PLoS ONE: TIPE2 Hæmmer Lung Cancer Growth tillægge Fremme af apoptose ved Regulering Nogle Apoptotiske Molecules Expression

Abstrakte

Nylige undersøgelser viste, at TIPE2 var involveret i udviklingen af ​​kræft. Men lidt om TIPE2 i lungekræft. Vores undersøgelse har til formål at præcisere, hvilken rolle TIPE2 i lunge carcinogenese. Vi undersøgte ekspressionen af ​​TIPE2 i lunge skællede cancer (LSC), småcellet lungecancer og lunge adenocarcinom (ADC) væv og fandt, at TIPE2 ekspression blev tabt i småcellet lungecancer, sammenlignet med tilstødende ikke-tumorvæv. Overekspression af TIPE2 hæmmede markant væksten af ​​lungekræft celle H446

in vitro

og endda undertrykt tumordannelse

in vivo

. Flowcytometri analyse fundet TIPE2 overekspression fremmet apoptose af H446. I TIPE2 overekspression celler, caspase-3, caspase-9, og Bax blev signifikant opreguleret mens Bcl-2 blev nedreguleret. Desuden blev sammenfaldende resultater vist ved immunhistokemi i tumorer fra nøgne mus. TIPE2 inhiberede phosphorylering af Akt, fremme phosphorylering af P38, men havde ingen effekt på kBa og ERK-vejen. Tilsammen TIPE2 fremmes lungecancer celle apoptose gennem påvirker apoptose-relaterede molekyler caspase-3, caspase-9, Bcl-2 og Bax, eventuelt via regulering P38 og AKT pathways, hvilket indikerer, at TIPE2 kan være en hidtil ukendt markør for lungekræft diagnose og terapi

Henvisning:. Liu QQ, Zhang FF, Wang F, Qiu JH, Luo CH, Zhu GY, et al. (2015) TIPE2 Hæmmer Lung Cancer Growth tillægge Fremme af apoptose ved Regulering Nogle Apoptotiske Molecules Expression. PLoS ONE 10 (5): e0126176. doi: 10,1371 /journal.pone.0126176

Academic Redaktør: Jin Q. Cheng, H.Lee Moffitt Cancer Center Research Institute, UNITED STATES

Modtaget: December 19, 2014 Accepteret: 30 marts 2015; Udgivet: 6. maj 2015

Copyright: © 2015 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Finansieringen blev leveret af National Natural Science Funds i Kina (81101764) https://www.nsfc.gov.cn/, Natural Science Foundation i Fujian-provinsen i Kina ( 2011J05099) https://www.fjkjt.gov.cn/. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige kræftformer i hele verden, og fortsætter med at være den førende årsag til kræft dødelighed [1]. Der er ca. 1000.000 nye lungekræft tilfælde og mere end 800.000 estimerede dødsfald hvert år i verden [2]. Trods de seneste fremskridt inden for diagnostiske og terapeutiske teknikker, den 5-årige samlede overlevelsesraten for patienter med lungecancer er stadig mindre end 15% [3]. Derfor er det tvingende nødvendigt at afsløre den molekylære mekanisme for lungekræft og finde nye kandidatlande biomarkører med potentielle kliniske værdi, hvilket vil fremme udviklingen af ​​mere effektive terapeutiske mål og behandlingsstrategier.

tumornekrosefaktor (TNF ) -alfa-induceret protein 8-like 2 (TNFAIP8L2), også kendt som TIPE2, er et medlem af TNFAIP8 familie og en nyligt beskrevet negativ regulator af både medfødt og adaptiv immunitet [4]. Det forhindrer hyper-responsivitet og opretholder immun homøostase via undertrykke TLR og TCR-funktion, og dens mangel i mus fører til multiorgansystemer inflammation [4]. Endvidere patienter med kroniske inflammatoriske sygdomme, såsom systemisk lupus erythematosus og hepatitis, TIPE2 ekspression også nedreguleres og omvendt korrelerer med sygdomsprogression [5,6]. Men forskellige fra murine TIPE2, som fortrinsvis udtrykkes i hæmatopoietiske celler, er humant TIPE2 også udtrykt i en lang række ikke-hæmatopoietiske celletyper [4,7,8]. Salg

Humant TIPE2 aktier ca. 53% identitet og 78% lighed aminosyresekvens med TNFAIP8, og ca. 94% homolog med murint TIPE2 [4]. Indledende undersøgelser viste, at andre medlemmer af IFU familie såsom TNFAIP8 og TIPE1 spille roller i carcinogenese i de fleste humane cancere [9-11]. Med høj opløsning krystalstruktur TIPE2 viser, at den indeholder en stor hydrofob centralt hulrum, som synes at være en DED-lignende domæne adskiller sig fra caspase-8 eller cFLIP [12]. Murin TIPE2 inhiberer MAPK’er og NFKB signalveje, som fremmer Fas-induceret apoptose [4]. Derudover overekspression af TIPE2 i mus resulterer i celledød og signifikant inhiberer Ras-induceret tumordannelse [13]. Men TIPE2 ikke påvises eller dårligt udtrykt i de fleste humane carcinoma cellelinier [7]. Disse resultater antyder, at der ud over inflammation, TIPE2 kan også være involveret i udvikling af cancer.

Forøgelse undersøgelser har været fokuseret på TIPE2 og humane cancere i de senere år. TIPE2 undertrykker TLR4-medieret udvikling af tyktarmskræft ved at hæmme caspase-8-aktivitet [14], mens dens udtryk er positivt korreleret med TNM mellemstationer i renalcellecarcinom (RCC) patienter [15]. For nylig er TIPE2 vist sig at være en endogen inhibitor af Rac1 i leveren, hvorved den undertrykte invasion og metastase af hepatocellulært carcinom (HCC) [16]. Men den rolle TIPE2 i lungekræft er uklar. I nærværende undersøgelse, giver vi beviser for det første indikerer, at TIPE2 undertrykker væksten og fremmer apoptose af lungekræft gennem regulering af Bcl-2 /Bax balance og derefter fører til aktivering af caspase-3 og caspase-9 eventuelt via påvirke P38 og Akt pathway .

Materialer og metoder

Etik erklæring

undersøgelsen blev godkendt af de Institutional Research etiske udvalg af The First Affiliated Sygehus af Xiamen University, og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter. Alle prøver blev håndteret og anonymiseres i henhold til de etiske og juridiske standarder. Alle dyreforsøg i denne undersøgelse blev godkendt af dyreforsøg etiske komité af Xiamen University.

Vævsprøver

De paraffinindstøbte lungekræft prøver blev anvendt til immunhistokemisk analyse. De paraffinindstøbte lungekræft prøver bestod af 25 lunge planocellulære kræft prøver, 20 lungeadenokarcinom prøver, 15 små lungekræft prøver og 30 tilstødende ikke-tumor lunge prøver. Alle patienter rekrutteret i denne undersøgelse fik hverken kemoterapi eller strålebehandling før operationen.

Celledyrkning, plasmid konstruktion og transfektion

De humane NCI-H446-cellelinjer blev købt fra Chinese Academy of Medical Sciences (Shanghai, Kina). Den H446 celle blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco) suppleret med 10% FBS (HyClone), 100 enheder /ml penicillin og 100 enheder /ml streptomycin. Celler blev holdt i en fugtig atmosfære med 5% CO

2 ved 37 ° C. Fuld længde human TIPE2 genet blev genereret ud fra cDNA-klonen ved PCR og herefter klonet ind i pRK5-vektoren ved standard molekylære teknikker og verificeret ved sekventering. Transfektion af tumorceller med vektor blev udført ved anvendelse af FuGENE HD transfektionsreagens (Promega) ifølge fabrikantens protokol. For at generere stabile transficerede cellelinier, blev transficerede celler udvalgt i RPMI 1640 medium indeholdende 500 ug /ml G418 i to uger for at isolere de dannede kolonier til yderligere ekspansion. Ved afslutningen af ​​transfektionen blev TIPE2 ekspression bekræftet ved Western Blotting.

Immunhistokemi (IHC)

paraffinindlejret prøver (4 um) blev anvendt til analyse som standard immunhistokemiske teknik. Kort fortalt blev snit inkuberet med anti-TIPE2 antistof (Abnova) natten over ved 4 ° C. Sekundær farvning blev udført med HRP-konjugeret sekundært antistof ved anvendelse af et Max Vision kit. Immunreaktivitet blev visualiseret ved hjælp af en DAB Peroxidase Substrat kit (Maixin Co, Fuzhou, Kina) og modfarvet med hæmatoxylin. I negative kontroller blev primære antistoffer erstattet af PBS. Alle IHC farvning blev uafhængigt evalueret af to erfarne patologer i et forsøg på at give en konsensus om farvede mønstre ifølge en scoring metode, som tidligere [17,18] beskrevet. Mindst 10 high-power felter, udvalgt tilfældigt, og 1000 celler blev talt for hver prøve. Hvert tilfælde blev scoret efter intensiteten og området for farvning. Intensiteten af ​​farvning blev gradueret på følgende skalaer: 0, ingen farvning; 1+, mild farvning; 2+, moderat farvning; 3+, intens farvning. Arealet af farvning blev bedømt som følger: 0, ingen farvning af celler i eventuelle mikroskopiske felter; 1+, 30% af væv farvet positive; 2+, 30-60% farvet positive; 3+, 60% farvet positive. En kombineret farvning score (intensitet + udvidelse) på mellem 0 og 3 blev anset for at være lav udtryk, mens en score mellem 4 og 6 blev anset for at være høj ekspression.

Western blotting

Celler blev høstet og lyseret i lyseringspuffer med proteinase inhibitor cocktail (Roche) og PMSF (Sigma). Derefter 30 ug lysater fra hver prøve blev separeret ved 10% SDS-PAGE og overført til PVDF-membraner. Membraner blev blokeret med 5% fedtfri mælk og probet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer: anti-TIPE2 (fortynding 1: 800; Abnova), anti-caspase-3 p17 (fortynding 1: 400; Santa Cruz), anti-caspase-9 (fortynding 1: 400; Santa Cruz), anti-Bcl-2 (fortynding 1: 200; Santa Cruz), anti-Bax (fortynding 1: 1000; Santa Cruz), anti -ERK (fortynding 1: 1000, CST), anti-phospho-ERK (fortynding 1: 1000; R Abcam), derefter fulgt af peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer (anti-kanin eller muse IgG, 1: 5000; Santa Cruz) i 1 time ved stuetemperatur. Efter vask blev blots fremkaldt under anvendelse af ECL påvisningsreagens (GE Healthcare) og kvantificeret ved densitometri under anvendelse af ImageQuant billedanalysesystem (Storm optisk scanner). blev udført alle forsøgene uafhængigt tre gange mindst.

Kolonidannelse assay

Celler blev podet i seks-brønds plader ved en densitet på 500 celler per brønd og erstattet mediet hver 3 dage . To uger senere blev cellerne vasket af PBS og fikseret med methanol i 15 minutter, derefter farvet med krystalviolet. Kolonier, som bestod af mere end 50 celler blev talt og beregnet som en procentdel af den for kontrolgruppen. Eksperimentet blev udført uafhængigt tre gange mindst.

MTT assay

Cellelevedygtighed blev detekteret ved MTT-assayet. I alt 3000 celler pr brønd blev podet i plader med 96 brønde med tre tredobbelte brønde. Efter inkubation i 24 timer, 10 pi MTT (500 mg /ml; Sigma-Aldrich) blev tilsat til mediet og dyrket i yderligere 4 timer. Derefter blev mediet kasseret, og 150 pi dimethylsulfoxid (Sigma-Aldrich) blev tilsat for at opløse formationen produkt. Til sidst blev absorbansen af ​​hver brønd målt ved en bølgelængde på 490 nm. Hvert assay blev gentaget tre gange mindst.

Flowcytometrisk analyse

Virkningen af ​​TIPE2 på celleapoptose blev bestemt ved FITC Annexin V-farvning efterfulgt af flowcytometrisk analyse. Celler blev vasket to gange med kold PBS og resuspenderet i 1 × bindingspuffer (BD Biosciences) ved en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml. 100 pi af opløsningen blev overført til en 5 ml kultur rør, derefter 5 pi FITC Annexin V (BD Biosciences) og 10 pi PI (BD Biosciences) tilsat ind i røret. Derefter blev cellerne blandet forsigtigt og inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke. Endelig blev 1 ml PBS tilsat til hvert rør, og prøver blev analyseret ved flowcytometrisk inden for 1 time. Alle forsøg blev gentaget tre gange.

In vivo

tumorigenese assay

Seks uger gammel mand BALB /c nøgne mus blev købt fra Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina) og vedligeholdes i specifikke patogenfrie betingelser. 5 × 10

6 H446-celler transficeret med TIPE2 over-udtrykkende vektor (TIPE2 gruppe) i 100 pi PBS blev injiceret subkutant i højre flanke, mens kontrolvektor (kontrolgruppe) i venstre flanke af de nøgne mus, 10 nøgne mus blev anvendt i dette eksperiment. Tumorstørrelse blev målt hver anden dag og tumorvolumenet blev beregnet efter følgende formel: længde × bredde × bredde × 0,5. Omkring seks uger senere blev alle musene aflivet ved cervikal dislokation, så tumorerne blev fjernet, vejet og fikseret i formalin til den efterfølgende analyse.

Statistisk analyse

Alle statistiske analyser blev udført under anvendelse af SPSS 13.0 software. Den χ

2 test blev anvendt til analyse af TIPE2 ekspression mellem lungekræft undertyper og tilstødende ikke-tumorvæv. Den t-test blev anvendt til sammenligning mellem forskellige grupper. Forskellene i tumorvækst og vægt mellem to grupper af nøgne mus blev evalueret ved gentagne-foranstaltninger variansanalyse.

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

TIPE2 ekspression blev nedreguleret eller tabt i lungerne skællede kræft og småcellet lungecancer væv

Nye undersøgelser allerede afsløret, at TIPE2 udtryk var signifikant korreleret med nogle kræftformer som RCC og HCC [15]. Imidlertid TIPE2 ekspressionsmønsteret i lungekræft er uklart hidtil. For at vurdere forholdet mellem TIPE2 udtryk og lungekræft væv, vi har registreret udtrykket status TIPE2 i almindelige histologiske typer af lungekræft væv ved immunhistokemi, herunder 25 lunge adenocarcinom væv, 20 lunge pladecarcinom væv, 15 småcellet lungekræft væv og 30 hosliggende ikke-tumor lungevæv. Som vist i (Fig 1A og 1B), i ikke-tumor lungevæv blev TIPE2 stærk farvning observeret i lunge epiteliale alveolære celler og bronkiale celler. Og i bronkiale epithelials med skællede metaplasi, TIPE2 havde stadig stærk farvning (Fig 1C). I lungekræft væv, viste TIPE2 stærk farvning i primær lungeadenocarcinom og lymfeknudemetastase væv (Fig 1D, 1E og 1F), men udviste meget svag farvning i lungerne skællede kræft og endda næsten ingen farvning i de fleste af småcellet lungecancer (Fig 1G, 1H og 1I). Interessant (Fig 1 H) viste meget svag TIPE2 udtryk i reder af lunge skællede kræftceller (røde pile) og en stærk farvning af TIPE2 i de tilstødende bronchiale epithelials samtidigt. I lungekræft stroma blev ingen plet af TIPE2 fundet i fibroblastceller, men stærk farvning kunne findes i inflammatoriske celler såsom plasmocytes og macrophagocytes. I positive kræftceller blev TIPE2 farvning overvejende findes i cytoplasmaet, men sjældent med nukleare. Statistisk analyse (tabel 1) indikerede TIPE2 ekspression blev signifikant nedreguleret i lunge skællede cancer og småcellet lungecancer væv sammenlignet med de ikke-tumor lungevæv, mens ingen forskel mellem lungeadenocarcinom og ikke-tumor-lungevæv. Resultaterne viste, at TIPE2 blev nedreguleret i nogle histologiske undertyper af lungekræft, der opfordrede os til yderligere at undersøge den særlige rolle og underliggende mekanisme af TIPE2 i udvikling lungekræft.

Repræsentative billeder af TIPE2 udtryk i alveolær epitel (A), bronkial epitel (B), bronchial epitel med skællede metaplasi (C), lunge bruger ADC (D, E), positiv lymfeknude af lunge bruger ADC (F), lunge squamous cancer (G, H) og småcellet cancer (i).

TIPE2 hæmmede væksten og fremmet apoptose af lungekræft celle

in vitro

for at undersøge potentialet biologiske funktion af TIPE2 i lungekræft, vi undersøgt virkningerne af TIPE2 på cellevækst for lungekræft celle H446 ved MTT assay og kolonidannelse assay, og apoptose ved flowcytometrisk. Til opregulere TIPE2 udtryk i H446, TIPE2 over-udtrykkende vektor blev konstrueret og transficeret stabilt i H446 celler. Western blotting valideret TIPE2 udtryk i H446 celler utransficerede (H446 /Null), kontrol vektor-transficerede (H446 /kontrol) og TIPE2 over-udtrykkende vektor transficeret (H446 /TIPE2). Som vist i (Fig 2A), H446 /Null og H446 /Kontrol viste næsten ingen TIPE2 udtryk, mens H446 /TIPE2 afslørede højt TIPE2 udtryk. MTT assay (Fig 2B) og kolonidannelse assay (Fig 2C) analyse viste reduktion af cellernes levedygtighed og færre kolonier observeret i H446 /TIPE2 sammenlignet med H446 /Kontrol og H446 /null celler, som angivet TIPE2 kunne hæmme lungekræft cellevækst . Cancercellevækst er påvirket af to vigtigste faktorer, herunder celleproliferation og apoptose. Det blev rapporteret, at murine TIPE2 kunne fremme Fas-induceret apoptose [4]. Har TIPE2 potentielle rolle på apoptose af lungekræft? Derfor har vi anvendt flowcytometrisk at afsløre effekten af ​​TIPE2 på apoptose af H446. Som vist i (Fig 2D), den tidlige apoptose på H446 /TIPE2, H446 /Kontrol og H446 /Null var 21,08%, 9,21% og 9,15% henholdsvis, som viste over-udtrykkende TIPE2 væsentlig grad kan øge apoptose sats. Disse resultater foreslog TIPE2 effektivt kan undertrykke væksten og fremme apoptose af H446 celler

in vitro

.

(A), TIPE2 overekspression i H446 transficeret med TIPE2 plasmid. (B), Cell levedygtigheden faldt efter TIPE2 overekspression. (C), H446 /TIPE2 havde færre kolonidannelse i forhold til vektor. (D), TIPE2 opregulering forøgede den apoptotiske sats betydeligt. * Angivet

P

0.05.

TIPE2 reguleret Bcl-2 /Bax balance, forbedrede spaltede caspase-3 og caspase-9 niveauer

Resultaterne ovenfor nævnt viste TIPE2 kunne fremme apoptose af H446 celler. Så vi var yderligere interesseret i den underliggende mekanisme af det. Det har været velkendt, at Bcl-2 /Bax balance spiller en vigtig rolle i celle apoptose [19], så vi undersøgte virkningen af ​​TIPE2 ekspression på Bcl-2 /Bax balance. Som vist i figur 3, der overudtrykker TIPE2 kunne øge Bax ekspression mens formindske Bcl-2-ekspression, hvilket indebar, at funktionen af ​​TIPE2 på celleapoptose kan være forbundet med Bcl-2 /Bax balance. Desuden er det blevet påvist, at caspase spiller en afgørende rolle i udførelsen af ​​endelige sti af apoptose [20]. Vi yderligere undersøgt, om TIPE2 ville påvirket aktiveringen af ​​apoptotiske molekylære caspaser, såsom caspase-3 og caspase-9. Derfor opdaget vi udtryk for spaltede caspase-3 og caspase-9 i H446 /Null, H446 /Kontrol og H446 /TIPE2. Som vist i figur 3, TIPE2 forbedret de spaltede caspase-3 og caspase-9 ekspressionsniveauer, som foreslog TIPE2 kunne fremme aktiveringen af ​​caspase-3 og Capase-9.

(A), Western blot-analyse af bcl-2, Bax, caspase-3 og caspase-9-ekspression i H446, vektor, TIPE2. (B), Histogram af de relative ekspressionsniveauer af de ovenfor nævnte apoptose-relaterede molekyler.

TIPE2 øget aktivering af P38 MAPK pathway, mens hæmme aktivering af Akt

Vi har også udforskede virkningen af ​​TIPE2 på flere signalveje ved at analysere centrale signalmolekyler involveret. Vi fandt, at P38 og Akt vej, men ikke ERK vej og NF-KB-vejen, var mål for TIPE2 handling. Højniveauekspression af phosphoryleret P38 MAPK blev påvist i H446 celler overudtrykker TIPE2, mens relativt lavt niveau ekspression i null og kontrolceller (fig 4), hvilket indikerede, at TIPE2 kan aktivere P38 MAPK-vejen. Men niveauet af phosphoryleret Akt blev signifikant reduceret i H446 celler overudtrykker TIPE2 sammenlignet til null og kontrolceller (Fig 4). Derudover undersøgte vi også udtryk for andre signalmolekyler såsom phospho-ERK, phospho-MEK og phospho-kBa i H446 /Null, H446 /Kontrol og H446 /TIPE2, blandt hvilke lille eller ingen forskel blev bemærket (Fig 4 ). Tilsammen disse data viste, at TIPE2 kunne regulere P38 og Akt pathway, hvor TIPE2 var en positiv regulator af P38 vej mens negativ regulator af Akt pathway.

(A), Western blot analyse af nogle fælles signalmolekyler udtryk i H446, vektor, TIPE2. (B), Histogram af de relative ekspressionsniveauer af de ovennævnte signalmolekyler.

TIPE2 tydeligvis hæmmede tumordannelse

in vivo

Ovennævnte resultaterne viste TIPE2 kunne effektivt undertrykke væksten og fremme apoptose af H446 celler

in vitro

. Dernæst undersøgte vi dens virkning på tumorigenese

in vivo

. H446-celler transficeret med kontrolvektor eller TIPE2-udtrykkende vektor blev injiceret subkutant i nøgne mus til at indlede tumordannelse. Fra kurven af ​​tumorvækst (figur 5B), blev tumoren volumen TIPE2-udtryksgrupper faldt betydeligt sammenlign vektoren grupper. Omkring seks uger senere blev alle grupper af nøgne mus aflivet, og tumorerne blev isoleret og vægtede (Fig 5A). Den samlede gennemsnitlige tumorstørrelse af TIPE2-udtryksgrupper var betydeligt mindre end den af ​​vektoren grupper, hvilket var i overensstemmelse med de tumorvægte (Fig 5C). Alle disse resultater viste, at overekspression af TIPE2 kunne hæmme den subkutane tumorvækst

in vivo

naturligvis. Som ovennævnte, overekspression af TIPE2 haft betydelige konsekvenser for den måde, nogle apoptotiske molekyler i H446 celler

in vitro

, såsom Bcl-2, Bax, caspase-3 og caspase-9. Så er det nødvendigt at belyse effekten af ​​TIPE2 på disse molekyler udtryk i tumorer fra nøgne mus

in vivo

. Tumorerne fra nøgne mus blev isoleret, fikseret, indlejret og gjort i sektioner, som derefter blev farvet ved immunohistochemistrical analyse. Resultaterne viste overekspression af TIPE2 mens en forøget ekspression af Bax, caspase-3 og caspase-9 og en reduceret ekspression af Bcl-2 i TIPE2-overekspression tumorer (figur 6), som var magen til resultaterne

in vitro

. Vi har detekteret også udtryk for Ki-67, en spredning markør, i ovennævnte tumorer. Ingen ændring på Ki-67-ekspression blev påvist uanset TIPE2 overekspression (figur 6), hvorved vi spekuleret på, at TIPE2 hæmmer tumorvækst primært tillægge dens funktion at fremme apoptose af H446 celler, men ikke via påvirker spredning.

(A), et repræsentativt billede af de isolerede tumorer. (B), Subkutan tumorvækst kurve af nøgne mus injiceret med H446 /vektor og H446 /TIPE2. (C) den gennemsnitlige tumor vægte af vektor og TIPE2 gruppe. * Angivet

P

0.05.

Magification, 200 ×.

Diskussion

TIPE2 tilhører IFU (TNFAIP8) familie, der er et nyligt identificeret gruppe af proteiner, herunder fire medlemmer, TNFAIP8, TIPE1, TIPE2 og TIPE3 [4]. TNFAIP8 er associeret med forøget celleoverlevelse og inhibering af apoptose [21]. Knocking ned udtryk for TNFAIP8 i tumorceller kan reducere deres tumorigenicitet [22]. Alle disse beviser understøtter, at IFU er et onkogen, og det kan være forbundet med cellens overlevelse og maligne vækst-relaterede signalveje [11]. Højt niveau af TIPE1 mRNA detekteres i de fleste humane carcinoma cellelinier, hvilket antyder, at det kan spille en rolle i carcinogenese [11]. I modsætning TNFAIP8 og TIPE1 blev TIPE2 primært fundet spillet en afgørende rolle i immunitet. Som rapporteret, TIPE2 var et hidtil ukendt gen, som opretholder immun homøostase og negativt regulerer medfødte og adaptive immunitet [4]. Men oplysninger om TIPE2 i human cancer er begrænset.

Et par undersøgelser om forholdet mellem TIPE2 med kræft allerede verificeret TIPE2 havde nogle funktion i udviklingen af ​​kræft. I nyere forskning, blev TIPE2 tænkt som en tumor suppressor i hepatocellulært carcinom [16]. Forholdet mellem TIPE2 og lungekræft er ukendt indtil nu. I vores foreliggende undersøgelse påviste vi, staten TIPE2 ekspression i lungekræft. Vi fandt, at TIPE2 ekspression blev nedreguleret i lunge pladecarcinom og endda næsten tabt i småcellet lungecancer. Men i lunge adenocarcinom, blev TIPE2 stærk ekspression fundet, men ingen forskel mellem ikke-tumor lungevæv og lunge adenocarcinom blev analyseret. Disse resultater viste TIPE2 ekspressionsmønstre kan være forskellige mellem forskellige histologiske undertyper af lungekræft, der foreslog TIPE2 kunne spille nogle forskellige biologiske roller i forskellige histologiske typer af lungekræft. For at finde ud TIPE2 udtryk i alle former for lungekræft, increaseing antallet af prøver lungekræft i fremtiden undersøgelse kan være nødvendig.

Desuden er denne undersøgelse foreløbigt fortolket den biologiske funktion af TIPE2 i lungekræft. Over-udtrykkende TIPE2 forfremmet apoptose af H446 celler

in vitro

og hæmmede tumorvækst

in vivo

. På molekylært niveau, TIPE2 reguleret Bcl-2 /Bax balance og aktiveret caspase-3 og caspase-9.

Interesseret i at kigge ind i de specifikke signalmolekyler muligvis reguleret af TIPE2, så screenede vi udtryk for nogle fælles signalmolekyler efter TIPE2 overekspression. Høj udtryk for phosphoryleret P38 MAPK niveau blev opdaget efter TIPE2 opregulering. Nylige undersøgelser har antydet en nøglerolle for P38 MAPK ved mediering, der fører til apoptose og væksthæmmende signaler [23,24]. Derudover P38 MAPK udløser aktiveringen af ​​caspase-3, 9 og er også nødvendigt, at phosphorylering af apoptose-relaterede proteiner, herunder Bax, Bim og Bcl-2 i OA-behandlede cancerceller [25]. Kombineret med disse resultater, vi spekulere at TIPE2 fremmer lungekræft celle apoptose gennem aktivering af P38 MAPK, som udløser overekspression af caspase-3 og caspase-9. Derudover har vi også fundet, at TIPE2 faldt den phosphorylerede niveau af Akt. Som rapporteret, Akt pathway er en central signaltransduktionsvej, der regulerer mange kritiske aspekter af cancer fysiologi, herunder celleproliferation, cellemorfologi, migration og apoptose [26]. I mellemtiden er nogle apoptose-relaterede molekyler, såsom Bcl-2, Bax, caspase-3 og caspase-9 påvirkes tydeligt af TIPE2. Så vores resultater giver en masse beviser for, at TIPE2 fremmer lungekræft apoptose. Interessant, fandt vi Ki-67-ekspression havde ingen ændring efter TIPE2 overekspression, hvilket indikerede, at TIPE2 hæmmede lungekræft vækst tillægge fremme celle apoptose.

Samlet set TIPE2 fungerer som en tumor suppressor at fremme lunge cancercelle apoptose. Derfor kan den tvungne ekspression af human TIPE2 være en ny strategi til behandling af lungecancer.