PLoS ONE: Nyligt Udviklet Magnetiske Erythrocytter til vedvarende og målrettet Levering af anti-Cancer Therapeutic Compounds

Abstrakt

cytotoksisk kemoterapi for kræft er begrænset af alvorlige, nogle gange livstruende, bivirkninger, der opstår fra toksiciteter til følsomme normale celler, fordi de terapier er ikke selektive for maligne celler. Så hvordan kan de selektivt forbedres? Alternative farmaceutiske formuleringer af anti-cancer midler er blevet undersøgt for at forbedre konventionel kemoterapi behandling. Disse formuleringer er forbundet med problemer som alvorlige toksiske bivirkninger på raske organer, resistens og begrænset adgang af lægemidlet til tumor sites foreslog behovet for at fokusere på stedspecifikke kontrollerede drug delivery-systemer. Som reaktion på disse bekymringer, har vi udviklet et nyt lægemiddel levering system baseret på magnetiske erythrocytter manipuleret med et viralt spike fusionsprotein. Denne nye erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem har potentiale til magnetisk-kontrollerede stedspecifik lokalisering og højeffektive fusion kapacitet med de målrettede celler. Her viser vi, at erythro-magneto-HA virosomer lægemiddelafgivelsessystem er i stand til at vedhæfte og sammensmelte med målcellerne og til effektivt at frigive terapeutiske forbindelser inde i cellerne. Effekten af ​​anti-cancer medicin ansat øges, og den nødvendige dosis er 10 gang mindre end nødvendig med konventionel behandling

Henvisning:. Cinti C, Taranta M, Naldi I, Grimaldi S (2011) Nyligt Udviklet Magnetiske Erythrocytter for Vedvarende og målrettet Levering anticancer-terapeutiske forbindelser. PLoS ONE 6 (2): e17132. doi: 10,1371 /journal.pone.0017132

Redaktør: Steven Ellis, University of Louisville, USA

Modtaget: 12. oktober 2010; Accepteret: 21 Jan 2011; Publiceret: 23 feb 2011

Copyright: © 2011 Cinti et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udfald af enhver medicinsk behandling afhænger ikke kun på den farmakokinetiske /farmakodynamiske aktivitet af det terapeutiske middel, men i vid udstrækning af dets biotilgængelighed ved virkningsstedet i det humane system [1] – [4]. I fortiden, har alternative farmaceutiske formuleringer af anti-cancermidler blevet undersøgt for at forbedre konventionel kemoterapi behandling. I konventionel /aktuelle behandling oral tablet, der anvendes kapsel og injicerbare formuleringer til levering anticancerlægemidler. Disse formuleringer er forbundet med problemer som alvorlige toksiske bivirkninger på raske organer, vanskeligheder i klinisk administration, lægemiddelresistens og begrænset adgang af lægemidlet til tumorstederne foreslog behovet for at fokusere på stedspecifikke kontrolleret lægemiddelafgivelsessystemer.

Drug administrationssystemer (DDSs) såsom lipid- eller polymer-baserede nanopartikler er blevet designet til at forbedre de farmakologiske og terapeutiske egenskaber af lægemidler administreres parenteralt. Størstedelen af ​​DDS i dag godkendt til parenteral administration falder ind under kategorien af ​​liposomalt eller lipidbaserede formuleringer eller terapeutiske molekyler forbundet med polyethylenglycol (PEG) [5] – [7]. Selvom lægemiddelopløselighed ikke kan være en begrænsende faktor for systemer såsom polymer-lægemiddel-konjugater, hvori lægemidlet er kemisk bundet til bæreren, kan det være en vigtig overvejelse i liposomal DDS. Bæreevne liposomer er ikke effektiv til meget store terapeutiske molekyler, såsom proteiner, især når små liposom diametre er ønskeligt af hensyn til biofordeling. Bionedbrydelige nano /mikropartikler af poly (D, L-lactid-co-glycolid) (PLGA) og PLGA-baserede polymerer er almindeligt udforskes som bærere til reguleret afgivelse af makromolekylære terapeutika såsom proteiner, peptider, vacciner, gener, antigener og vækstfaktorer . Litteratur nævner mange fordele og ulemper ved PLGA og PLGA-baserede afgivelsessystemer til afgivelse af makromolekylære lægemidler [8], [9]. Lægemiddelindkapsling, partikelstørrelse, additiver tilsættes under formulering, molekylvægt, forhold mellem lactid og glycolid-dele i PLGA og overflademorfologi kan påvirke frigivelsesegenskaberne [10]. PLGA har en negativ effekt på protein stabilitet under forberedelse og opbevaring, primært som følge af syre-katalyseret arten af ​​dens nedbrydning [11]. Desuden forarbejdning betingelser, der anvendes i fremstillingen af ​​PLGA lægemiddeltilførselsvehikler have skadelige virkninger for visse proteinholdige sekundære strukturer [12].

I de sidste par år, cellebaserede administrationssystemer er også blevet udviklet. Anvendelsen af ​​celler som terapeutiske bærere har udviklet sig som et særskilt begreb og leveringsmetode [13] – [17]. Cell-baserede biler er særligt attraktive for levering af bio-terapeutiske midler, der er vanskelige at syntetisere, har reduceret halveringstider, begrænset indtrængen væv eller hurtigt inaktiveres ved direkte

in vivo

introduktion. Som et spørgsmål af fakta, det cellebaserede leveringssystem har en række fordele, herunder længere leveringstider, målretning af lægemidler til specialiserede celle rum og biokompatibilitet. Anvendelsen af ​​en fysiologisk bærer til at levere terapeutiske midler i hele kroppen for både at forbedre deres effektivitet samtidig minimere uundgåelige bivirkninger, er en tiltalende perspektiv, der kan anvendes i mange kliniske omgivelser. Opførslen af ​​blodceller, som et system til adskillige klasser af molekyler levering (dvs. proteiner, herunder enzymer og peptider, terapeutiske midler i form af nukleotidanaloger glukokortikoid loger), er blevet omfattende undersøgt som de besidder adskillige egenskaber, som gør dem unikke og nyttige bærere [18] – [20]. I forbindelse med ekstrakorporal farmakoterapi, den mest lovende fremgangsmåde er anvendelsen af ​​autoerythrocytes som besidder unikke morfologiske og fysiologiske karakteristika. Anvendelse af erythrocytter som beholdere til forskellige lægemidler mindsker risikoen for bivirkninger og patologiske immunreaktioner mod indkapslede midler, og desuden det tillader modifikation af deres farmakokinetiske og farmakodynamiske egenskaber for reduktion doser og intervaller mellem dem. Effekt og sikkerhed af farmaceutiske midler indført i erytrocytter er blevet bekræftet i talrige

in vivo

undersøgelser [20]. De magnetiske erythrocytter, som stammer fra co-indkapsling af lægemidler med nogle ferrofluider såsom cobalt-ferrit og magnetit, er blevet rapporteret at dirigere det indkapslede lægemiddel overvejende til de ønskede steder i kroppen ved hjælp af et eksternt magnetisk felt [21] – [23]. Anvendelse ultralydsbølger i den region, hvor magnetiske erythrocytter akkumulerer kan fremkalde køretøj ødelæggelse og frigivelse af et lægemiddel på organet eller vævet niveau [24], [25]. Udover målretning stoffet, har denne metode været vurderet for induktion af lokal iskæmi i tumorer, som derfor kan bidrage til at fremme tumorremission grund af nedsat lokal blodgennemstrømning [22]. Men den potentielle evne celle luftfartsselskaber at give stedsspecifik eller målrettet levering af terapi er endnu ikke fuldt udforsket. Udvikling af celle målrette strategier vil yderligere forskud celle køretøjer applikationer, udvide anvendelsen af ​​denne leverance tilgang og potensere terapeutiske resultater.

I et forsøg på at forbedre målretningen og en effektiv frigivelse af terapeutiske forbindelser ved intra-cellulære niveau af målceller, har vi udviklet et hidtil ukendt magnetfelt-kontrollerede erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem. Montering af en viral spike fusion glycoprotein på erytrocytterne ‘membran og indkapsle superparamagnetiske nanopartikler og lægemiddel i erytrocytter, har vi produceret nye erythrocytter-baserede drug delivery system, erythro-magneto-HA virosomer, der har potentiale til magnetisk-kontrollerede stedsspecifik lokalisering og meget effektiv fusion kapacitet med de målrettede celler. Tilstedeværelsen af ​​viral fusion glycoprotein gør anvendelsen af ​​ultralyd bølge unødvendigt for at fremkalde “køretøj” ødelæggelse for frigivelse af terapeutiske forbindelser ved målområdet. Her viser vi, hvordan erythro-magneto-HA virosomer opfører noget beslægtet med et kappebærende virus i deres evne til at invadere værtsceller. Disse konstruerede erythrocytter kan fusionere med den cytoplasmatiske membran af målceller i en meget kort tid og frigiver de magnetiske nanopartikler og terapeutisk forbindelse inde i disse celler. Den totale mængde af anticancerlægemidlet 5-Aza-2-deoxycytidin har en terapeutisk virkning 10 gange mindre end den for standardbehandling, antyder, at denne nye lægemiddeltilførselssystem kan være i stand til at reducere cytotoksiske virkninger af lægemidler ved at øge biotilgængeligheden af ​​terapeutiske forbindelser på det sted, og ved at forbedre farmakokinetik. Denne nye erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem kan potentielt anvendes i mange kliniske omgivelser, herunder neoplastiske patologier, patologier forårsaget af infektion af et menneske eller dyr virus og hjertekarsygdomme.

Materialer og metoder

Influenza virus vækst og isolering af hæmagglutinin (HA) glycoprotein

Influenzavirus opnået fra allantois væske på 10-dage gamle befrugtede æg (æg blev opnået fra kylling fabrikken i Rom, Italien) blev pelleteret ved ultracentrifugering og pelleten blev resuspenderet i octa (ethylenglycol) –

n

-dodecyl monoether (C

12E

8) og efterladt natten over for at tillade fuldstændig solubilisering af den virale membran. Suspensionen var omhyggeligt homogeniseret og ultracentrifugated til pelletering ned de virale nukleocapsider. Dernæst blev virosomet suspension (supernatant indeholdende HA protein) oprenses ved ultracentrifugering på en diskontinuerlig sucrose-gradient (50% og 10% saccharose). Ved grænsefladen af ​​saccharosen lag, HA glycoproteinet koncentrater. Efter fjernelse af dette lag, har HA blevet dialyseret mod puffer og steriliseres ved filtrering.

Erythrocytter lysis og inkorporering af HA glycoprotein, super paramagnetiske nanopartikler og 5-aza-2-dC lægemiddel

humane røde blodlegemer (RBC) blev opnået fra blod fra raske donorer ved centrifugering ved 1700 rpm i 10 min ved 4 ° C. Frisk indsamlede RBC blev vasket to gange i fysiologisk fosfat-buffer saltvand (1X PBS) (1,37 M NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Na

2HPO

4, 45 mM KH

2PO

4 pH 7,4 ).

2 × 10

9 RBC’er blev lyseret i 300 pi lysisbuffer (10 mM TRIS, 0,1 mM EDTA, 1 mM MgCl

2 ved pH 7,2) i 60 minutter ved 0 ° C . Den isotonicitet blev derefter restaureret ved at tilsætte 65 pi af 1 X genlukning buffer (1,37 M NaCl, 57 mM KCl, 54 mM Na

2HPO

4, 45 mM KH

2PO

4, 15 mM MgCl

2 pH 7,4), suppleret med 0,1 mg 100 nm rød-mærket superparamagnetiske nanopartikler (nano-screenMAG, Chemicell Company), 1 pg HA influenza viral spike glycoprotein, og 0,38 eller 30,5 mg 5-Aza-2-dC ( Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).

suspensionen blev inkuberet i 45 minutter ved 37 ° C under svag omrøring. Forseglede RBC’er (spøgelser) indeholdende HA-fusionsprotein på lipid membran og både 5-Aza-2-dC og superparamagnetiske nanopartikler inde (erythro-magneto-HA virosom), blev opsamlet ved centrifugering ved 10.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Erythro-magneto-HA virosomer blev vasket to gange med 1X PBS ved centrifugering ved 9.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C og resuspenderet i 1X PBS indeholdende 1% FCS.

Kinetik af ERYTHRO-magneto-HA virosomer fusion med HeLa-celler: Spektrofluorimeter analyse

ERYTHRO-magneto-HA virosomer blev fremstillet som beskrevet ovenfor og blev mærket ved tilsætning af octadecyl rhodamin (R18). Erythro-magneto-HA virosomer /R18 indlæst blev tilsat til HeLa-celler. Total lipid i erythro-magneto-HA virosomer /R18 blev kvantificeret ved mængden af ​​Octadecyl rhodamin (R18) i deres membran, baseret på det faktum, at R18 står for 15% af den samlede vægt af lipider på den. Erythro-magneto-HA-virosomer /R18 blev solubiliseret ved tilsætning af 0,1% (slutkoncentration) Triton X-100 i PBS, og fluorescensen af ​​R18 (excitation ved 560 nm og emission ved 590 nm) blev målt under anvendelse af en alikvot af opløsning med et spektrofluorometer Perkin Elmer 650-40), kalibreret med R18 standardopløsninger indeholdende 0,1% Triton X-100. Graden af ​​R18 self-quenching i hver erythro-magneto-HA virosomer blev undersøgt ved sammenligning af R18 fluorescens før og efter solubilisering af erythro-magneto-HA virosomer med 0,1% Triton X-100 i PBS. Erythro- magneto-HA virosomer blev sat til HeLa-celler. Den kinetiske af erythro-magnetisk-HA virosomer fusion med HeLa-celler blev beregnet som% af R18 fluorescens-dequenching (FDQ) under anvendelse 560 og 590 nm som excitations- og emissionsbølgelængder hhv. Som kontrol vi forberedt R18-mærkede magnetiske erythrocytter uden rekonstitueret HA-fusionsprotein. Den kinetiske af fusion af disse magnetiske erythrocytter med HeLa-celler blev også analyseret.

HPLC-analyse af 5-aza-2-dC inkorporering i ERYTHRO-magneto-HA virosomer Salg

Kemikalier og opløsninger.

5-Aza-2-deoxycytidin (5-aza-2-dC, Decitabin) blev indkøbt fra Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA). Ammoniumacetat var fra Carlo Erba (Milano, Italien). HPLC-kvalitet acetonitril (MeCN) var fra Rathburn (Walkerburn, UK).

HPLC-analyse af ERYTHRO-magnetisk-HA virosomer indeholdende decitabin.

2 × 10

9 erythro-magneto HA virosomer blev inkuberet med 200 pi lysisbuffer at frigive det inkorporerede 5-Aza-2-dC lægemiddel og centrifugeret ved 10.000 rpm i 15 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev udvundet og anvendt til HPLC-analyse eller gemmes i et -80 ° C fryser indtil analyse. Salg

Stock standardopløsninger af decitabin ved koncentration på 114, 228, 456 og 1140 ng /ml, blev fremstillet individuelt i vandopløsning eller lysepuffer og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse.

toparealerne for prøve /5-Aza-2-dC (decitabin, standard) blev anvendt til kvantificering. Detektionsgrænsen (LOD) blev defineret som tre gange signal-støj-forholdet. Den laveste grænse for kvantificering (LLOQ) blev defineret som det laveste niveau af analysanden, der kunne detekteres pålideligt og reproducerbar med en præcision på ≤20% og nøjagtigheden af ​​80-120%.

Instrumentering.

HPLC-systemet består af en Dionex (Sunnyvale, CA, USA) 3000 Ultimate serie LC forbundet til en lineær ion Trap LTQ-Orbitrap (Thermo Fisher Scientific, USA) massespektrometer udstyret med en elektrospray-ionkilde. Data blev indhentet og behandlet med Excalibur 2.1 software. Forbindelser blev separeret på en Gemini C18 (150 mm-2,0 mm ID) og 3 um partikelstørrelse (Phenomenex, Torrance, CA, USA) beskyttet af en Phenomenex Gemini C18 (4,0 mm-2,0 mm ID) og 3 um partikelstørrelse vagt patron . HPLC-metoden anvendte gradienteluering; mobil fase opløsningsmiddel A var vand med 0,1% myresyre og mobil fase B var acetonitril med 0,1% myresyre. Den indledende fase sammensætning på 92% A opløsningsmiddel og 8% opløsningsmiddel B mobil blev opretholdt i 2 min. Mellem 2 og 9 min procentdelen af ​​mobil fase B blev øget til 35% og derefter tilbage til indledende fase sammensætningen af ​​den mobile af 0,1 min, med en tid på 14 min. Søjlen blev sat ved en strømningshastighed på 0,2 ml min-1 og en temperatur på 36 ° C. Prøvevolumen på 10 pi blev anvendt til alle LC-MS eksperimenter. Massespektrometeret blev drevet i positiv elektrospraymåde. Den kapillar temperaturen var 275 ° C, og spray spænding 4,5 kV blev brugt.

Tumor HeLa celler behandlinger

Menneskelig HeLa-celler blev købt fra American Type Culture Collection (Rockville, MD).

cellerne blev opretholdt i DMEM-medium tilsat 10% føtalt bovint serum, 2 mM L-glutamin, ved split forhold på 1:04 to gange om ugen.

i behandlinger, 3 ml celler ved en densitet på 5 x 10

5 blev podet i 6-brønds mikrotiterplader. To sæt eksperimenter blev kørt parallelt for både Konfokal Laser Scanning Microscopy (CLSM) og FACS-analyse. For CLSM-analyse, på bunden af ​​dyrkningspladerne der blev anbragt dækglas, hvor cellerne blev lad vokse.

Efter 24 timer blev dyrkningsmediet skiftet med medier indeholdende 2,5 uM 5-aza 2-dC alene eller 1 × 10

9 5-Aza-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer eller buffer, hvor erythro-magneto-HA-virosomer blev resuspenderet (supernatant, kontrol-2). Efter 30 min, 1, 6, 24, 48 og 96 timers inkubation, behandlet og ubehandlet (kontrol-1) blev cellerne analyseret ved CLSM og FACS-analyse.

Konfokal Laser Scanning Microscopy (CLSM) analyse af fusion begivenheder af erythro-magneto-HA virosomer med tumorceller

tumorceller dyrkes på objektglas i nærvær af 5-aza-2-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer blev vasket i 1X PBS-puffer og fikseret med 4 % paraformaldehyd. Cellekerner blev modfarvet med DAPI og monteret i antifade medium. Fluorescens og lyse-field billeder blev opnået ved en Leica TCS SP5 omvendt mikroskop, som er udstyret med fem lasere udsender fra UV til synligt (405 Diode, Argon, HeNe 543, HeNe 594 og HeNe 633). DAPI fluorescens blev detekteret ved excitation på 405 nm og emission 454 nm, mens rød fluorescens af superparamagnetiske nanopartikler ved excitation af 543 nm og emission på 613 nm.

cytofluorimetrisk analyse (FACS-analyse)

FACS-analyse blev udført på HeLa-celler behandlet med 2,5 pM 5-aza-dC eller 1X 10

9 5-Aza-2-dC-loaded erythro-magneto-ha-virosomer og sammenlignet med dem ubehandlede (kontrol -1) efter 24, 48 og 96 timers dyrkning. FACS-analyse blev også udført på HeLa-celler behandlet med puffer, hvor erythro-HA-virosomer blev resuspenderet at kontrollere fravær af ikke-inkorporeret 5-Aza-2-dC lægemiddel (kontrol-2). Behandlede og ubehandlede celler blev fikseret i ethylalkohol og kernerne blev farvet med 10 pg /ml propidiumiodid og inkuberet med 100 ug /ml RNase i 1 time ved 37 ° C. Indholdet nukleare DNA, som diskriminerer de cellecyklusfaser, blev bestemt ved flowcytometri bruge Becton-Dickinson FACScan CentroII.

Etik udsagn

For nærværende undersøgelse, vi ikke har brug for etik godkendelse siden arbejdet blev ikke omfatter menneskelige eller dyreforsøg.

den foreliggende undersøgelse blev udført uden at udnytte donorer fra menneskelige frivillige materiale, humant blod blev opnået fra transfusional taske fra blodbanken, af disse grunde, vi ikke har brug for informeret samtykke .

Resultater

adfærd erythro-magnetisk-HA virosomer

En ny erythrocyt-baserede lægemiddeladministration beskrevne her er potentielt i stand til at levere medicin til at målrette væv øger biotilgængeligheden af terapeutiske forbindelser ved virkningsstedet fører til en bedre terapeutisk virkning med minimale bivirkninger. Humane erythrocytter blev isoleret fra blodet fra en rask donor og behandlet med en hypotonisk opløsning til at inducere åbningen af ​​membranens porer og frigive hæmoglobin. En blanding indeholdende hæmagglutinin (HA) viral spike fusionsproteiner, fluorescerende superparamagnetiske nanopartikler og den terapeutiske forbindelse blev tilsat under genlukning af “ghost” erythrocytter. Grund af den høje affinitet for membraner, hæmagglutinin binder til cytoplasmatiske membran af erytrocytter mens magnetiske nanopartikler (grøn fluorescens) og lægemiddel trænge gennem porerne i “ghost” erythrocytter (Fig. 1).

Konfokal Laser Scanning Microscopy ( CLSM) billeder af erytro-magneto-HA virosomer indkapsler 100 nm fluorescens-mærkede superparamagnetiske nanopartikler (grøn) og 5-Aza-2-dC.

for at kontrollere den faktiske indfangning af 5-Aza-2 -dC (Decitabin) i vores erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem og kvantificere udbyttet af terapeutisk forbindelse indkapslet, udførte vi HPLC-analyse (fig. 2). Væskekromatografi /tandem massespektrometri kvantificering metode (QTOF /MS) er anvendt for at kvantificere og identificere de 5-aza-2-dC isoformer og deres nedbrydningsprodukter under fysiologiske betingelser for pH og temperatur som beskrevet tidligere [26], [ ,,,0],27].

(A) Peaks af 1,14 ng 5-Aza-dC (standard). (B) Peaks af 5-Aza-dC indkapslet i 2 × 10

9 erythro-magnetisk-HA virosomer. RT: retentionstid; AA: peak område tæller. (C) Kalibreringskurve af 5-aza-dC. Værdierne topareal af standarder blev sat i forbindelse med ng /10 pi 5-Aza-2-dC prøve løb. Standardopløsninger var 1,14, 2,28, 4,56 og 11,40 ng 5-Aza-dC (sorte romber). Grå trekanter viser de 5-Aza-dC fundne koncentrationer inden for de to erythro-magnetisk-HA virosomer prøver, der anvendes i

in vitro

eksperimenter.

I figur 2 A og B, den toppe af både 5-Aza-2-dC (standard) og 5-aza-2-dC lagt i 2 × 10

9 erythro-magneto-HA virosomer er vist. Prøverne blev overvåget i positiv mode, hvilket resulterer i arter af 1 masseenhed højere end de neutrale molekyler. Data blev visualiseret ved ekstraktion af ionchromatogrammer ved m /z = 229. standardopløsningen (fig. 2 A) to toppe svarende til både enkelt ladet β- (I) og a-former (II) af 5-aza-2 -dC (m /z = 229) er til stede. I prøven, en anden top er tydeligt ud over 5-Aza-2-dC β- og a-former (I og II). Denne top svarer til en guanylurea derivat (III) (m /z = 219). Som tidligere vist, udvundet ion kromatogrammer ved m /z = 219 (guanylurea derivater, enkelt ladede monomere arter) ikke enestående som en identifikator af guanylurea derivater som forbindelser med m /z = 229 også producere fragmenter med m /z = 219, når visualiseres ved massespektrometer [28]. p-former (I) 5-Aza-2-dC blive hydreret ved C-6-stillingen og ringen-åbner til fremstilling af en ring-åben-formyleret derivat, efterfulgt af tab af myresyre, som derpå frembringer en guanylurea derivat (III). Deformylering ifølge ethvert af de ringformede åben formyleret derivater ind i guanylurea derivater (III) resulterer i tab af H-6 proton som myresyre. Retentionstiderne (RT) samt området værdier (AA) for hver top er vist i figur 2 A og B.

For at kvantificere mængden af ​​5-aza-2-dC indeholdt i erythrocyte- baseret afgivelsessystem blev 10 pi af hver standard og prøve injiceres i HPLC. Forskellige koncentrationer af standard, der spænder fra 0114 ng /pl (0,5 uM) til 1,14 ngμl (5 uM) 5-Aza-2-dC, blev fremstillet og toparealet for hver 10 pi prøve blev beregnet ved HPLC . Værdierne topareal af standarder blev sat i relation til ng af 5-aza-2-dC og en kalibreringskurve designet (fig. 2 C). Figur 2 A viser værdien område (AA: 660,834) detekteres ved HPLC svarende til 1,14 ng (0,5 uM) 5-Aza-2-dC standardopløsning. Forskellige prøver af erythro-magneto-HA virosomer blev fremstillet og forskellige mængder af 5-aza-2-dC, der spænder fra 0,5 ng /pl (2,5 uM) til 42 ng /pl (200 pM), blev tilsat i løbet det genlukkelige. For at vurdere den effektive mængde af 5-aza-2-dC indkapslet i erytrocytter for hvert præparat, 2 × 10

9 erythro-magneto-HA virosomer blev lyseret i 200 pi lysisbuffer. Den totale mængde lægemiddel inkorporeret i 2 × 10

9 erythro-magneto-HA virosomer var 3,6 ng eller 360 ng når 2,5 uM eller 200 uM 5-Aza-2-dC blev tilsat til erythrocytter under genlukning henholdsvis (fig. 2 C). Derfor effektiviteten af ​​inkorporering for hver prøve var ca. 1%.

For at teste den effektive inkorporering af hæmagglutinin (HA) på erythrocytmembraner og dens fusion aktivitet, vi evaluerede kinetikken af ​​fusion af vores manipuleret erythro-magneto Ha virosomer med målceller. Octadecyl rhodamin (R18) mærkning blev anvendt til bestemmelse fusionen af ​​erythro-magnetisk-HA virosomer med HeLa-celler. Fusion er blevet rapporteret som% af R18 fluorescens dequenching (NDQ) ved hjælp af 560 og 590 nm som Ekscitations- og emissionsbølgelængderne hhv. Fusionen af ​​erythro-magnetisk-HA virosomer med HeLa-celler starter efter en meget kort periode (få minutter), og procentdelen af ​​fusion eksponentielt stiger med tiden (Fig. 3). I modsætning hertil magnetiske erythrocytter uden hæmaglutinin (HA) ikke viser fusionsaktivitet med HeLa-celler. Disse data indikerer, at det virale spike glycoprotein (HA) oprenset fra influenzavirus og rekonstitueret i magnetiske erythrocyt køretøjer bevarer sine fusogene egenskaber med de cytoplasmatiske membraner af målcellerne og giver magnetiske erythrocytter evnen til at fusionere med målceller.

5-Aza-2-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer blev mærket med Octadecyl rhodamin (R18) og inkuberet med HeLa-celler. Fusion er blevet rapporteret som% af R18 fluorescens dequenching (NDQ) ved hjælp af 560 og 590 nm som Ekscitations- og emissionsbølgelængderne hhv. RBC: 5-Aza-2-dC-loaded magnetiske erythrocytter uden rekonstitueret HA-fusionsprotein (kontrol); RBC-HA: 5-Aza-2-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer

Effekt af Decitabin-belastede erythro-magneto-HA virosomer på tumorceller

Til. kontrollere effektiviteten og effekten af ​​vores erythrocyt-baserede drug delivery system, vi behandlede HeLa tumorceller med enten 5-Aza-2-dC alene eller indkapslet i erythro-magnetisk-HA virosomer. 5 × 10

5 tumorceller blev behandlet enten med 1.800 ng af 5-aza-2-dC (2,5 uM), en koncentration vist sig at have terapeutisk virkning

in vitro

, eller med 1 × 10

9 erythro-magneto-HA virosomer indeholdende 10 gange mindre 5-aza-2dC (180 ng).

optagelsen til målcellen og levering af den terapeutiske forbindelse ind i cytoplasmaet af tumorceller er vist i fig. 4. Ved meget korte tidsrum (fra 30 min til 1 time) er det stadig muligt at skelne manipulerede erythrocytter som begynder at blande sig med målceller (Fig. 4 A og B). Efter 6 timer fleste af målcellerne viser erythro-magneto-HA virosomer i cytoplasmaet (fig. 4 C). Den erythro-magneto-HA virosom, internaliseret inde i “host” celle, ligner en viral endosom. Membranen af ​​erythro-magnetisk-HA virosomer begynder at fusionere med membranen af ​​målcellen mellem 12 og 24 timer, hvorefter de fluorescerende nanopartikler og lægemidlet begynde at diffundere inde tumorcellerne. Efter 24 timer udviste alle tumorcellerne en stærk fluorescens i cytoplasmaet og nogle har den typiske morfologi af tidlig apoptose. 96 timer fleste tumorceller viser den karakteristiske mikrokerner morfologi sen apoptose (fig. 4 D).

I venstre er skematiseret timingen og virkningsmekanismen af ​​erythro-magneto-Ha virosomer, der indkapsler 100 nm fluorescensmærkede magnetiske nanopartikler (grøn) og 5-aza-2-dC. I højre er vist CLSM billeder af erythro-magneto-HA virosomer (grøn) efter 30 minutter (A), 1 time (B), 6 timer (C), 24 og 96 timer (D) inkubering med HeLa-celler fremhævet af DAPI-farvning (blå). (CTRL) Ubehandlet HeLa-celler (kontrol).

Effekten af ​​5-aza-2-dC rekonstitueres til erythro-magneto-HA virosomer i fremme apoptose i forhold til frit lægemiddel er vist i figur 5. HeLa-celler ubehandlet (kontrol) og behandlet med 1800 ng 5-Aza-2-dC eller med 1 × 10

9 erythro-magneto-HA virosomer indeholdende 180 ng Decitabin blev analyseret ved FACS. Som kontroller til vurdering mulige toksiske virkninger af alene køretøjet på celler, blev HeLa-celler dyrket også i nærværelse af pufferopløsningen, hvor 5-Aza-2-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer blev suspenderet (supernatant) og med erythro -magneto-HA virosomer indkapsler kun de fluorescerende magnetomaskiner nanopartikler

Ctrl (kontrol) ubehandlede celler.; Aza: celler behandlet med 1800 ng (2,5 uM) 5-Aza-2-dC; Erythro Aza: celler behandlet med erythro-magneto-HA virosomer indeholdende 180 ng af 5-aza-2-dC; Erythro: losset 5-Aza-2-dC erythro-magneto-HA virosomer; Supernatant: celler behandlet med buffer, hvor erythro-magneto-HA virosomer resuspenderedes (kontrol 2)

Efter 96 timer kun 12,6% af celler behandlet med 1800 ng gratis 5-aza. 2-dC synes apoptotiske sammenlignet med 96% af celler, når celler behandles med 180 ng i erythro-magneto-HA virosomer. Endvidere ved 24 timer signifikant apoptose ses med lægemiddelafgivelsessystemet mens observeres næsten ingen virkning for lægemiddel alene. Disse iagttagelser antyder, at erythro-magneto-HA virosomer afgivelsessystem forøger antineoplastisk effekt af 5-aza-2-dC gennem forøgelse af lægemiddel biotilgængelighed. Hverken supernatanten hvor 5-Aza-2-dC-loaded erythro-magneto-HA virosomer suspenderes eller erythro-magneto-HA virosomer, der kun indeholder fluorescerende nanopartikler har en effekt på celleproliferation, hvilket viser, at vores erythrocyt-baserede lægemiddeladministration selve systemet har ikke toksisk virkning på celler. Tilsammen tyder disse resultater på, at denne nye erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem har potentiale til at øge effektiviteten og effekten af ​​terapeutiske forbindelser.

Diskussion

cytotoksisk kemoterapi eller strålebehandling for kræft er begrænset af alvorlige, undertiden livstruende, bivirkninger på grund af manglende specificitet til at målrette celler alene. En strategi til forbedring specificitet er at indkapsle terapeutiske midler til et lægemiddelafgivelsessystem stand til at dirigere terapeutiske forbindelser til et målsted.

Carrier erythrocytter er blevet vurderet for deres anvendelse i lægemiddelafgivelse i mennesker bevise deres sikkerhed og effekt [ ,,,0],29]. Erythrocyt-baserede levering af nye og konventionelle lægemidler er således oplever stigende interesse i drug delivery og i forvaltningen af ​​komplekse patologier, især når bivirkninger kan blive alvorlige problemer [13], [19], [30]. For nylig er erythrocytter blevet anvendt til at indkapsle det antibiotiske amikacin, og en vedvarende frigivelse fra fyldte erytrocytter over en 48 timers periode blev påvist, hvilket tyder på en potentiel anvendelse af erythrocytterne som en langsom system til antibiotika systemisk frigivelse. Administrationen af ​​amikacin ved indlæste erythrocytter i rotter fører til væsentlige ændringer i farmakokinetiske opførsel af antibiotika [31], [32]. Den erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem rummer flere fordele: det er især effektivt at frigive lægemidler i kredsløbet i længere tid (uger), erythrocytter har en stor trapping kapacitet, er let behandles og har kapacitet til at rumme traditionelle og biologiske lægemidler [ ,,,0],18], [30]. Erythrocytter fyldt med ferromagnetisk kolloid forbindelse kan magnetisk drives ved målorganet /væv ved hjælp af et eksternt magnetisk felt [21] – [23], [33] Endelig tilgængeligheden af ​​et apparat, der tillader indkapsling af lægemidler ind autologe erythrocytter gør denne teknologi findes i mange kliniske omgivelser og konkurrencedygtig i forhold til andre lægemiddelafgivelsessystemer [34].

i det foreliggende arbejde vi påpeger en ny erythrocyt-baserede lægemiddelafgivelsessystem, erythro-magneto-HA virosom