PLoS ONE: Øget ekspression af PITX2 Transskription Factor Bidrager til kræft i æggestokkene Progression

Abstrakt

Baggrund

Parret-lignende homeodomæne 2 (PITX2) er en bicoid homeodomæne transskription faktor, som spiller en væsentlig rolle i at opretholde embryonale venstre-højre asymmetri i hvirveldyr embryogenese. Men nye oplysninger tyder, at den afvigende opregulering af PITX2 kan være forbundet med tumor progression, men den funktionelle rolle, PITX2 spiller i tumorigenese fortsat ukendt.

vigtigste resultater

Brug real-time kvantitativ RT -PCR (Q-PCR), Western blot og immunhistokemiske (IHC) analyser, vi demonstreret, at PITX2 ofte blev overudtrykt i ovariecancer prøver og cellelinier. Klinisk-patologisk korrelation viste, at den opreguleret PITX2 var signifikant forbundet med høj kvalitet (

P

= 0,023) og klar celle undertype (

P

= 0,011) ved hjælp af Q-PCR og høj kvalitet (

P

0,001) kræft i æggestokkene ved IHC-analyse. Funktionelt, tvungen udtryk for PITX2 kunne fremme kræft i æggestokkene celleproliferation, forankringsuafhængig vækst evne, migration /invasion og tumorvækst i xenograft model mus. Desuden tvungen udtryk for PITX2 ophøjet cellecyklus regulerende proteiner såsom cyclin-D1 og C-myc. Omvendt RNAi-medieret knockdown af PITX2 i PITX2-høj udtrykker ovariecancerceller haft den modsatte effekt.

Konklusion

Vores resultater tyder på, at den øgede udtryk PITX2 er involveret i kræft i æggestokkene progression ved at fremme celle vækst og cellemigration /invasion. Således målrettet PITX2 kan tjene som en potentiel terapeutisk modalitet i forvaltningen af ​​høj kvalitet i æggestokkene tumor

Henvisning:. Fung FKC, Chan DW, Liu VWS, Leung THY, Cheung NOGEN, Ngan HYS (2012) Øget Ekspression af PITX2 Transskription Factor Bidrager til kræft i æggestokkene Progression. PLoS ONE 7 (5): e37076. doi: 10,1371 /journal.pone.0037076

Redaktør: Qiang Wang, Cedars-Sinai Medical Center, USA

Modtaget: Januar 29, 2012; Accepteret: 13. april, 2012; Udgivet: 15. maj 2012 |

Copyright: © 2012 Fung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Wong Check Hun Charitable Foundation. Denne støtte er fra private donationer, og ingen bidragyder hjemmeside er tilgængelig. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kræft i æggestokkene er en af ​​de mest almindelige kræftform blandt kvinder i hele verden [1] .Den høj dødelighed af kræft i æggestokkene skyldes den sene diagnose og dårlig terapeutisk respons fordi sygdommen ofte er manifesteret med lidt eller ikke-specifikke symptomer på det tidlige stadium [2], [3], [4]. Kræft i æggestokkene kan inddeles i fire undertyper; serøs, endometrioide, mucinøs og klar celle, baseret på histologiske differentiering af æggestokkene epitel og underliggende genetiske ændringer [3], [5], [6]. Indplaceringen af ​​æggestokkene tumor er kategoriseret i overensstemmelse med International Federation of Gynækologi og Obstetrik (FIGO) systemet, afslører, at high-grade tumor udviser karakteristiske for hurtigere cellevækst og dårlig prognose samt kemoresistens sammenlignet med lav kvalitet tumor [7], [8].

Parret-lignende homeodomæne 2 (PITX2) transskription faktor er medlem af bicoid homeodomæne familie og spiller en vigtig rolle i embryogenese af hvirveldyr [9]. Adskillige undersøgelser har rapporteret, at mutation af PITX2 er forbundet med patogenesen af ​​Axenfeld-Rieger syndrom (ARS), som er en autosomal dominant sygdom hos mennesker er kendetegnet ved udviklingsmæssige defekter af øjet, tænder og hjerte [6]. Nylige rapporter har dokumenteret, at PITX2 er overudtrykt i ikke-funktionelle hypofyseadenomer [10], lymfeknude-positiv kolorektal cancer [11] og kræft i skjoldbruskkirtlen [12]. Endvidere inhibering af PITX2 ekspression ved shRNA i skjoldbruskkirtlen cancerceller væsentligt reduceret kapacitet af cellevækst i blød-agar-assay, hvilket antyder, at PITX2 kan have onkogent potentiale og kan være involveret i tumorudvikling [12].

den foreliggende undersøgelse har vi påvist, at PITX2 ofte blev opreguleret og var signifikant associeret med høj kvalitet ovariecancer. Brug af ovariecancercellelinjer modeller, afslørede vi, at opreguleret PITX2 kunne løfte cellecyklus-regulatorer, såsom CyclinD1 og C-myc, og fremme celleproliferation, cellemigration /invasion samt tumorvækst i xenograft model mus. Vores resultater giver yderligere indsigt til onkogene rolle PITX2 ved mediering ovariecancer tumorigenese.

Materialer og metoder

Kliniske prøver og cellelinier

Kirurgisk resektion af 97 tumorprøver fra primære ovariecancer patienter og normale æggestokke prøver fra godartet sygdom blev tilfældigt udvalgt til Q-PCR-analyse. Den histologiske undertype og fase af tumorer blev kategoriseret efter International Federation of Gynækologi og Obstetrik (FIGO) klassificering. Skriftligt informeret samtykke blev taget af de ovennævnte deltagere og brugen af ​​disse kliniske prøver blev godkendt af Institutional Review Board fra University of Hong Kong /Hospital Myndighed Hongkong West Cluster (HKU /HA HKW IRB) (Institutional Review Board nummer: UW05- 143 T1806). To udødeliggjort menneskelige æggestokkene overflade epitelceller blev anvendt: HOSE 10-2 og HOSE 17-1 (venligst stillet til rådighed af professor George Tsao, The University of Hong Kong) [13]. En immortaliseret human oviductal epitelcellelinje, OE-E6 /E7, blev opnået fra Dr. Calvin Lee (The University of Hong Kong) [14]. Ni æggestokkene cancer cellelinjer blev anvendt: OV2008, C13 *, A2780s, A2780cp (venligst stillet til rådighed af professor Benjamin Tsang, The University of Ottawa) [13], [15], OV420, OV429, OV433, OVCAR3, SKOV-3, TOV21G , muse fibroblast Wnt3a L-celler og humane embryonale nyre-293-celler (HEK 293) (America Type Culture Collection, Rockville, MD, USA). Alle cellelinier blev dyrket i enten minimum essential medium eller Dulbeccos modificerede Eagle medium med 10% føtalt bovint serum og 1% penicillin-streptomycin i 75 cm

2 kolber og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2.

plasmider og celle transfektion

PCI-

HA-PITX2A

udtrykke plasmid (gave fra Dr. Kathy Kozlowski, University of Michigan) blev anvendt til ektopisk ekspression af HA-mærket PITX2A. Plasmidet indeholder fuld længde menneske

PITX2A

cDNA og dens udtryk var drevet af CMV-promotoren. PCI-vektor blev anvendt som negativ kontrol. Den HuSHpGFP-V-RS plasmidvektor og korte hårnål RNA-interferens (shRNA) målretning

PITX2

i pGFP-V-RS vektor (pGFP-V-RS

PITX2

) blev købt fra OriGene Technologies (OriGene Technologies, Inc, Rockville, MD, USA). The shRNA sekvens målretning

PITX2

var 5 ‘GCC GTT GAA TGT CTC TTC TCC AAA GAC TC 3’.Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen Life Technologies, Carlsbad, CA, USA) blev anvendt til celletransfektion ifølge producentens instruktioner. Stabile celler, der overudtrykker PITX2A eller knockdown af PITX2 blev høstet efter 14 dages puromycin (1 pg /ml) udvælgelse og verificeret ved Western blot-analyse.

RNA ekstraktion og revers transkriptase-PCR

Total RNA fra de kliniske prøver og de dyrkede celler blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen). CDNA’et blev fremstillet ved anvendelse af omvendt transkription reagens kittet (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Den kvantitative revers transkriptase-PCR (Q-PCR), der anvendes til evaluering af de udtryk for

PITX2

,

cyclin-D1

C-myc

blev udført af TaqMan® Gene ekspressionsassays; menneskelig

PITX2

(Assay ID: Hs00165626_m1), menneskelig

cyclin-D1

(Assay ID: Hs00765553_m1) og human

C-myc

(Assay ID: Hs00153408_m1), i en ABI PRISM ™ 7500-system (Applied Biosystems). Den menneskelige

18S rRNA

(Assay ID: Hs99999901_m1) blev anvendt som en intern kontrol

Western blot-analyse

Celler blev lyseret ved lysisbuffer (Cell Signaling Technology), der indeholder. proteaseinhibitor (Sigma) og phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF) (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). De proteinprøver blev adskilt ved 10% SDS-PAGE og elektroblottet på de Hybond-P-membraner (Amersham Pharmacia Biotech, Cleveland, OH, USA). Blots blev blokeret med 5% skummetmælk, efterfulgt af inkubation med PITX2 (C16) og c-myc (N262) (Santa Cruz Biotechnology, Inc., Santa Cruz, CA, USA), cyclin-D1 og β-Catenin (Cell Signaling ), Anti-HA og β-actin (Sigma) natten over ved 4 ° C. Blots blev derefter inkuberet med anti-muse, anti-kanin (Amersham Pharmacia Biotechnology) og anti-ged (Santa Cruz) sekundære antistoffer konjugat med peberrodsperoxidase i 1 time i stuetemperatur og fremkaldes med ECL ™ Western Blotting Detection Reagent (Amersham).

For immunhistokemisk analyse, to kommercielle ovariecancer væv arrays (OVC1021 og OVC481, Pantomics Inc, San Francisco, CA) blev immunfarvet med primær kanin polyklonale anti-PITX2 antistof (AbcamInc, Cambridge, MA, USA) i en :200 fortynding. Den farvede sektion blev identificeret som positive eller negative. For de immuno-positive prøver blev intensiteten af ​​farvning (+1, svag, +2 moderat, +3 stærk og +4 meget stærk) og andelen af ​​farvede område (0-100%) scoret. Immunoreaktiviteten af ​​hver prøve blev bestemt ved at multiplicere intensiteten og procentdelen af ​​farvede område. Middelværdien af ​​immunoreaktivitet værdi af normale og grænsetilfælde blev anvendt til at normalisere alle tilfælde. Alle vævssnit blev undersøgt og scoret uafhængigt af to efterforskere.

Cell levedygtighed assay

Cell levedygtighed blev analyseret ved celledeling kit (XTT) (Roche Applied Science, Indianapolis, IN, USA) i overensstemmelse til producentens anvisninger. Hver prøve blev udført tre eksemplarer og tre uafhængige forsøg blev udført.

Soft-agar assay

I alt 1 × 10

4-celler blev fremstillet i 1,5 ml fuld medium indeholdende 0,6% agarose. Blandingerne blev tilføjet på størknede bundlag indeholdende 1% agar i 2 ml komplet medium. Levedygtige kolonier blev talt og fotograferet efter 14-36 dage. Forsøget blev udført i tre eksemplarer og gennemført tre gange uafhængigt af hinanden.

sårheling assay

Celler blev podet i en plade med seks indtil det nåede fuld sammenløb i et monolag. Derefter blev mediet i hver brønd erstattet med frisk medium indeholdende Mitomycin C (10 ug /ml) (Sigma) og inkuberet i 3 timer ved 37 ° C.A. enkelt sår blev skabt i midten af ​​hver brønd med en mikro-pipettespids. Pladen blev inkuberet ved 37 ° C ved 5% CO

2. Billedet af sårlukning blev taget på forskellige tidsforløb. Den relative migrationsrate blev udtrykt som relativ bredde af sår /tid. Tre uafhængige forsøg blev udført tredobbelt.

Transwell cellemigration og invasion assay

Kvantificering af cellemigration og invasion blev udført under anvendelse QCM ™ 24-Well Kolorimetrisk cellemigrationsassay (Millipore Corporation, Billerica, MA, USA) og celleinvasion Assay Kit (Chemicon International, Temecula, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Tre forskellige områder af de farvede celler blev fotograferet og talt for hver brønde. blev udført Eksperimenterne tre gange uafhængigt af hinanden.

In vivo

tumor xenograftmodel

For at undersøge om PITX2 overekspression fremmer tumorvækst

in vivo

, PITX2 stabilt overudtrykt SKOV-3-celler blev injiceret subkutant i nøgne mus. Diameter af tumoren blev målt hver tredje dag, og musene blev oprevne en måned efter injektionen. Tumorvolumenet blev beregnet som (gennemsnit af diametre)

3 × π /6. Alle eksperimenter dyr blev godkendt af University of Hong Kong Komité for anvendelsen af ​​levende dyr i undervisning og forskning (CULATR nr 2053-09).

Dataanalyse

Data blev præsenteret som gennemsnit ± SD. Studerendes

t

-test blev anvendt til analyse parametriske data. En

P

-værdi af. 0,05 blev betragtet som signifikant i alle eksperiment

Resultater

UpregulatedPITX2 er observeret i æggestokkene cancerceller

På trods af de funktioner af PITX2 under embryogenese er blevet grundigt undersøgt, de funktionelle roller PITX2 i humane cancere forbliver stort set ukendt. Her har vi vurderet udtrykket status

PITX2

i kræft i æggestokkene prøver (n = 97), normale æggestokke (n = 54), normal ovarie cellelinjer, herunder to slanger (SLANGE 10-2 og slange 17-1 ) og en immortaliseret human oviductal epitelcellelinie (OE-E6 /E7) af Q-PCR. Vi fandt, at

PITX2

var signifikant opreguleret i kræft i æggestokkene prøver (-15 folder) sammenlignet med normale æggestokke og æggestokkene cellelinier (

P

0,001) (figur 1A). Klinisk-patologisk korrelation viste, at den overudtrykt

PITX2

blev bemærkelsesværdigt forbundet med høj kvalitet (grad 3) (

P

= 0,023) og klar celle undertype ovariecancer (

P

= 0,011) (tabel 1). Men der var ingen signifikant sammenhæng mellem overudtrykt

PITX2

og andre parametre såsom alder, scene og tilbagefald (tabel 1). Desuden blev Western blot-analyse også udført for at sammenligne ekspressionen af ​​PITX2 i et panel af humane ovarie cancer-cellelinjer og normale æggestokkene overfladeepitelet (slanger) celler. Sammenlignet med slanger cellelinjer blev en udbredt stigning i PITX2 ekspression observeret i alle æggestokkene cancercellelinier (figur 1B). Derudover vores Western blot data viste også, at PITX2 var naturligvis opreguleret i en klar celle subtype ovariecancer cellelinie (TOV21G) sammenlignet med OE-E6 /E7 (fig S1A), den immortaliserede normal æggeleder epitelcellelinie. Dette resultat bekræfter yderligere de ovennævnte klinisk-patologiske fund. For yderligere at evaluere proteinniveauet af PITX2 i kræft i æggestokkene prøver blev immunhistokemisk farvning af PITX2 udføres i et ovariecancer vævsarray (OVC481), som omfatter 16 tilfælde af ovariecancer prøver parret med normale ovarier. I overensstemmelse med Q-PCR resultater, forøget ekspression af PITX2 blev normalt observeret i kræft i æggestokkene prøver især i høj kvalitet eller udifferentierede tumorer sammenlignet med deres tilsvarende uengagerede normale æggestokkene væv (Figur S1B). Desuden undersøgte vi ekspressionen af ​​PITX2 i en større pulje af kræft i æggestokkene prøver ved hjælp af en anden kommerciel æggestokkene kræftvæv array (OVC1021), som omfatter to normal, 2 godartet, en borderline cystademoma og 97 maligne tumor prøver. Vores konklusion viste, at opreguleret PITX2 var signifikant korreleret med høj kvalitet ovarietumor kun (

P

0,001). Og var i overensstemmelse med resultatet af Q-PCR-analyse (tabel 2)

(A) Kvantitativ RT-PCR analyse blev udført i normale æggestokke (n = 54) og ovariecancer prøver (n = 97) ved hjælp af

PITX2

primer. 18S og TATA-box-bindende protein (TBP) blev anvendt som intern loading kontroller. *

P

0,001. (B) Western blot-analyse under anvendelse af anti-PITX2 antistof til at vurdere ekspressionsniveauet af PITX2 (isoformer A, B og C)) (35 kDa) i æggestokkene cancercellelinier (n = 9) og slange cellelinier (n = 2) . β-actin blev anvendt som en loading kontrol. (C) immunhistokemisk analyse af PITX2 udtryk (nuklear farvning) i borderline cystadenoma og høj kvalitet (3) serøs cystadenocarcinoma på en æggestokkene kræftvæv array (OVC1021). Forstørrelse:. 20 × Vejviser

PITX2 øger cellevækst i æggestokkene cancerceller

I betragtning af at opreguleret PITX2 var forbundet med høj kvalitet ovariecancer, kan PITX2 besidder onkogene funktioner i mediering af aggressiv fænotype i æggestokkene cancerceller. For at teste dette begreb, vi først genereres PITX2 stabile udtrykkende kloner fra to high-grade ovariecancer cellelinier (SKOV3 og OVCA433) (figur 2A). På den anden side, blev en anden high-grade æggestokkene cancercellelinier med PITX2-høj ekspression (OV2008), samt OVCA433 valgt til stabil knockdown af PITX2 hjælp vektorbaseret RNAi tilgang. Fire shRNA konstrukter målretning på forskellige steder af PITX2 åbne læseramme blev transient transficeret ind i cellerne henholdsvis og to af dem (K1 og K2) gav 50-70% reduktion af endogen PITX2 blev valgt til stabil transfektion (figur 2B). Ved XTT celleproliferationsassay, den relative vækst af PITX2 stabilt udtrykker kloner i SKOV3 og OVCA433 celler var signifikant højere (1,5- til 3 gange) end deres vektor kontrollerne (figur 2C). Omvendt, udtømning af PITX2 i OV2008 og OVCA433 celler væsentligt forringet deres celledeling rente med 2 til 3 gange i forhold til deres scrambled kontroller (Figur 2D).

(A) PITX2A stabile udtrykker kloner blev etableret i SKOV3 og OVCA433 celler. Western blot analyse under anvendelse af anti-HA-antistof viste ekspressionsniveauerne af HA-mærket PITX2A i C4 og C5 kloner af SKOV-3 og C33 og C34 kloner af OVCA 433. β-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (B) Western blot-analyse under anvendelse af anti-PITX2 antistof viste de reducerede udtryk for endogen PITX2 i stabile Knockdown kloner dannet af 2 shRNA konstruktioner (K1 og K2). Scrambled er den ikke-specifikke shRNA kontrol. De numeriske enheder repræsenterer de relative udtryk for PITX2 reduktion i hver stabil klon sammenlignet med scrambled kontroller. p-actin blev anvendt som indlæsning kontrol. (C) Ektopisk ekspression af PITX2A stimuleret celleproliferation i ovariecancerceller. Både C4 og C5 af Skov-3 celler demonstrerede 1,5- fold stigning af cellevækst (*

P

0,05), C33 og C34 i OVCA 433 celler havde 3 gange forøgelse af cellevækst (**

P

0,01) sammenlignet med deres vektor kontrol. (D) Udtømning af endogen PITX2 reduceret celleproliferation i ovariecancerceller. En 3- til 4- fold reduktion på cellelevedygtighed i både Knockdown kloner (K1 og K2) i OV2008 celler (**

P

0,01) og 2 til 3 gange fald på celleproliferation i knockdown kloner (K1 og K2) af OVCA 433 celler (*

P

0,05). blev observeret

Desuden tvungen udtryk for PITX2 steg ikke kun størrelsen, men også den antal kolonier i OVCA433 og SKOV3-celler ved 2-fold (

P

0,05) og 8-fold (P 0,01) (figur 3A). I modsætning, udtømning af PITX2 reducerede både størrelsen og antallet af kolonier i OV2008 og OVCA433 celler ved 2,6 gange til 5 gange (

P

0,01) henholdsvis i forhold til deres scrambled kontrol (figur 3B). Kollektivt antyder disse data, at opregulering af PITX2 kunne fremme cellevækst af ovariecancerceller og støtte de onkogene roller PITX2 i høj kvalitet ovarietumor.

(A) Tvungen ekspression af PITX2A forstærket forankringsuafhængig vækst evne af kræft i æggestokkene celler. Søjlediagrammet viser, at PITX2A stabilt udtrykker kloner (C33 og C34) i OVCA 433 (**

P

= 0,05) og (C4 og C5) SKOV-3 (*

P

= 0,01) havde øget antal kolonier i blød agar sammenlignet med deres vektor kontrol. Repræsentative billeder viser større koloni størrelse i PITX2A stabil udtrykke kloner under mikroskopi. (B) Udtømning af PITX2 af shRNA inhiberede forankringsuafhængig vækst evne ovariecancerceller. Antallet af kolonier i PITX2stable Knockdown kloner (K1 og K2) af OVCA 433 og OV2008 viste signifikant reduktion i forhold til de scrambled kontroller (*

P

0,01). Repræsentative billeder viser, at den reducerede koloni størrelse PITX2stableknockdown kloner og deres scrambled kontroller. Ovenstående forsøg blev gentaget mindst tre gange uafhængigt, og dataene blev beregnet med middelværdi ± SD.

PITX2 forbedrer cellemigration og invasion af ovariecancerceller

Tidligere undersøgelser har vist, at PITX2 kunne udløse neuronal celle migration under udviklingen af ​​musen hypothalamus [16], hvilket indikerer, at PITX2 besidder celle vandrende fremme kapacitet. Her har vi forsøgt at undersøge om PITX2 giver en rolle for at fremme cellemigration og invasion af ovariecancerceller. Vi først gennemført sårheling assay at undersøge, om PITX2 kunne fremme celle migration. Ved behandling af Mitomycin C for at udelukke faktor forøget cellevækst, observerede vi, at tvungen ekspression af PITX2in SKOV3-celler udviste en hurtigere sårlukning end vektoren kontrol (figur 4A). Omvendt knockdown af endogen PITX2 i OVCA433 celler bemærkelsesværdigt reduceret celle migration observeret i sårheling assay (

P

0,05) (Figur 4B). Desuden ved Transwell migration og invasion assays, demonstrerede vi, der var 2 til 3 gange (

P

0,01) og 0.8- til 1,5 gange (

P

= 0,04 og 0,01 ) stigning i cellemigration sats og invasion rate henholdsvis PITX2 stabile udtrykkende kloner (C4 og C5) sammenlignet med vektoren kontrol med SKOV3-celler (figur 4C). I modsætning hertil er antallet af celle trængte gennem membran i Transwell migration assay og invaderet gennem matrigel i Transwell invasion assay blev signifikant reduceret i PITX2 stabil Knockdown kloner (K1 og K2) sammenlignet med scrambled kontrol over OVCA433 (

P

0,01) (figur 4D). Disse data antyder, at PITX2 besidder evne til at fremme cellemigration og invasion i ovariecancerceller.

(A) sårheling assay viste, at PITX2 stabilt udtrykkende celler (C4 SKOV-3) udviste hurtigere sårlukning hastighed end vektor kontrol i tidsforløbet for 8 timer (**

P

0,05). (B) PITX2 stabile Knockdown kloner (K1 og K2 i OVCA 433) viste signifikant reduktion på sårlukning sats sammenlignet med vektor kontrol i tidsforløbet for 12 timer (*

P

0,05). Pilene angiver bredden af ​​såret og den relative cellemigration sats udtrykkes som relativ bredde af sår /tid. Assayet blev gentaget tre gange uafhængigt af hinanden. (C) Transwell migration og invasion assay viste, at PITX2 stabilt udtrykker kloner i SKOV3 (C4 og C5) celler migrerer hurtigere gennem membranen (*

P 0,01

) og invadere hurtigere gennem matrigel (C4, *

P

= 0,04 og C5, **

P

= 0,01) i forhold til vektor kontrol. (D) PITX2 stabil knockdown klon (K2 af OVCA 433) udstillet bemærkelsesværdig reduktion i celle penetration gennem membranerne og celle invasiv sammenlignet med de scrambled kontroller (**

P

= 0,01). Tre synspunkter blev tilfældigt udvalgt i hver indsatser og antallet af invaderet celle blev talt. Resultaterne af tre uafhængige forsøg blev afbildet med fejl bar.

PITX2 regulerer Cyclin-D1 og C-myc i æggestokkene cancerceller

cyclin-D1 og C-myc er to afgørende lovgiverne i at fremme celledeling [17]. For at løse hvorvidt PITX2 regulerer disse gener til at fremme cellevækst af ovariecancerceller, vi først udført Q-PCR-analyse og viste, at der var 2-12 folder stigning i udtryk for

Cyclin-D1

C myc

i PITX2 stabilt udtrykker ovariecancerceller (figur 5A). Derudover Western blot-analyse viste også, at både cyclin-D1 og C-myc forhøjet mindst 60% i PITX2 stabilt udtrykker ovariecancerceller (figur 5B). Omvendt knockdown af PITX2 bemærkelsesværdigt reduceret udtrykkene for cyclin-D1 og C-myc mindst 20% i forhold til deres scrambled kontrol i OVCA 433 og OV2008-celler (figur 5C) .Disse resultater viser, at PITX2 kunne opregulere Cyclin-D1 og C- myc at fremme cellevækst af æggestokkene kræftceller.

(A) Q-PCR-analyse viste, at niveauerne for

cyclin-D1

C-myc

var forhøjet i PITX2A stabilt udtrykker kloner (C4, C5 SKOV-3 og C33, C34 af OVCA 433). (B) Western blot-analyse viste, at proteinet niveauer af cyclin-D1 og c-myc blev forhøjet med PITX2 i PITX2A stabilt udtrykkende kloner (C4, C5 SKOV-3 og C33, C34 af OVCA 433). (C) Knockdown af PITX2 væsentligt reduceret niveauerne af cyclin-D1 og C-myc i PITX2 knockdown stabile kloner (C6, C8 af OVCA 433 og C1, C4 af OV2008). blev påvist Niveauerne af HA-mærket PITX2A anvendelse af anti-HA-antistof, mens endogen PITX2 ekspression blev undersøgt ved anti-PITX2 antistof, blev β-actin anvendt som indlæsning kontrol. Den numeriske værdi under hvert panel repræsenterer den relative ekspression af cyclin-D1 og C-myc til deres vektor kontrol.

PITX2 fremmer

in vivo

tumorvækst af ovariecancerceller

Udover

in vitro

tumorigene undersøgelser af PITX2, vi forsøgte at afgøre, om overekspression af PITX2 kan øge tumorvækst evne i en xenograft musemodel. To PITX2 stabile udtrykkende kloner (C4 og C5) og en vektor kontrol med SKOV3 blev inokuleret subkutant i nøgne mus. Efter 36 dage, vi observeret, at både stabile kloner med PITX2 overekspression havde 2,5-3 fold stigning intumor vækstrate sammenlignet med vektor kontrol (

P

0,01) (Figur 6A 6B). Western blot-analyse af de dissekerede tumorvæv indsamlet på dag 36, viste, at begge PITX2 stabile udtrykkende kloner (C4 og C5) af SKOV3 udtrykte høje niveauer af PITX2 og samtidig med forhøjede udtryk for cyclin-D1 og C-myc (figur 6C). Dette resultat er i overensstemmelse med

in vitro

tumorigene data og yderligere støtter, der PITX2 kan fremme tumorvækst via opregulering af cyclin-D1 og c-myc.

(A) PITX2 stabilt udtrykker kloner i SKOV3 (C4 og C5) viste hurtigere i tumorvækst i nøgne mus i sammenligning med vektorkontrol. Tumoren størrelse var repræsenteret ved middelværdien ± SE for fem mus og blev målt i 36 dage *,

P

. 0,01, signifikant forskellig fra vektor kontrolgruppen. (B) Photograph illustrerer dissekerede tumorer taget fra nøgne mus injiceret subkutant ved to PITX2 stabile udtrykkende kloner i SKOV3 (C4 og C5) og vektoren kontrol på dag 36. (C) Western blot-analyse viste udtrykkene for PITX2, Cyclin-D1 og C-myc fra musene subkutane tumorvæv. Den numeriske værdi under hvert panel repræsenterer den relative ekspression af cyclin-D1 og C-myc til deres vektor kontrol.

PITX2 er reguleret af Wnt /β-catenin uafhængigt i æggestokkene cancerceller

Tidligere rapporter har dokumenteret, at PITX2 er downstream formidler af Wnt /β-catenin vej [12], [18]. Derfor var vi i interesseret i at undersøge, om opregulering af PITX2 skyldes den aktiverede Wnt /β-catenin. Ved behandling af GSK3p-inhibitor (lithiumchlorid), fandt vi, at Wnt /β-catenin-aktivitet blev aktiveret via den forøgede ekspression af β-catenin på en dosis-afhængig måde i OVCA433 og A2780cp celler. Der var imidlertid kun lille eller slet ingen ændring af PITX2 ekspression i begge cellelinier (figur S2a). Ligeledes ved behandling af Wnt3a tilstand medium, udviste både A2780cp og OVCA 433 celler ikke-nærliggende respons på den forøgede Wnt /β-catenin-aktivitet (figur S2B). Disse resultater viser, at opregulering af PITX2 udtryk i æggestokkene cancerceller ikke hovedsageligt reguleret af Wnt /β-catenin signalering men måske af andre molekylære mekanismer.

Diskussion

Tumor progression er en multi- trins proces, der fremmer kræft at være en mere malign og aggressiv fænotype [19]. High-grade tumor repræsenterer en mere avanceret progression som besidder højere celleproliferativ og invasivitet kapacitet [20]. I denne undersøgelse, vi først vist, at PITX2 ofte blev opreguleret i ovariecancer især i høj kvalitet og klar celle undertype af kræft i æggestokkene ved hjælp af Q-PCR, Western blot og IHC-analyser. Hvad vigtigere er, vi rettet den onkogene rolle PITX2 besidder i celleproliferation, forankringsuafhængig vækst evne, cellemigration /invasion, samt tumorvækst i en tumor xenograft-musemodel.

Ifølge FIGO klassificering klassificering, high-grade ovarie tumorceller sædvanligvis dårligt histologisk differentieret [20], vokser hurtigere og meget metastatisk [7]. Desuden prognose af høj kvalitet i æggestokkene tumor er dårlig derefter det ofte associerer med dårlig overlevelse [21], [22] .De klare celle undertype ovariecancer tegner sig for ca. 6% af alle epitelial ovarietumorer og de fleste tilfælde af denne undertype er high-grade tumor udviser en aggressiv fænotype [3], [22], [23]. Vores undersøgelse viste, at både mRNA og protein niveauer af PITX2 ofte blev opreguleret i kræft i æggestokkene især i de høj kvalitet og klar celle undertyper, hvilket indikerer, at PITX2may spiller en vigtig rolle som drivkraft aggressive fænotyper i kræft i æggestokkene.

PITX2 er en homeodomæne transkriptionsfaktor som spiller en væsentlig rolle i fosterudviklingen såsom lever, hæmatopoiese, gonader, og neuronal differentiering etc [24], [25], [26]. For nylig har der været stigende rapporter, der viser, at PITX2 er overudtrykt i humane kræftformer såsom ikke-funktionelle hypofyseadenomer [10], Wilms tumor [27] og lymfeknude-positiv kolorektal cancer [11]. Imidlertid er de funktionelle roller PITX2 i humane cancere, såsom ovariecancer fortsat ukendt. For at afsløre de funktionelle roller PITX2 i kræft i æggestokkene, genereret vi gevinst eller tab af funktion af PITX2 i high-grade æggestokkene kræft celle modeller og udførte en række

in vitro

in vivo

tumorigene assays med hensyn til virkningen af ​​PITX2 i tumorcellevækst og metastase. Vores undersøgelse viste, at tvungen udtryk for PITX2 væsentlig grad kan øge celleproliferation, forankring uafhængig vækst evne, cellemigration /invasion og tumorvækst af kræft i æggestokkene celler i mus xenograft tumor model. Omvendt, udtynding af PITX2 af shRNA forringet ovenstående tumorgene fænotyper i high-grade ovariecancer celle modeller. Tilsammen vores resultater tyder på, at onkogene funktioner besat af PITX2 udelukkende findes i høj kvalitet kræft i æggestokkene og er i overensstemmelse med klinisk-patologisk analyse af, at den overudtrykte PITX2 er tæt korreleret med høj kvalitet kræft i æggestokkene.

tidligere undersøgelser har vist, at PITX2 hæver cellecyklusregulerende faktorer, såsom cyclin-D1,-D2 og C-myc fremme celletypespecifik proliferation i murine hypofyse og myoblast cellelinjer [18], [28], [29], [30 ]. Desuden biokemiske undersøgelser afbildet at PITX2 bindingssteder er placeret langs promotorområder af

cyclin-D1

, –

D2

og

C-myc

, hvilket tyder på, at disse gener er direkte transskription mål for PITX2 [18], [28], [29], [30], [31], [32]. Endvidere kunne aktivering af onkogener såsom cyclin-D1 og C-myc forbedre forankringsuafhængig vækst i musebryst epitelceller på og tumorvækst i svær kombineret immundefekt (SCID) mus [17].