PLoS ONE: væksthæmning for Human Gynækologisk og Colon Cancer Cells ved Phyllanthus watsonii gennem Apoptose Induction

Abstrakt

Phyllanthus watsonii

Airy Shaw er en endemisk plante findes i Peninsular Malaysia. Selv om der er mange rapporter om anti kræft egenskaber af andre

Phyllanthus

arter offentliggjorde oplysninger om cytotoksicitet

P. watsonii

er meget begrænsede. Den foreliggende undersøgelse blev udført med bioassaystyret fraktionering tilgang til at vurdere cytotoksicitet og apoptose induktion evne til

P. watsonii

ekstrakter og fraktioner på menneskers gynækologisk (SKOV-3 og Ca Ski) og kolon (HT-29) kræftceller.

P. watsonii

ekstrakter udstillet stærk cytotoksicitet på alle kræftcellerne undersøgt med IC

50 værdier på ≤ 20,0 mg /ml. Hexan ekstrakt af

P. watsonii

blev yderligere underkastet bioassaystyret fraktionering og gav 10 fraktioner (PW-1 → PW-10). PW-4 → PW-8 portrætteret stærkere cytotoksisk aktivitet og blev yderligere udsat for bioassaystyret fraktionering og resulterede med 8 sub-fraktioner (PPWH-1 → PPWH-8). PPWH-7 besad størst cytotoksicitet (IC

50 værdier svinger fra 0,66 – 0,83 ug /ml) og var selektiv på cancercellerne undersøgt. LC-MS /MS-analyse af PPWH-7 afslørede tilstedeværelsen af ellagsyre, geranic syre, glochidone, betulin, phyllanthin og sterol glucosid. Markerede morfologiske ændringer, stigen-lignende udseende af DNA og tilvækst i caspase-3-aktivitet indikerer apoptose var klart observeret i både humane gynækologiske og tyktarmskræft celler behandlet med

P. watsonii

især med PPWH-7. Undersøgelsen viste også, at

P. watsonii

ekstrakter anholdt cellecyklus ved forskellige vækstfaser i SKOV-3, Ca ski og HT-29 celler. Cytotoksiske og apoptotisk potentiale endemiske

P. watsonii

blev undersøgt for første gang ved bioassaystyret tilgang. Disse resultater viste, at

P. watsonii

selektivt inhiberer væksten af SKOV-3, Ca Ski og HT-29 celler gennem apoptose induktion og cellecyklus modulation. Derfor

P. watsonii

har potentialet til at blive udnyttet yderligere for opdagelse og udvikling af nye anti kræftlægemidler

Henvisning:. Ramasamy S, Abdul Wahab N, Zainal Abidin N, Manickam S, Zakaria Z (2012) Vækst inhibering af human Gynækologisk og Colon Cancer Cells af

Phyllanthus watsonii

gennem Apoptose induktion. PLoS ONE 7 (4): e34793. doi: 10,1371 /journal.pone.0034793

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: September 8, 2011; Accepteret: 8 Marts 2012; Udgivet: 20. april, 2012 |

Copyright: © 2012 Ramasamy et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Postgraduate Research Fund (PPP) Grants UM 524 PS130 /2008A og UM PS307 /2010A, finansieret af University of Malaya. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

der er en lang historie i brugen af planter i de sydøstasiatiske lande, hvoraf nogle har vist sig at besidde interessante biologiske aktiviteter med potentielle terapeutiske [1] applikationer. Anvendelsen af planter som medicin har ført til isolering og karakterisering af farmakologisk aktive forbindelser [2], og i dag er der mindst 120 forskellige kemiske stoffer, der stammer fra planter, der betragtes som vigtige lægemidler og aktive ingredienser i den farmaceutiske industri [3].

Kræft er en af de førende dødsårsager i både udviklede lande og udviklingslande, og fortsætter med at være et stort problem for folkesundheden i mange dele af verden [4]. Der er gjort store anstrengelser for at udvikle forskellige tilgange til at reducere truslen forårsaget af kræft og kun beskedne fremskridt der er gjort med at reducere sygelighed og dødelighed af denne frygtelige sygdom [5]. Ifølge rapporten verden kræft udgivet af Det Internationale Agentur for Kræftforskning, globalt var der 12,4 millioner nye kræfttilfælde i 2008 (6.672.000 i mænd og 5.779.000 kvinder) og 7,6 millioner dødsfald som følge af kræft (4.293.000 i mænd og 3.300.000 kvinder) [6]. På nuværende tidspunkt har kræftbehandling med kemoterapeutiske stoffer, kirurgi og strålebehandling ikke været helt effektiv mod den høje forekomst eller lav overlevelsesrate for de fleste kræftformer [7]. Søgningen efter nye anti cancer fra vegetabilske kilder er en af de realistiske og lovende tilgange inden for cancer kemoforebyggelse og dette førte til opdagelsen af mange nye anti kræft narkotika, herunder vinca-alkaloider, vinblastin og vincristin, taxol, camptotheciner, og podophyllotoxiner [8]. Tilgange er også taget i retning af at opdage anti cancer fra tropiske planter [2] som alternative kræft retsmidler på grund af deres lave toksicitet og omkostninger [9].

I løbet af de sidste par årtier, mange undersøgelser har indikeret, at mekanismen virkningsmekanisme mange anti kræft narkotika er baseret på apoptose induktion, og dermed åbne en ny strategi i søgningen af anti kræftlægemidler [10]. En apoptotisk induktion er en meget ønskeligt karakteristisk for strategi behandling for kræft kontrol, er det derfor vigtigt at screene apoptotiske inducere fra planter, enten i form af rå ekstrakter eller som komponent forbindelser [11]. Disse former for undersøgelser skal ske ved at evaluere cytotoksicitet og apoptotiske induktion i cancer cellelinjer før hele dyreforsøg eller kliniske forsøg blev udført.

Phyllanthus watsonii

Airy Shaw er en lille busk vokser til omkring 1 m høj og hører til familien Phyllanthaceae (figur 1). Arten er en smal endemisk og er kun vides at forekomme fra det nordlige Johor til det sydlige Pahang (to stater i Peninsular Malaysia) på bredden af Endau floden [1], [12]. En række undersøgelser har vist, at ekstrakter og forbindelser afledt af andre

Phyllanthus

arter kunne undertrykke væksten af forskellige cancere, herunder cervikal [13]; leveren [14], lunge [15], makrofager [16], livmoder, gastrisk [17], bryst- og tyktarmskræft [18]. Der var imidlertid ingen detaljeret undersøgelse foretaget for at vurdere den cytotoksiske og apoptotiske virkninger af

P. watsonii

på humane kræftceller, undtagen én rapport viser virkningen af den vandige og methanol ekstrakt af

P. watsonii

mod MEWO huden melanom celler og PC-3 prostatacancerceller [19]. Phytochemistry undersøgelser afslørede tilstedeværelsen af to nye umættede nor-triterpener (26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3-on og 26-nor-D: A-friedoolean-14-en-3p-ol), lupenyl palmitat, friedelin, epifriedelanol, glochidone, glochidonol, lupeol, lup-20 (29) -en-1 beta, 3 beta-diol, sitosterol og sitosterol-beta- (D) glucosid i

P. watsonii

[20].

Den foreliggende undersøgelse blev udført for at vurdere den cytotoksiske potentiale methanol, hexan og ethylacetat ekstrakter af

P. watsonii

mod humant gynækologisk og tyktarmskræft cellelinjer. MRC-5, blev en normal human lunge fibroblastcellelinie også anvendes til at bestemme specificiteten af ekstrakter til kræftceller. MRC-5-celler er blevet almindeligt anvendt som en kontrol i mange lignende undersøgelser [21] – [23]. Bioassaystyret fraktionering blev også udført for at bestemme de bioaktive sekundære metabolitter med cytotoksiske egenskaber. Så vidt vi ved, vil dette være første gang en sådan ekstrakter og fraktioner fra

P. watsonii

testes mod disse cellelinier. Desuden apoptotiske proces i forbindelse med den cytotoksiske effekt i disse celler blev også undersøgt.

Materialer og metoder

Etik Statement

Alle nødvendige tilladelser og tilladelse til indsamling af materialer var opnået for de beskrevne feltstudier og partiet involveret behørigt anerkendt. De arter (

Phyllanthus watsonii

) er placeret i Endau Rompin National Park, som tilhører staten regeringen i Johor og forvaltes af Johor nationalparker Corporation (JNPC), Malaysia. Arten er ikke truet, og levested ikke trues, og det er heller ikke opført i bilagene af CITES (Konventionen om international handel med udryddelsestruede vilde dyr og planter).

Plant Materialer

bladene af

Phyllanthus watsonii

blev indsamlet fra Endau Rompin National Park, Johor (Peninsular Malaysia) i juni 2008. godkendelse af

P. watsonii

blev gennemført i herbarium af Rimba ilmu Botanisk Have, Biologisk Institut, University of Malaya og en voucher materiale (Ref. nr KLU46068) for denne undersøgelse blev deponeret på samme herbarium.

Udarbejdelse af Uddrag fra

P. watsonii

De tørrede blade af

P. watsonii

(PW) (2 kg) blev formalet og ekstraheret med methanol (MeOH) (Fisher Scientific, UK) (6 L x 3 gange) ved stuetemperatur i 72 timer og filtreret gennem Whatman No. 1 filterpapir (Whatman , England). MeOH Filtratet blev opsamlet, og overskydende opløsningsmiddel blev afdampet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsinddamper (Buchi, Schweiz) ved 40 ° C til tørhed producere 160,3 g mørk-grønlig MeOH ekstrakt (PW-M). Del af MeOH ekstrakt blev reserveret til assayet, mens den resterende del blev yderligere rystet kraftigt med hexan (Fisher Scientific, UK), indtil den resulterende hexan blev næsten farveløs. Den hexan opløselige opløsning blev filtreret og hældt sammen, efterfulgt af koncentrering under reduceret tryk ved en rotationsfordamper til opnåelse af 6,5 g ekstrakt ved hexan (PW-H). Den resterende hexan uopløselige blev underkastet opløsningsmiddel-opløsningsmiddelekstraktion med en blanding af ethylacetat (EtOAc) (Fisher Scientific, UK) og destilleret vand (01:01, v /v) efterfulgt af forholdsvis kraftig blanding. Denne blanding blev derefter successivt fraktioneret under anvendelse af en skilletragt, hvor to distinkte lag dannet. Bundlaget (vandlag) blev kasseret, mens EtOAc fase (toplag) blev frigivet i et rent bægerglas. Dette filtrat blev opkoncentreret under reduceret tryk ved anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af 9,7 g af EtOAc-ekstrakt (PW-E). I alle eksperimenter blev ekstrakter opløst i dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma) som stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C. Før analyse blev slutkoncentrationen af hver prøve fremstilles ved fortynding af stamopløsning i 10% DMSO. Slutkoncentrationen af DMSO i cellekulturen var 0,5%. PW-M, PW-H og PW-E i

P. watsonii

blev yderligere underkastet Neutral Red Optagelse assay ifølge fremgangsmåderne beskrevet senere. PW-H blev fundet at udvise stærkeste cytotoksicitet sammenlignet med PW-M og PW-E og berettiget yderligere undersøgelse.

bioassaystyret Fraktionering af PW-H

cytotoksisk aktive fraktion af PW -H (6,1 g) blev kromatograferet på en søjle (4 cm id x 40 cm længde) pakket med silicagel 60 F254, 0,25 mm tykkelse (Merck, Darmstadt, Tyskland) (160 g). Gradient trin-eluering begyndte med 100% hexan og polaritet eluering opløsningsmiddel blev gradvist øget med acetone (Me

2CO) (Fisher Scientific, UK) og MeOH. Eluenter af 25 ml volumen blev opsamlet i nummererede hætteglas. Adskillelsen af hvert eluenten blev overvåget på præ-coatede tyndtlagskromatografi (TLC) silicagel 60 F254 ved anvendelse af n-hexan /acetone (20:80, vol /vol) som en udviklende zoner opløsningsmidlet og TLC blev påvist efter sprøjtning med

anisaldehyd reagens og opvarmning ved 105 ° C i 5 – 10 min. Eluenterne blev samlet ifølge ligheden af den kemiske sammensætning detekteres på TLC, og det overskydende opløsningsmiddel blev afdampet under reduceret tryk under anvendelse af en rotationsfordamper til opnåelse af i alt 10 fraktioner betegnet som PWH-1, PWH-2, PWH-3, … …., PWH-8, PWH-9 * og PWH-10 * (figur 2). Fraktioner PWH-9 * og PWH-10 * viste sig at indeholde silicagel og blev yderligere opløst i chloroform og filtreret gennem Whatman No. 1 filterpapir (Whatman, England) for at fjerne silica. Fraktioner PWH-9 og PWH-10 blev opnået efter fjernelse af overskydende opløsningsmiddel ved inddampning til tørhed ved 40 ° C under reduceret tryk i en rotationsfordamper. Alle fraktioner blev yderligere udsat for Neutral Red Optagelse assay (procedurer beskrevet senere) samt fraktioner PWH-4, … .., PWH-8 afsløret som de mest aktive fraktioner i cytotoksisk aktivitet.

Disse fraktioner (PWH-4, … .., PWH-8) (581,0 mg), blev samlet og yderligere oprenset med silicasøjlekromatografi (2,6 cm ID x 60 cm længde) pakket med silicagel 60 F254, 0,25 mm tykkelse (Merck, Darmstadt, Tyskland) (160 g). Eluering begyndte med 100% hexan og polaritet eluering opløsningsmiddel blev gradvist øget hjælp mig

2CO og MeOH. Eluenter af 25 ml volumen blev opsamlet i nummererede hætteglas. Adskillelsen af hvert eluenten blev overvåget på præ-coatede tyndtlagskromatografi (TLC) silicagel 60 F254 ved anvendelse af n-hexan /acetone (20:80, vol /vol) som fremkalderopløsningsmiddel og TLC zoner blev detekteret efter sprøjtning med

Efterfølgende cytotoksisk aktive ekstrakter (PW-M, PW-H og PW-E), og de fleste aktiv sub-fraktion (PPWH-7) blev udvalgt og yderligere evalueret for dets apoptotiske effekt mod gynækologiske og tyktarmskræft cellelinjer.

LCMS-MS Analyse

Den mest aktive sub-fraktion, PPWH-7 blev analyseret ved LC-MS /MS-system udstyret med den 3200 QTrap massespektrometer (Applied Biosystem, Darmstadt, Tyskland) og Shidmazu UHPLC system. Den kromatografiske separation blev udført på en 50 mm x 2,0 mm x 5 uM Aqua C18-søjle (Phenomenex, Torrance, CA), elueret med en mobil fase bestående af vand (A) og acetonitril (B) indeholdende 0,2% myresyre og 2 mM ammoniumformiat. En gradienteluering (startende fra 10% af A til 90% af B, fra 0,01 min til 10,0 min, hold i 2 min og tilbage til 10% af A i 0,1 min og re-ækvilibreret i 5 min) blev anvendt til at adskille den forbindelser af interesse før massespektralanalyse. Den massespektrometer-analyse blev udført på en positiv ion-mode (

m /z

M + H

+) til påvisning af sekundære forbindelser. Identiteter af forbindelserne blev opnået ved at matche deres molekylære ioner (

m /z

) opnået ved LC-MS /MS med referenceprøver hvor det er muligt og ved korrelation med tidligere offentliggjorte data om kemiske bestanddele fra

Phyllanthus

[24] – [30]

Cell Culture

De humane cellelinier SKOV-3 (ovariecancer-cellelinje), Ca Ski (epidermal karcinom i livmoderhalsen cellelinje), HT. -29 (coloncancercellelinie) og MRC-5 (normal lunge fibroblastcellelinie) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (ATCC), USA. SKOV-3-celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Sigma, UK), mens HT-29, Ca Ski og MRC-5-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium (Sigma, UK) og DMEM-medium (Sigma, UK ), henholdsvis. Alle medier blev suppleret med 10% (vol /vol) føtalt bovint serum (FBS) (PAA Lab., Østrig), 100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin (PAA Lab., Østrig) og celler blev inkuberes ved 37 ° C med 5% CO

2 i en fugtig atmosfære (Shel Lab., USA).

Neutral Red Optagelse (NRU) Indhold

cytotoksicitet af

P. watsonii

ekstrakter, fraktioner og sub-fraktioner blev målt ved Neutral Red Optagelse (NRU) assay, der var baseret på optagelsen og efterfølgende lysosomale ophobning af supravital farvestof, neutral rød i de levedygtige og uskadte celler. Kvantificeringen af farvestoffet ekstraheret fra cellerne har vist sig at være lineær med celletal, både ved direkte celletælling og ved protein bestemmelser af cellepopulationen [31]. Celler blev podet i en 96-brønds mikrotiterplade (Nunc, Danmark) ved en koncentration på 30.000 celler /ml og anbragt i et CO

2 inkubator ved 37 ° C for at tillade cellerne at adhærere før tilsætning af ekstrakterne , fraktioner og sub-fraktioner af

P. watsonii

. Efter 3 timer blev cellerne behandlet med ekstrakter og fraktioner af

P. watsonii dele på seks forskellige koncentrationer dvs. 1, 10, 25, 50, 75 og 100 ug /ml og inkuberet i 72 timer. Brønde indeholdende ubehandlede celler (uden tilsætning af noget ekstrakt) blev betragtet som en negativ kontrol, hvorimod celler behandlet med doxorubicin (0,5-10 ug /ml) tjente som en positiv kontrol. Ved afslutningen af inkubationsperioden blev mediet erstattet med medium indeholdende 50 ug /ml Neutral Red (NR) opløsning (50 ug /ml NR i dyrkningsmedier, 24 timer præinkuberet i mørke ved stuetemperatur og centrifugeres ved 1500 g i 10 minutter før brug) og inkuberes i yderligere 3 timer for at tillade optagelse af den vitale farvestof i lysosomerne af levedygtige og uskadte celler. Mediet blev derefter fjernet, og cellerne blev hurtigt vasket med calciumchlorid-formaldehyd-blandingen. Farvestoffet i levedygtige celler blev elueret fra cellerne med en blanding af eddikesyre, ethanol og vand (1:50: 49) (0,2 ml). Pladerne blev rystet på en mikrotiterplade rysteapparat (LT BioMax 500) i 30 minutter og derefter absorbansen mod en blank henvisning blev målt ved 540 nm under anvendelse af en mikro-pladelæser (Emax, Molecular Devices, USA).

NR-optagelsen, proportional med antallet af levedygtige celler i brønden, blev udtrykt som en procentdel af optagelse af kontrol celler [(OD

kontrol – OD

prøve) /(OD

kontrol) × 100%] . IC

50 værdier (koncentration nødvendig for at nedsætte levedygtigheden celler med 50% sammenlignet med kontrolcellerne) for hver ekstrakt blev ekstrapoleret fra graferne afbildet under anvendelse af OD-værdierne opnået. For at undersøge, om den cytotoksiske aktivitet var specifik for cancercellerne, blev den cytotoksiske aktivitet af ekstrakterne, brøker og sub-fraktion afprøvet og selektiviteten (SI) af aktiv ekstrakt blev bestemt. Selektivitetsindekset (SI) af ekstrakterne er defineret som forholdet mellem cytotoksicitet (IC

50 værdier) på normal lunge fibroblast (MRC-5) celler til cancerceller (SKOV-3, Ca Ski og HT-29). (SI = IC

50 på MRC-5 celler /IC

50 på kræftceller). Prøver med en SI større end 3, blev anset for at have høj selektivitet mod kræftceller [32].

Påvisning af apoptose

Morfologisk vurdering af apoptotiske celler ved fase-kontrast omvendt mikroskop.

celler (3 × 10

4 celler /ml) blev inkuberet i 24 timer i fravær eller nærvær af PW-M, PW-H og PW-E i

P. watsonii

og sub-fraktion PPWH-7 i koncentrationer på 10,0 pg /ml i 24-brønds vævskulturplader. Ved afslutningen af inkubationsperioden blev mediet fjernet, og cellerne blev vasket en gang med en phosphatpuffer saltvand (PBS pH 7,4) og observeret under et Leica DMI 3000B fasekontrast-omvendt mikroskop (Leica Microsystems, Tyskland) ved 200 × forstørrelser og fotograferet.

Morfologisk vurdering af apoptotiske celler ved acridinorange (AO) -ethidium bromid (EB) dobbelt farvning.

Cell morfologiske ændringer blev vurderet ved differential farvning hjælp DNA-indskyde fluorescerende farvestoffer, acridin orange (AO) og ethidiumbromid (EB). Celler (3 × 10

6 celler /ml) blev podet i 24-brønds vævskulturplader, behandlet med PW-M, PW-H, og PW-E og PPWH-7 ved en koncentration på 10,0 pg /ml og inkuberet i 24 timer. Ubehandlede celler blev anvendt som en negativ kontrol. Efter inkubation blev kontrol og behandlede celler pelleteret og suspenderet i 25 pi PBS pH 7,4. Til hver prøve, 1 pi AO /EB-opløsning (1 del 100 ug /ml AO i PBS; 1 del 100 ug /ml EB i PBS) blev tilsat forud for mikroskopisk undersøgelse. Cellesuspensionen blev placeret på en 3-brønd Teflon coated mikroskopiske dias, dækket med et dækglas, og blev observeret og fotograferet med et Nikon Eclipse 80i (Nikon, NY) under fluorescens belysning med tredobbelt filtre (FITC, Cy3 og DAPI) . Billeder blev analyseret ved Nikons Imaging Software, NIS-elementer (Nikon, NY).

DNA Fragmentation Analyse ved agaroseelektroforese

Celler blev behandlet i nærvær eller fravær af PW-M, PW- H, PW-E og PPWH-7 (1,0, 10,0 og 100,0 ug /ml) i 48 timer, derefter høstet ved anvendelse af 500 pi lyserer puffer [50 mM Tris-HCI (pH 8,0), 20 mM EDTA (pH 8,0), 1,43 ml Tergitol

® opløsning Type NP-40, og 20 pi SDS 10%] ved 65 ° C i 30 minutter på is. Efterfølgende trin blev udført på is. 100 pi 8 M kaliumacetat blev tilsat til de suspenderede blandinger og inkuberet på is i 1 time. Supernatanten blev opnået ved centrifugering af lysaterne ved 10.000 x g i 10 minutter (Heraeus PICO 17, Thermo Scientific, USA) blev og de opløselige proteiner ekstraheret ved phenol /chloroform /isoamylalkohol (PCI; 25:24: 1, vol /vol /v) (Invitrogen Life Technologies). Endelig blev DNA præcipiteret under anvendelse af 2 × rumfang iskold absolut ethanol. For at udføre DNA-fragmentering assayet blev DNA-pelleten opløst i 20 pi TE-buffer [10 mM Tris-HCI og 1 mM EDTA, pH 8,0] sammen med 1 pi RNAse (10 ug /ml) og 1 pi proteinase K (100 ug /ml) og inkuberet ved 37 ° C i 30 minutter. DNA-fragmentering blev analyseret ved 1,5% agarosegelelektroforese. DNA-bånd blev observeret og fotograferet ved anvendelse af et Gene Flash geldokumentation systemet (Syngene Bioimaging, UK). Apoptoseinduktion indikeres ved fremkomsten af DNA-stige-fragmenter på ca. 180-200 bp multipla på agarosegel.

Caspase-3 Activity Assay

Aktivitet af caspase-3 blev bestemt under anvendelse af Caspase -3 /CPP32 kolorimetrisk assay kit (BioVision, CA) ifølge producentens protokol. Assayet er baseret på spektrofotometrisk detektion af kromoforen,

nitroanilid (

NA), efter at dens spaltning fra mærket substrat DEVD-

NA. Celler (2 x 10

6) blev pelleteret og lyseret efter behandling med 10 ug /ml PW-M, PW-H, og PW-E i

P. watsonii

sub-fraktionen PPWH-7 til 48 timer. Assays blev udført på 96-brønds mikrotiterplader ved inkubation 100 ug protein af cellelysat per prøve i 50 pi 2 x reaktionspuffer. Reaktionsbufferen er suppleret med 10 mM DTT og substrater af 4 mM DEVD-pNA i et slutvolumen på i alt til 100 pi og inkuberet ved 37 ° C i 1,5 timer. Dannelse af

nitroanilid blev målt under anvendelse af ELISA mikropladelæser ved en bølgelængde på 405 nm, og caspase aktiviteter blev udtrykt som procentdel af enzymaktivitet sammenlignet med kontrol (ubehandlede celler).

Cell Cycle Analysis ved flowcytometri

for at sammenligne effekten af ekstrakt PW-H og sub-fraktionen PPWH-7 på cellecyklus blev CycleTEST ™ PLUS DNA Reagent Kit (Becton Dickinson, USA), der anvendes. Cellerne (1 x 10

6 celler /ml) blev podet i en 6-brønds plade og behandlet med 10 ug /ml PW-H og sub-fraktion PPWH-7. Efter 24 timers inkubation blev cellerne høstet, bringes til suspension, permeabiliseret med trypsin buffer. Kerne-DNA’et blev mærket med propidiumiodid (PI) farveopløsning og inkuberet i mørke mellem 2 ° til 8 ° C i 10 minutter. Cellecyklusfase distribution af kerne-DNA blev bestemt ved flowcytometri (Becton Dickinson FACS Calibur, USA) ved analyse af mindst 10.000 celler per prøve. Procentdelen af celler i G1, S og G2 faser blev analyseret af ModFit LT software (Verity Software House, Topsham, ME).

Statistiske Analyser

Data blev præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse. Signifikante forskelle blev bestemt ved hjælp af Students

-test hvor *

0.05 betegner en statistisk signifikant forskel. Alle prøverne blev målt i tre eksemplarer.

Resultater

cytotoksicitet

P. watsonii

Uddrag-NRU Assay

I den foreliggende undersøgelse, de potentielle cytotoksiske virkninger (IC

50) af

P. watsonii

ekstrakt i methanol (PW-M), hexan (PW-H) og ethylacetat (PW-E) samt fraktioner og sub-fraktioner af PW-H blev undersøgt på to humane gynækologiske cancerceller (Skov- 3 og Ca Ski), en coloncancer-celler (HT-29), og en normale celler (MRC-5) ved hjælp af NRU assayet. Baseret på de amerikanske National Cancer Institute retningslinjer, er en rå ekstrakt generelt anses for at have

in vitro

cytotoksisk aktivitet, hvis IC

50 værdi i carcinomceller, efter inkubation mellem 48 og 72 timer, er ≤20 ug /ml, mens den for en ren forbindelse IC

50 værdi ≤4 ug /ml [33] – [34]. Cytotoksisk aktivitet (IC

50) og selektivitet indeks af ekstrakterne, brøker og sub-fraktioner er sammenfattet i tabel 2. Derudover doxorubicin, et udbredt kemoterapeutisk lægemiddel til behandling af akut leukæmi, lymfomer og forskellige typer af fast tumorer, såsom bryst-, lever- og lungekræft [35], blev anvendt som en positiv kontrol i eksperimenterne.

P. watsonii

ekstrakter udstillet størst cytotoksisk aktivitet på alle kræftceller testede, hvor alle viste IC

50 værdier 20 mikrogram /ml. De mest lovende og mest selektive cytotoksiske aktiviteter blev påvist i PW-H og PW-E. IC

50 (pg /ml) og SI-værdier med PW-H på SKOV-3, Ca Ski og HT-29-celler var 5,79 ± 0,29 (SI = 9,9), 6,94 ± 0,96 (SI = 8,3) og 11,79 ± 1,61 (SI = 4,9), hhv. Ud fra følgende betragtninger værdier med PW-E var 5,52 ± 0,50 (SI = 6,1), 3,58 ± 1,01 (SI = 9,4) og 5,14 ± 0,36 (SI = 6,6), hhv. PW-H blev valgt til bioassaystyret fraktionering som det viste den stærkeste cytotoksisk virkning på kræftceller og var den mindst toksiske på normale celler i forhold til PW-M og PW-E. Disse er de kriterier, der normalt anses for at retfærdiggøre yderligere rensning af ekstraktet [36].

bioassaystyret Fraktionering-NRU Assay

Søjlekromatografi (CC) i PW-H givet i alt 10 fraktioner. Fraktioner af PW-H demonstrerede stærkere cytotoksisk aktivitet og højere selektivitet sammenlignet med PW-H især når testet på SKOV-3-celler (tabel 2). På Skov-3-celler, fraktionerne PWH-4, PWH-5, PWH-6, PWH-7 og PWH-8 udviste IC

50 værdier på 0,29 ± 0,06 (SI = 56,0), 0,18 ± 0,06 (SI = 68,1), 0,42 ± 0,12 (SI = 18,7), 0,77 ± 0,29 (SI = 10,4) og 0,36 ± 0,12 (SI = 23,0) pg /ml. IC

50 værdier opnået, når Ca Ski og HT-29-celler blev behandlet med fraktionerne PWH-4 – PWH-8 var mellem intervallet fra 2,77 til 13,19 og 1,21 til 10,78 pg /ml. Fraktionerne PWH-4 til PWH-8 blev opnået fra midterdelen af silicasøjle (hexan /Me

2CO: 40:60 /50:50), og dette viser, at tilstedeværelsen af stærkt cytotoksiske forbindelser var på den mellemliggende polaritet fase. Disse fraktioner blev samlet og underkastet det andet trin af bioassaystyret fraktionering og gav 8 sub-fraktioner. PPWH-7 var den mest cytotoksiske og udviste højere selektivitet (SI) på Ca Ski og HT-29-celler med IC

50 (pg /ml) og SI-værdier på 0,83 ± 0,00 (SI = 12,8) og 0,83 ± 0,10 ( SI = 12,8), (tabel 2). Tværtimod oprensede sub-fraktion PPWH-7 demonstrerede lavere cytotoksisk og selektivitet virkning på SKOV-3-celler (IC

50 = 0,66 ± 0,06 ug /ml; SI = 15,5) sammenlignet med fraktionerne PWH-4 (IC

50 = 0,29 ± 0,06 pg /mL; SI = 56,0), PWH-5 (IC

50 = 0,18 ± 0,06 pg /mL; SI = 68,1), PWH-6 (IC

50 = 0,42 ± 0,12 mg /ml; SI = 18,7) og PWH-8 (IC

50 = 0,36 ± 0,12 pg /mL; SI = 23,0). Det er værd at nævne, at PPWH-7 viste lignende cytotoksisk aktivitet som standard anticancerlægemiddel, doxorubicin, som blev anvendt som en positiv kontrol i den foreliggende undersøgelse. Men doxorubicin også udstillet høje toksicitet på MRC-5 normale celler mens PPWH-7 viste omkring 6 gange lavere toksicitet på MRC-5 normale celler.

LCMS /MS Analyse

Sub-fraktionen PPWH -7 blev analyseret ved LC-MS /MS-system og mindst 15 forbindelser var til stede i PPWH-7, hvoraf 7 forbindelser med retentionstider af større toppe blev identificeret ved massespektrometri (tabel 3). Et eksempel på LC-MS /MS-analyse, der viser en positiv fuld spektre kromatogram af en af den detekterede forbindelse (ellagsyre i sub-fraktion PPWH-7) i en positiv ion-mode (EPI-tilstand) er vist i figur 3. Den vigtigste top med en retentionstid på 13,99 min blev identificeret som methylesteren af geraiinic syre (MS

m /z

= 397), og kalium phyllanthin (MS

m /z

= 457). Phyllanthin blev også identificeret som natrium phyllanthin (MS

m /z

= 441) på en retentionstid på 11,66 min. En anden større top blev identificeret som sterol glucosid (MS

m /z

= 718), en isoprenoider på retentionstid på 9,39 min. To triterpen elueres ved retentionstid på 10,20 min og 13,45 min og blev identificeret som glochidone (MS

m /z

= 423) og betulin (MS

m /z

= 443), henholdsvis . En polyphenolisk Forbindelse identificeret som trimethyl ether med ellagsyre (MS

m /z

= 345) blev elueret ved en retentionstid på 7,77 min (figur 4).

Peak numrene henviser til tabel 3.

Morfologisk Vurdering af apoptotiske celler ved fase-kontrast omvendt mikroskop

Morfologisk observation af ubehandlet SKOV-3, Ca ski og HT-29 celler viste, at kontrolceller opretholdt deres oprindelige morfologi, der er kasser, og polygonale i deres form og var klæbende til pladerne (figur 5). I modsætning hertil SKOV-3, Ca Ski og HT-29-celler behandlet med PW-M, PW-H, og PW-E og PPWH-7 udviste apoptotiske-lignende karakteristika såsom krympning af celler, blæredannelse og chromatinkondensation nukleare og sammenlægning i tætte masser under nukleare membran. Celler undergår apoptose resulterede også i andre typer af morfologiske ændringer såsom krympning af rundet op cellerne og miste kontakten med naboceller. Som et resultat, nogle følsomme celler med frigøres fra overfladen af brønds plader.

SKOV-3, Ca Ski og HT-29-celler efter behandling med 10 ug /ml PW-M, PW-H, PW-E og PPWH-7 i 24 timer. Pile viser dannelsen af (A) apoptotiske legemer; (B) kondenseret kerner og (c) membranblæredannelse som bevis for apoptose. Billederne er repræsentative for en af tre lignende forsøg.

Morfologisk Vurdering af apoptotiske celler ved acridin orange (AO) -ethidium bromid (EB) Dobbelt Farvning

De morfologiske ændringer af SKOV -3, Ca Ski og HT-29-celler behandlet med 10,0 ug /ml PW-M, PW-H, PW-E og PPWH-7 i 24 timer blev observeret af AO /EB-farvning og cellerne blev klassificeret som levende ( normal), apoptotisk og nekrotisk (figur 6). Levende celler med intakt DNA og kerne vil have en rund og grønne kerner.

Kronisk sygdom

PLoS ONE: væksthæmning for Human Gynækologisk og Colon Cancer Cells ved Phyllanthus watsonii gennem Apoptose Induction

Be the first to comment

Leave a Reply Annuller svar