PLoS ONE: Gene Expression Profiling associeret med angiotensin II type 2 receptor-induceret apoptose i Human prostatacancerceller

abstrakt

Forøget ekspression af angiotensin II type 2-receptor (AT2R) inducerer apoptose i talrige tumorcellelinjer, med enten angiotensin II-afhængige eller angiotensin II-uafhængig regulering, men dens molekylære mekanisme stadig dårligt forstået. Her anvendte vi PCR Array analyse for at bestemme gen- og microRNA ekspressionsprofiler i human prostatacancer-cellelinier transduceret med AT2R rekombinant adenovirus. Vores resultater viste, at AT2R overekspression fører til opregulering af 6 apoptose-relaterede gener (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2), 2 cytokingener (IL6 og IL8) og 1 microRNA, og nedregulering af 1 apoptose-relaterede gen TNFSF10 og 2 cytokingener (BMP6, BMP7) i transducerede DU145 celler. HRK blev identificeret som en opreguleret gen i AT2R-transducerede PC-3-celler ved real-time RT-PCR. Dernæst vi udnyttet siRNAs at lukke munden up-regulerede gener for yderligere at bestemme deres roller på AT2R overekspression medieret apoptose. Resultaterne viste nedregulering af Gadd45a reducerede den apoptotiske virkning ved -30% i DU145-celler, nedregulering af HRK reduceret AT2R-medieret apoptose med mere end 50% i PC-3-celler, mens nedregulering af TRAIL-R2 forbedret AT2R-medieret apoptose mere end 4 gange i DU145-celler. Vi fandt også, at virkningerne på AT2R-medieret apoptose forårsaget af nedregulering af Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK var uafhængige i aktivering af p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53. Tilsammen vores resultater viste, at TRAIL-R2, Gadd45a og HRK kan være nye målgener for yderligere undersøgelse af mekanismen af ​​AT2R-medieret apoptose i prostata kræftceller

Henvisning:. Pei N, Jie F, Luo J, Wan R, Zhang Y, Chen X, et al. (2014) Gene Expression Profiling associeret med angiotensin II type 2-receptor-induceret apoptose i human prostatacancer Cells. PLoS ONE 9 (3): e92253. doi: 10,1371 /journal.pone.0092253

Redaktør: Gangjian Qin, Northwestern University, USA

Modtaget: December 6, 2013; Accepteret: 19 Feb 2014; Udgivet: 21 Mar 2014

Copyright: © 2014 Pei et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Natural Science Foundation of China Grant 81072113 (HL), National 863 High Technique Udviklingsprojekter i Kina Grant 2012AA02A403 (HL), State Key Laboratory sygdomsbærer og Biosikring Program SKLPBS1103 (HL), såvel som af awards 2011A091000022, 2010B060500001 , 2011B060300028 og 2011B060300014 at WG fra den kinesiske regering. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatakræft er den mest almindelige form for kræft i nordamerikanske mænd og er den næststørste årsag til kræft sygelighed og dødelighed i USA [1], selv om dens prognose er forbedret på grund af udviklingen i diagnostiske og kirurgiske teknikker . Til dato har forskellige typer af behandlinger til patienter med hormon-refraktær cancer blevet undersøgt, men ingen effektiv terapi er blevet rapporteret. Derfor er et presserende behov for nye strategier for prostatakræft behandling.

angiotensin II (Ang II) er nøglen effektor i renin-angiotensin-systemet. Ang II har to receptorer: Ang II type 1 og type 2 receptorer (AT2R) [2]. AT2R, den anden store receptor isoform, primært udtrykt i mesenchym af fosteret og i begrænset omfang i voksne væv [3]. Det er veletableret, at øget ekspression af AT2R inducerer apoptose i mange cellelinjer, såsom fæokromocytom, fibroblaster, glatte muskelceller, og endotelceller via enten Ang II-afhængige eller Ang II-uafhængig regulering [4] – [11]. Vores tidligere undersøgelser viste, at AT2R overekspression betydeligt induceret apoptose i prostata kræftceller [12]. En nylig undersøgelse viser, at intratrakeal administration af en nanopartikel-baseret behandling med AT2R genet dæmper lungekræft vækst, og effekten er bedre end TRAIL [13]. Trods succes i afgrænse den fysiologiske rolle, de molekylære og cellulære handlinger AT2R-middelbare apoptose forbliver udefineret. Her brugte vi realtids-PCR-array analyse at profilere et stort antal gener og microRNA’er involveret i AT2R induceret apoptose i prostata cancer cellelinjer.

I denne rapport, blandt gener, der kan være relateret i apoptose pathway, der er 7 apoptose-relaterede gen, 4 cytokiner og 1 microRNA udtryk, der blev ændret i AT2R overudtrykt prostatacancerceller sammenlignet med kontrol. AT2R-induceret apoptose i DU145 celler blev forstærket, da TRAIL-R2 blev slået ned. de apoptotiske virkninger medieret af AT2R blev dog reduceret i DU145 celler, når Gadd45a blev stille. Interessant, da HRK blev stille, at apoptose induceret af AT2R blev reduceret i PC-3-celler. Vores undersøgelse viste også, at virkningerne på AT2R-medieret apoptose forårsaget af nedregulering af TRAIL-R2 og HRK var uafhængige i aktivering af p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53. Vores undersøgelse skal bidrage til at identificere AT2R-sensing faktorer impliceret i apoptosecyklus i prostata kræftceller, og hjælpe os til at forstå AT2R-drevet apoptose bedre ved at give formodede målgener for yderligere undersøgelser.

Materialer og metoder

Cell Culture

human prostatacancer-cellelinier (PC-3 og DU145 celler) blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD). PC-3-celler blev dyrket i F-12-medium og DU145 celler blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FBS under 5,0% CO

2. Sera og medier blev købt fra Invitrogen og American Type Culture Collection

af rekombinant adenovirus Byggeri og Forberedelse

Rekombinante adenovirusvektorer blev konstrueret, tilberedt, og titreres som beskrevet tidligere [14]:. En adenovirusvektor indeholdende den forbedrede grønt fluorescerende protein-gen styres af en cytomegaloviruspromotor (Ad-CMV-EGFP) og en adenoviral vektor indeholdende genomisk AT2R (G-AT2R) DNA med introns 1 og 2 og den kodende region og forstærket grønt fluorescerende protein-gen styret af cytomegalovirus initiativtagere (Ad-G-AT2R-EGFP).

Cell Behandling

For viral transduktion, prostata kræftceller (4 × 10

5) blev podet i seks-godt corning vævskultur plader. Den følgende dag blev celler transduceret med Ad-G-AT2R-EGFP eller kontrolvektoren Ad-CMV-EGFP og ændringer i cellemorfologi blev observeret ved anvendelse af et Olympus BX41 fluorescensmikroskop. Transducerede celler blev anvendt 24 til 48 timer senere, afhængig af den specifikke protokol.

I den lille interfererende RNA (siRNA) undersøgelser, DU145 og PC-3-celler blev transficeret med enten TRAIL-R2, GADD45A, TP53BP2, HRK eller kontrol siRNA anvendelse af lipofectamin-reagens (Invitrogen) ved at følge fabrikantens protokol. Alle siRNA’er blev indkøbt fra Qiagen. Disse behandlinger blev fulgt 24 timer senere af transduktion med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle) og derefter, 48 timer senere, antallet af apoptotiske celler eller apoptose-relaterede gener /proteiner blev undersøgt.

RNA Isolation og Real-Time RT-PCR

Totalt RNA blev isoleret fra behandlede DU145 og PC3-celler under anvendelse RNeasy Mini-Kit (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Isoleret RNA undergik DNase I (OMEGA Biotek, Norcross, USA) behandling til fjernelse genomisk DNA. RNA-koncentrationen blev bestemt ved et ND-1000 Spectrophotometer (NanoDrop, Rockland, DE, USA), og RNA’et renhed blev bekræftet ved 260/280 optisk densitetsværdi af 1,8-2,0. De RNA-prøver blev vurderet for nedbrydning status ved agarosegelelektroforese. Det isolerede RNA blev derefter omdannet til cDNA med oligo dT og PrimeScript revers transkriptase (TAKARA, Dalian, Kina) regenter. Fluorescerende kvantitativ PCR blev udført med termo-cykling betingelse: 95 ° C i 30 sek, efterfulgt af 40 cykler af 5s ved 95 ° C og 34s ved 60 ° C. Prøverne blev analyseret med ABI 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems) og underkastet fremgangsmåde sammenlignende △△ C

T ved anvendelse af human GAPDH som den interne standard. Real-time PCR-produkter (8 pi) blev læsset på 2,5% agarose gel, der indeholder ethidiumbromid.

Apoptotisk Gene Expression Analysis Brug Real-Time PCR Array

Første cDNA-syntese blev udført med RT

2 Første Strand kit (C-03) i overensstemmelse med protokollen fra producenten (SABiosciences, Frederick, MD, USA) .Den cDNA prøver blev derefter screenet for ekspression af 84 centrale gener involveret i apoptose ved hjælp af human Apoptose RT

2 Profiler PCR Array (PAH-012A, Superarray, Frederick, MD, USA) på en ABI 7500 real-time PCR-system (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), ifølge producentens protokoller. At opnå statistisk data, analyserede vi kontrol og eksperimentelle prøver ved hvert af de to tidsintervaller i tre eksemplarer. Udtrykkene for målgener blev målt i forhold til den gennemsnitlige tærskelcyklus (C

T) værdier af fem forskellige kalibrator gener (B2M, GAPDH, HPRT1, RPL13A og ACTB). Resultaterne blev udtrykt som den relative gange ændring af genekspression i AT2R udført gruppen sammenlignet med kontrolgruppen. Gener med relativ fold ændrer større end ± 2 blev betragtet som op- eller nedreguleret i ekspression. Gener, der gav en p-værdi på 0,05 blev anset for at vise statistisk signifikans for studiet

Menneskelig Cytokiner Analyse Brug Real-Time PCR Array og Real-Time RT-PCR

. cDNA-prøver blev også screenet for ekspressionen af ​​84 pathway-fokuserede cytokiner og ved hjælp af RT

2 Profiler PCR Array Humant Common cytokiner (PAH-021A, Superarray, Frederick, MD, USA) på en ABI 7500 real-time PCR systemet (Applied Biosystems, Carlsbad, CA, USA), i henhold til producentens protokoller. Eksperimenter blev udført én gang mellem Ad-G-AT2R-EGFP-transducerede celler og Ad-CMV-EGFP-inducerede celler til at screene cytokiner generelt.

Real-time RT-PCR blev anvendt til at validere udtrykket profilering. Gener blev valgt på grundlag af deres mulige fysiologiske roller og i hvilket omfang de blev reguleret af overekspression af AT2R. Oligonukleotidprimere og Taqman prober specifikke for Bcl-2, blev IL6 og IL8 opnået fra Applied Biosystems. Isolering af totalt RNA blev udført som beskrevet ovenfor. Oprenset RNA (25 ng) blev anvendt til at gøre RT-PCR i et Applied Biosystems Prism 7000 Sequence Detection System, med anvendelse af One-Step RT-PCR Master Mix Reagents. Ekspression af husholdning genet GAPDH blev anvendt til at normalisere mRNA-ekspression. Kvantificering og analyse af genekspression blev bestemt under anvendelse af komparativ tærskelcyklus (C

T) fremgangsmåde som beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin # 2. Primere der anvendes til påvisning niveauerne af andre cytokiner er vist i tabel 1 og real-time PCR blev udført ved hjælp af SYBR Premix Ex Taq (TAKARA) regenter, som beskrevet ovenfor.

Menneskelig MikroRNA’er Analyse Brug Real-Time PCR Array og Real-Time RT-PCR

For at kvantificere miRNA udtryk, total RNA blev ekstraheret fra Ad-G-AT2R-EGFP-transducerede og Ad-CMV-EGFP-inducerede celler med RNeasy Mini-Kit (Invitrogen ). Det isolerede totale RNA blev revers transkriberet under anvendelse af OneStep PrimeScript miRNA cDNA Synthesis Kit (Takara, Japan) ifølge producentens instruktioner. CDNA-prøver blev screenet for ekspressionen 88 forløb-fokuserede miRNA miScript miRNA PCR Array human cancer PathwayFinder (MIHS-102Z, Frederick, MD, USA). På en ABI 7500 real-time PCR-system Salg

microRNA’er blev analyseret yderligere baseret på deres mulige roller i kræft og udtryk, der blev væsentligt reguleret i miRNA PCR Array system. Denne grænse blev valgt for at reducere antallet af gener til en mere brugbar nummer og at fokusere på de gener, hvis ekspression blev ændret væsentligt. Ved hjælp af disse kriterier, var vi i stand til at indsnævre vores fokus til 14 følgende miRNA: HSA-miR-let7c; HSA-MIR-let7e; HSA-MIR-21; HSA-MIR-125; HSA-MIR-126; HSA-MIR-146; HSA-MIR-150; HSA-MIR-182; HSA-miR-183; HSA-miR-193; HSA-MIR-767; HSA-MIR-149; HSA-MIR-100; HSA-MIR-32. Relative ekspression blev beregnet via den sammenlignende tærskelcyklus (C

T) fremgangsmåde under anvendelse af ekspressionen af ​​U6 lille nukleare RNA som reference. Uni-miR qPCR Primer blev inkluderet i sættet. Mængden af ​​miRNA blev overvåget med SYBR Premix Ex Taq II (Perfect Real Time) (Takara, Japan). PCR-betingelserne var 30s ved 95 ° C efterfulgt af 40 cyklusser ved 95 ° C i 5 s og 60 ° C i 30 sek.

Apoptose Assessment

Antallet af grønne fluorescerende celler, der udviser apoptotisk morfologi induceret af AT2R medieret apoptose efter transfektion siRNA’er blev vurderet ved at tælle celler fra 10 tilfældige felter pr brønd. Tællinger blev udført af en person, der var blindet med hensyn til behandlingen.

Western blot analyse

Vestlige immunblots blev kørt som beskrevet tidligere [15]. Primære antistoffer og deres kilder var som følger. Anti-total p38 MAPK, anti-total p53, anti-total p44 /42 MAPK, anti-phosphorylerede p44 /42 (pp44 /42) MAPK, og anti-phosphoryleret p53 (pp53) var fra Cell Signaling Technology. Anti-phosphoryleret p38 (pp38) MAPK var fra Millipore. Anti-β-actin og sekundære antistoffer peberrodsperoxidase-konjugeret anti-kanin-IgG og anti-kanin IgG var fra Sigma-Aldrich. Anti-gede-IgG var fra Santa Cruz Biotechnology.

Statistical Analysis

I alle eksperimenter blev viral transduktion udført i tredobbelte brønde og gentaget mindst tre gange. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse (SD) fra 3 til 5 uafhængige forsøg. Statistisk analyse blev udført med SPSS 13.0 software. Alle statistiske analyser blev udført ved anvendelse af t-test, når kun 2 grupper blev sammenlignet, og ved ANOVA når 3 eller flere grupper blev sammenlignet. P 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Adenoviral-medieret ekspression af AT2R i Prostata Cancer Cells

I vores nuværende studie, DU145 celler inficeret med Ad-G-. AT2R-EGFP (100 IFU /celle, 2 dage) udviste et stort antal apoptotiske celler sammenlignet med kontrolvektoren (fig. 1A, B, C, D), i overensstemmelse med vores tidligere rapport [12]. Derefter realtids-PCR blev anvendt til at bestemme den relative ekspression af AT2R. Vores resultater viste, at AT2R blev signifikant overudtrykt i Ad-G-AT2R-EGFP-transducerede DU145 eller PC-3-celler i en dosis-afhængig måde (tabel 2 og fig. 1E, F). Salg

DU145-celler var transduceret med Ad-G-AT2R-EGFP (B og D) og Ad-CMV-EGFP (a og C) (100 IFU /celle) i 2 dage, og cellemorfologi blev undersøgt under et fluorescensmikroskop. Scale barer, 50 um. Totalt RNA blev ekstraheret fra transducerede DU145 celler og AT2Rs blev detekteret ved real time RT-PCR. Ethidiumbromid-farvet geler viser AT2R (E) og GAPDH (F) transkripter i transducerede celler. M, DL 2.000 DNA Maker (Takara); 1, 3, 5, 7, 9: transduceret med 10, 20, 50, 100, 200 IFU /celle separat for Ad-G-AT2R-EGFP; 2, 4, 6, 8, 10:. Transduceret med 10, 20, 50, 100, 200 IFU /celle separat af Ad-CMV-EGFP

TRAIL-R2 og Gadd45a Contribute til AT2R-induceret apoptose i DU145 celler

PCR Array analyse blev udført for at bestemme molekylære virkninger af AT2R ekspression i DU145-celler. Af de 84 gener, der er repræsenteret på den menneskelige Apoptose RT

2 Profiler PCR Array profiler, ekspressionsniveauerne af 6 gener (TRAIL-R2, BAG3, BNIPI, HRK, Gadd45a, TP53BP2) var opreguleret og et gen (TNFSF10) blev nedreguleret i DU145-celler transduceret med Ad-G-AT2R-EGFP (tabel 3, fig. 2). Disse differentielt udtrykte gener kan allokeres til gener kodende for tumornekrosefaktor (TNF) ligand familie (TNFSF10), TNF-receptorfamilien (TNFRSF10B), Bcl-2-familien (BAG3, BNIP1, HRK) samt tumor protein p53 binding protein 2 (TP53BP2) og vækst anholdelse og DNA-skader-inducerbare, alpha (Gadd45a). Interessant nok blev Bcl-2 ikke reguleret betydeligt i PCR Array analyse. Real-time PCR blev yderligere vant til gyldigheden sit udtryk. Vores resultater viste, at der ikke var nogen signifikant ændring i Bcl-2-ekspression i Ad-G-AT2R-EGFP-transducerede DU145 celler sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transducerede celler (Fig. 3). Salg

Celler behandlet med Ad-CMV-EGFP (200ifu /celle) blev anvendt som kontrol.

DU145 celler blev transduceret med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP ) til 2d ved 200 IFU /celle. Disse behandlinger blev efterfulgt af total RNA-isolering og derefter real-time RT-PCR-analyse under anvendelse af specifikke oligonukleotidprimere og Taqman prober. Alle data blev normaliseret mod niveauerne af GAPDH mRNA-ekspression i den samme prøve. Kolonner, betyder fra tre separate forsøg.

siRNA interferens teknologi blev anvendt til yderligere at fastlægge den rolle, fire up-regulerede gener, herunder TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 og HRK, i AT2R -induceret apoptose i transducerede DU145 celler. Transfektion af disse siRNAs i DU145-celler faldt deres mRNA-ekspression (fig. 4A). Behandling af DU145 celler med Gadd45a siRNA reducerede apoptotiske effekt på omkring 30%, mens TP53BP2 siRNA og HRK siRNA ikke forårsagede signifikant forskel på AT2R-medieret apoptose sammenlignet med kontroller. Interessant behandling af DU145 celler med TRAIL-2 siRNA forøgede signifikant AT2R apoptose mere end 4 gange sammenlignet med kontrol siRNA transficerede celler (fig. 4B). Desuden øgede apoptose var ikke på grund af den direkte virkning af TRAIL-R2 siRNA, da TRAIL-R2 siRNA alene forårsagede ingen apoptotiske resultater (data blev ikke vist).

DU145 celler blev transficeret med TRAIL-R2, Gadd45a, TP53BP2 eller HRK siRNA (20 nmol /l) eller kontrol siRNA (20 nmol /l) efterfulgt af transduktion med Ad-G-AT2R-EGFP (100 IFU /celle) i 2 dage. (A) siRNAs medieret-formindskelse af mRNA-ekspression i transducerede DU145 celler; (B) grønt fluorescerende celler, der udviser apoptotisk morfologi, der blev talt fra 10 felter pr godt .. Kolonner, middelværdi af tre forsøg; barer, SE. *, P. 0,05

Tilsammen indikerer disse data, at apoptose induceret af AT2R overekspression er delvis afhængig Gadd45a på DU145 celler. TRAIL-R2 kan være en negativ regulator i AT2R-induceret apoptose i DU145 celler.

HRK Bidrager til AT2R-induceret apoptose i PC-3 Cells

I betragtning af de opreguleres gener produceret af overekspression af AT2R i DU145-celler, vi næste undersøgt virkningerne af AT2R overekspression på generne i PC-3-celler ved real-time RT-PCR. Vi viste, at ekspressionsniveauer af HRK (en pro-apoptotisk gen) blev forhøjet i PC-3-celler på en dosis-afhængig måde og nåede et meget højt niveau på 100ifu /celle (fig. 5A).

A, HRK mRNA-ekspression i PC3-celler transduceret med de angivne doser. B og C blev PC3-celler behandlet med 20 nmol /l HRK siRNA eller kontrol siRNA og Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle) som beskrevet i Materialer og metoder efterfulgt 48 timer senere af real-time RT-PCR-analyse (B) af enten HRK mRNA eller vurdering af celler med apoptotisk morfologi (C). Kolonner, betyder fra tre separate forsøg i hvert enkelt tilfælde; barer, SE. *, P 0,05 versus kontrol celler

At udforske rolle HRK i AT2R-induceret apoptose i PC3 celler blev HRK siRNA transduceret i PC-3 celler at falde i HRK udtryk (fig. . 5B). Resultatet viste nedregulering af HRK i PC-3 celler reducerede signifikant AT2R-induceret apoptose ved ~45% (fig. 5C).

Inddragelsen af ​​Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK i AT2R-induceret apoptose Independent af p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53

Vi undersøgt yderligere downstream signalvej forårsaget af AT2R overekspression på celle apoptose. Vores tidligere undersøgelse viste, at øget ekspression af AT2R inducere apoptose ved aktivering af p38 MAPK-vejen [14]. Men i nærværende undersøgelse, aktivering af p38 MAPK, p53 og p44 /42MAPK blev ikke observeret i nedregulering af Gadd45a og TRAIL-R2-medieret AT2R-induceret apoptose i DU145-celler (fig. 6A, 6B, 6C). Lignende resultater blev også observeret i PC3-celler (fig. 7A, 7B, 7C). Disse viser, at inddragelsen af ​​Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK i AT2R-medieret apoptose var uafhængig i aktivering af p38 MAPK, p53 og p44 /42 MAPK.

DU145 celler blev transficeret med TRAIL-R2 siRNA

(bane 1),

Gadd45a

siRNA (bane 2)

, TP53BP2 siRNA

(bane 3)

, HRK siRNA

(bane 4)

, kontrol

siRNA (bane 5)

eller mock

(Bane 6)

fulgte 24 timer senere af transduktion med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle). Efter 2 d af inkubationen blev cellerne opsamlet og udsat for Western blot analyser (repræsentative for tre forskellige forsøg). (A) ekspressionsniveauer af total p44 /42, pp44 /42 og p-actin proteinbånd. (B) ekspressionsniveauer af total p38, pp38 og p-actin proteinbånd. (C) ekspressionsniveauer af total p53, pp53 og p-actin protein bands.

PC-3 celler blev transficeret med HRK siRNA

(bane 1)

, kontrol

siRNA (bane 2)

eller mock

(bane 3)

fulgte 24 timer senere af transduktion med Ad-G-AT2R-EGFP (200 IFU /celle). Efter 2 d af inkubationen blev cellerne opsamlet og udsat for Western blot analyser (repræsentative for tre forskellige forsøg). (A) ekspressionsniveauer af total P44 /42, pp44 /42 andβ-actin protein bands. (B) ekspressionsniveauer af total p38, pp38 andβ-actin proteinbånd. (C) ekspressionsniveauer af total p53, pp53 og p-actin protein bands.

Cytokiner og MikroRNA’er Expression Validering

Op og ned-regulerede cytokiner og microRNA blev screenet ved Real- time PCR Array i transducerede DU145 celler (8A, 9A). Real-time RT-PCR blev anvendt til at validere cytokinet og microRNA ekspression profilering produceret af AT2R overekspression i DU145-celler. Generne og microRNA blev valgt på baggrund af deres udtryk ændringer, som blev indhentet fra PCR array analyse og mulige fysiologiske roller på apoptose og proliferation. MRNA-niveauer af IL8 og IL6 blev forhøjet mere end 2 gange og 40% i DU145-celler transduceret med Ad-G-AT2R-EGFP sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transducerede celler (Fig 8B . C), mens BMP6 ( fig. 8D), BMP7 (fig. 8E) blev reduceret med 50% og 45% og udtryk for BMP1, BMP4, BMP8B, TGFB1, TGFB2 og TGFB3 (Fig.8F, 8G, 8H, 8J) blev ikke signifikant ændret . Med hensyn til microRNA, resultatet viste, at microRNA 150 blev forøget mere end 5 gange i DU145-celler transduceret med Ad-G-AT2R-EGFP sammenlignet med Ad-CMV-EGFP-transducerede celler, mens andre microRNA ikke var signifikant ændret (fig. 9B). Disse resultater var i overensstemmelse med vores miScript miRNA PCR Array data.

DU145 celler blev transduceret med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP) i 2 dage ved 200 IFU /celle. Andre grupper af celler var mock transduceret. A. Op og ned-regulerede cytokiner blev screenet ved Real-time PCR Array i DU145-celler. Real-time RT-PCR-analyse af enten IL8 (B), IL6 (C), BMP6 (D), BMP7 (E), BMP1 (F), BMP4 (G), BMP8B (H), TGFB1 (J), TGFB2 (J) og TGFB3 (J). Alle data blev normaliseret mod niveauerne af GAPDH mRNA-ekspression i den samme prøve. Kolonner, betyder fra tre separate forsøg; barer, SE. *, P 0.05.

DU145 celler blev transduceret med enten Ad-G-AT2R-EGFP (AT2R) eller Ad-CMV-EGFP (EGFP) i 2 dage ved 200 IFU /celle. Disse behandlinger blev efterfulgt af isolering af mRNA og derefter real-time RT-PCR-analyse af udvalgte microRNA. Alle data blev normaliseret mod niveauer U6 udtryk inden for samme prøve. Kolonner, betyder fra tre separate forsøg; barer, SE. *, P 0,05 versus Ad-CMV-EGFP-transduceret. A. Op og ned-regulerede microRNA blev screenet af Real-time PCR Array i DU145 celler. B. Validering af microRNA udtryk ved hjælp Real-time PCR.

Diskussion

Så vidt vi ved, er dette den første undersøgelse, der klart vurdere apoptose-relaterede gen, cytokiner gen- og microRNA ekspressionsprofiler forbundet med AT2R-induceret apoptose i prostatacancerceller. Det er også den første undersøgelse for at rapportere om de direkte selektive effekter af Gadd45a, TRAIL-R2 og HRK på apoptose induceret af overekspression af AT2R i DU145 eller PC-3 celler. Disse resultater giver vigtige oplysninger mod en bedre forståelse af molekylære mekanisme på AT2R-medieret apoptose i prostata kræftceller.

I denne undersøgelse observerede vi, at tvungen overekspression af AT2R resulteret i væsentlige ændringer i et stort antal gen- og microRNA udtryk ved hjælp af PCR Array analyse. Dernæst har vi vist, at TRAIL-R2 og Gadd45a er involveret i apoptose induceret af AT2R i DU145-celler og HRK spillede en vigtig rolle i AT2R-medieret apoptose i PC-3-celler. Endelig TRAIL-R2, Gadd45a og HRK Involvering i apoptose induceret af AT2R var uafhængige i aktivering af p38 MAPK, P44 /42 MAPK og p53 i prostatakræft-cellelinier.

Gadd45a blev opreguleret i AT2R-overudtrykt DU145 celler i vores nuværende undersøgelse. Gadd45a, en p53-regulerede og DNA-skader-inducerbart gen, er et medlem af GADD45 familie af gener, der er kendte stress-sensorer, som modulerer den cellulære respons på en række af stress, herunder genotoksisk og oncogen stress [16] – [ ,,,0],19]. Andre undersøgelser har vist, at Gadd45a inhiberer tumorangiogenese via blokering af mTOR /STAT3 pathway [20]. Gadd45a er en transkriptionel mål for tumor suppressor p53 og BRCA1, hvis tab af funktion play nøgleroller i udviklingen af ​​kræft [21]. Desuden ZERBINI L, et al [22] har vist, at Jund, Gadd45a og Gadd45g som terapeutiske mål i prostata caner. I overensstemmelse med denne undersøgelse, viste vores data, at AT2R-medieret apoptose var delvis afhængig Gadd45a i DU145-celler.

Dataene præsenteret her viser, at TRAIL-R2 er involveret i AT2R-medieret apoptose af DU145 celler. Et stort antal beviser viste, at TRAIL, et apoptoseinducerende ligand, udløser apoptose i flere cancercellelinier uden toksicitet for normale celler [23]. TRAIL har mindst fire celleoverfladereceptorer, og den inducerer apoptose gennem to nært beslægtede receptorer, TRAIL-R1 og TRAIL-R2 [24]. TRAIL-R1 og TRAIL-R2 inducere FADD-afhængig apoptose og aktivere NF-kappaB pathway [25]. Membranbundne TRAIL /dets receptorer er konstitutivt udtrykkes ved høje niveauer i primære og metastatiske carcinomer i næsten alle patienter [26]. Vores undersøgelse præsenteres her viste, at TNFSF10 (TRAIL) blev nedreguleret mens TRAIL-R2 blev opreguleret i AT2R-overudtrykt DU145 celler. Interessant nedregulering af TRAIL-R2 væsentligt forbedret den apoptotiske virkning induceret af AT2R overekspression. Vores data viste også, at apoptose var målbart når TRAIL-R2 blev slået ned alene. Derfor vores eksperimenter antyder, at TRAIL og TRAIL-R2 kan være negative regulatorer i AT2R-medieret apoptose i DU145 celler, og den kombinerede behandling med AT2R overekspression og TRAIL-R2 nedregulering kan være lovende som en ny genterapi mod human prostatacancer.

Nogle tumorceller er resistente over for TRAIL-induceret cytotoksicitet, selv om TRAIL er blevet rapporteret at inducere apoptose af en række forskellige tumorcelletyper [27], [28]. Manglende undergå apoptose er blevet impliceret i resistens af cancerceller til TRAIL overvågning og derfor i tumorudvikling. De molekylære determinanter for TRAIL-induceret apoptose ikke er blevet omfattende undersøgt i humane prostatacancerceller. LNCaP og DU145 prostatacancerceller er resistente over for TRAIL-induceret apoptose, og TRAIL var mindre aktivt mod dem sammenligner med PC-3 prostatacancerceller [29], [30]. Følsomheden over for TRAIL-induceret apoptose kunne korreleres til de relative udtryk for TRAIL-R1 og TRAIL-R2 versus DcR1 og DcR2 eller de intracellulære niveauer af Flame-1 [31], [32]. Men sammenlignet med LNCaP-celler, som har den laveste følsomhed over for TRAIL-induceret apoptose, meget følsomme PC-3-celler viste, tilsvarende eller lavere proteinniveauer af TRAIL-R1 og TRAIL-R2 og højere niveauer af DcR2 [30]. Det er også fundet, at ekspressionen af ​​TRAIL-R1 og TRAIL-R2 i TRAIL-sensitive MCF10A cellelinie ikke var forskellig fra resistente cellelinier, fx 184B5 [33]. Dette gør det usandsynligt, at følsomheden over for TRAIL-induceret apoptose er fuldstændig kontrolleret af de relative mængder af TRAIL-R1 og TRAIL-R2. Det antyder, at andre faktorer eller andre mekanismer kan være vigtige regulatorer af følsomhed over for TRAIL-induceret apoptose i disse cancerceller. Sandsynligvis, i denne undersøgelse TRAIL-R2 negativt regulerer AT2R-medieret apoptose i DU145-celler hjælper os undersøge mekanismerne i følsomhed for TRAIL-induceret apoptose i forskellige celler.

En helt ny observation, at TRAIL-R2, tanke kun handling, når de stimuleres af TRAIL på celleoverfladen, opfylder en særskilt funktion i kernen, hvor det fremmer celleproliferation i et TRAIL-uafhængig måde antyder en specifik, proliferation-associeret funktion af nuklear TRAIL-R2 [34]. Nuclear TRAIL-R2 hæmmer modning af microRNA Lad-7 i bugspytkirtelkræft cellelinjer og øger deres proliferation. Pancreas tumorprøver har øget niveauer af nukleare TRAIL-R2, der korrelerer med dårlig resultat af patienter [34]. Disse resultater viser, at i kernen, kan dødsreceptorer fungere som tumor promotorer og kan være terapeutiske mål, og mennesket hjælpe os yderligere at undersøge forholdet mellem AT2R og TRAIL-R2.

Flere undersøgelser har vist, at HRK (pro -apoptotic BH3-only Bcl-2 familiemedlem, Harakiri) er et pro-apoptotisk gen i flere celler [35] – [41]. HRK inaktivering er forbundet med en lav apoptotisk indeks i sekundære glioblastomer [42]. I den foreliggende undersøgelse viste vi, at HRK blev opreguleret i AT2R-overudtrykt DU145 og PC-3-celler, og når HRK blev stille, blev AT2R-medieret apoptose signifikant reduceret i PC-3, men ikke DU145-celler. Disse data viser, at apoptose induceret af AT2R overekspression er mindst delvis afhængig HRK i PC-3-celler. Det er også påvist, at ekspressionsniveauerne af HRK blev forhøjet i PC-3-celler henholdsvis på en dosis-afhængig måde. Tilsammen vores resultater indikerede, at apoptose induceret af overekspression af AT2R kan være afhængig af den HRK pro-apoptotiske vej i PC-3-celler. Men der er nogle spørgsmål, der skal besvares såsom mekanismen i apoptotiske vej fra AT2R til HRK blev ikke illustreret og hvorvidt HRK kunne udløser apoptose i andre prostata kræftceller.

Vores tidligere forsøg viser at AT2R apoptose er ligand (Ang II) uafhængig, medieret af p38 MAPK og caspase-3, og forekommer via en ydre celledød signalvejen [12].