 4 af missense type (ID 10, ID 11, ID 12, ID 15) i 4 forskellige patienter (6,8%) og 2 af ikke-missense type (ID 2 og ID 17) i 5 forskellige GCS (3,4%).

ID 10 (p.G274S) er en roman missense mutation, vi fandt i en gammel mand med en GC blandet histotype. Denne variant blev ikke påvist i 187 fri-cancer individer (108BDs + 59FDRs + 20AMAGs) hvilket udelukker en polymorfi. En patogen effekt af ID 10 mutation blev ikke understøttet efter funktionelle (sammenlægning og invasion)

in vitro

analyser som vi for nylig rapporteret [26], ikke desto mindre data fra

i silico

karakterisering af mutationen og en reduktion i β-catenin-ekspression fundet i tumorvævet ikke helt udelukke betydningen af ​​denne mutation i GC udvikling. Således på dagens ID 10 forbliver en roman

CDH1

mutation med en patogenesen af ​​en ubestemt betydning.

ID 11 (p.A298T) substitution i exon 7 af

CDH1

er allerede blevet beskrevet i en 36-årig ung kaukasisk mand i en HDGC familie [27]. I vores serie, blev denne variant opdages kun 1 han (S47) på 74-årige med en blandet histotype. Den potentielle patogene effekt af denne mutation er blevet bekræftet gennem

in vitro

funktionelle studier i forskellige laboratorier [27], [37], [38]. Her først modellering resultater (Figur 2A-B) ved at analysere 3D protein-ligand bindingsinteraktioner kraftig støtte potentialet for ændrede protein funktion og føre til den mulige molekylære mekanisme, der opretholder denne proces. Den potentielle ændrede protein funktion blev også støttet fra SIFT analyse (tabel 4) med en god score. Desuden er en nylig undersøgelse, ved hjælp af

i silico

protein design FoldX algoritmisk tilgang [39], bekræfter den patogene rolle ID 11 (p.A298T) substitution, er baseret på en beregning af indfødte-state stabilitet ændringer (AAG 0,08 kcal /mol) [40]. Forfattere karakteriseret patienter huser denne missense mutation som havende en yngre alder ved diagnose og en diffus histotype. Vores sag fremhævede, at også kan påvises ID 11 i en gammel patient med blandet GC.

ID 12 (p.T470I) blev fundet i en 57-årig mand (S39) med en diagnose af GC . Denne ændring blev første gang beskrevet i en familie af Maori etnicitet med EOGC, men emnet viser denne mutation blev ikke påvirket af GC på tidspunktet for undersøgelsen [28]. Her, fandt vi, at p.T470I AA ændring tolereres i SIFT og også ved modellering analyse. Desværre tumor biopsi vævsprøve var utilstrækkeligt til at udføre E-cadherin IHC farvning.

ID 15 substitution (p.A592T) blev påvist i hvert klinisk gruppe testet, hvilket tyder på en sandsynlig polymorf diffusion. Ikke desto mindre er denne variant er tidligere blevet rapporteret i forbindelse med skjoldbruskkirtlen tumorer og luftrør brystcancere [41] – [43]. Vores strukturel analyse og

in vitro

[35] og

i silico

undersøgelser [38], [40] understøtter ikke en patogen rolle for denne variant i GC.

som anbefalet af nylige retningslinjer kliniske ledelse [44], bør udføres endoskopi overvågning årligt i de personer med mutationer af ubestemt signifikans (fx missense). Det er vores opfattelse, fag huser ID 15 og også ID 10, skal følges i op til 10 år, før udelukke en rolle, selv om svag til denne ændring i patogenesen af ​​GC.

I ID 2 identificerede vi et C -til-G ændring før starten codon (-71C G,

CDH1

5’UTR region), der repræsenterede den mest almindelige variant forbundet med GC i vores serie, der forekommer i tre ud af 59 GC-patienter ( 5,1%). Denne variant blev også rapporteret i en finsk undersøgelse [45] i en af ​​13 (7,7%) GC patienterne og i to af 51 kontroller (3,9%), og også i to EOGC patienter i det nordlige amerikansk oprindelse (3,4%) [46] . Samlet data fra disse undersøgelser tyder på, at ID 2 er et helt almindeligt mutation, men forfatterne har ikke indberettet data om ID 2-variant i forhold til E-cadherinekspression status. ID 2 blev fundet i vores serie i en tarm, en blandet, og en diffuse GC histotypes. Alle disse patienter havde over 50 år ved diagnose og var negative for HP-infektion. Ingen af ​​kontrolindivider (n = 111) testet uden GC, viste denne mutation (tabel 3). En

in situ

vurdering eller en korrelation mellem ID 2 og E-cadherinekspression kunne ikke udføres på grund af en mangel på tumor materiale. Den potentielle patogene effekt af denne promotor variant på E-cadherin ekspressionsniveauet fortjener yderligere undersøgelser

Intronic ID 17 variant (IVS12 c.1937-13T C). Blev fundet i 2 hunner med GC (2/59 GCS = 3,4%) både positive for HP-infektion, og det blev også fundet i 1 BD (1/52 = 1,9%, tabel 3). Den samme ændring blev tidligere rapporteret i luftrør brystkræft med høj frekvens (12/53 = 23%) [47], i HDGC familier (2/27 = 7,4%) [48] og i EOGC patienter (7/79 = 8,9% ) [46], men også i en relativ kontrolpopulation [46]. Notatet viser vi for første gang, at denne substitution fører til en afvigende

CDH1

afskrift huser en sletning af

CDH1

exon 11. Exon 11, sammen med delvise sekvenser af de flankerende exons , kodificerer for EC4 domæne af det modne protein [25]; ID 17 er en out-of-frame deletion og fører til dannelsen af ​​en præmatur stopkodon i position 384 til EC4 promotoren. Følgelig det translaterede protein fra

CDH1

ID 17 streng kunne mangle det transmembrane domæne og den cytoplasmatiske hale, der er involveret i β-catenin binding. Både S10 og S46 GC patienter, der har ID 17 mutation, viste en reduktion i ekspressionen af ​​E-cadherin og β-catenin ved IHC analyser (figur 5); GC S10 patient, med en signetring celle karcinom, blev diagnosticeret i en alder af 61 år, og GC S46 patient, med en diffus adenocarcinom, blev diagnosticeret i en alder af 58 år. Endvidere evaluering af E-cadherin ekspression fra EBV udødeliggjorte B-lymfocytter viste en stærk reduktion (60%) i GC S10 huser ID 17 mutation sammenlignet med BD kontrol (S189) uden

CDH1

ændringer, men også sammenlignet med en enkelt bloddonor (S190), der bærer det samme id 17 variant. Eftersom alle fag bærer ID 17 mutationen er heterozygote for

CDH1

gen, vores data viste, at S190 enkelte, men ikke tumorceller af S10 og S46 patienter kan udnytte nogle kompenserende mekanisme, der modvirker E-cadherin nedregulering. I tumorer, er E-cadherin under-ekspression bundet til forøget β-catenin transkriptionel aktivitet, en vigtigste effektor af Wnt-vejen [49]. Ekspressionen af ​​et stort antal gener relateret til tumorprogression, herunder for cyclin D1, c-

myc

, vaskulær endotelvækstfaktor, og survivin styres via Wnt /β-catenin pathway [50]. E-cadherin binding til p-catenin forhindrer dets translokation til kernen; Følgelig kan en reduktion af E-cadherin ekspression favorisere GC patogenese gennem en forøget akkumulering nukleare β-catenin. Da patienter S10 og S46 med ID17 variant er både kvinder viser en Helicobacter pylori (HP) infektion, antager vi, at ID 17 kan være forbundet med en kønsspecifik prognostisk faktor (det er velkendt, at forekomsten af ​​GC er højere for mænd end for kvinder) og /eller en HP-infektion. En sletning af exon 11 i

CDH1

genet blev også beskrevet i en HDGC patient, men i sidstnævnte tilfælde afvigende splejsning var forbundet til en anden intron mutation (IVS11 c.1711 + 5G A) [27] .