PLoS ONE: Ekspression af Livin i kolorektal cancer og dens forhold til Tumor Cell Behavior og Prognosis

Abstrakt

Baggrunde

Angivelse af Livin, medlem af hæmmere af apoptose protein familie, er forbundet med tumorudvikling og progression. Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om Livin påvirker onkogene biologisk adfærd kolorektal cancer celler, og at dokumentere sammenhængen mellem sit udtryk og forskellige klinisk-patologiske parametre i kolorektal cancer.

Metoder

Vi undersøgte virkningen af ​​Livin på tumorceller adfærd ved hjælp af små interfererende RNA og pcDNA3.1 vektor i SW480 og DKO1 kolorektal cancer cellelinjer. Ekspressionen af ​​Livin blev undersøgt ved RT-PCR og immunohistokemi i coloretcal cancervæv. De apoptotiske celler blev visualiseret ved TUNEL assay, og proliferative celler blev visualiseret ved Ki-67 antistof farvning.

Resultater

Knockdown af Livin undertrykt tumor celle migration og invasion i kolorektal cancer celler. Knockdown af Livin induceret apoptose ved opregulering af caspase-3, -7 og PARP aktiviteter og cellecyklusstandsningen ved at nedsætte cyclin D1, cyclin D3, cyclin-afhængig kinase 4 og 6, og ved at inducere p27-ekspression. MAPK signaleringskaskader blev væsentligt blokeret af knockdown af Livin. I modsætning hertil overekspression af Livin forbedret tumorcellemigration og invasion, og inhiberede apoptose og cellecyklusstop. Det betyder apoptotisk indeks (AI) værdien af ​​Livin positive tumorer var betydeligt lavere end AI i Livin negative tumorer. Der var imidlertid ingen signifikant forskel mellem Livin ekspression og Ki-67 mærkningsindeks (KI). Livin udtryk blev øget betydeligt i kolorektal cancer og metastatisk lymfeknude væv sammenlignet med normale kolorektal mucosa og ikke-metastatisk lymfeknude væv og var forbundet med tumor stadie, lymphovascular invasion, lymfeknude metastaser og dårlig overlevelse.

Konklusioner

Disse resultater indikerer, at Livin er associeret med tumorudvikling ved at øge tumorcellemotilitet og inhibere apoptose i colorektal cancer

Henvisning:. Myung DS, Park YL, Chung CY, Park HC, Kim JS, cho SB, et al. (2013) Ekspression af Livin i kolorektal cancer og dens forhold til Tumor Cell Behavior og Prognose. PLoS ONE 8 (9): e73262. doi: 10,1371 /journal.pone.0073262

Redaktør: DunFa Peng, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: Februar 19, 2013; Accepteret: 19 Jul 2013; Udgivet 2. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Myung et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en bevilling (0720570) fra National Research Udviklingsprogram for Cancer Control Sundhedsministeriet Velfærd, Republikken Korea. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

kolorektal cancer er en af ​​de førende årsager til cancerassocieret sygelighed og dødelighed i verden. Trods beviser for, at 5-års overlevelsen er 90%, når kolorektal cancer er diagnosticeret på et tidligt stadium, 40% af tilfældene diagnosticeres når kræften stadig er lokaliseret [1]. Hurtige fremskridt i vores forståelse for de molekylære og biologiske karakteristika af kolorektal cancer har givet nyttig viden i patogenesen af ​​kolorektal cancer. Biomarkører er blevet udviklet til at identificere personer, der vil drage størst fordel af kræft overvågning og forvaltning [2-5]. Afdækker biomarkører, der kan opdage tyktarmskræft tidligere eller overvåge kræft progression ville gøre det muligt personliggørelse af lægevidenskaben og forbedre overlevelsesprocenten for patienter med kræft.

De underliggende virkningsmekanismer i kræft progression er begyndt at blive bragt i orden. De rapporterede molekylære og biokemiske mekanismer, der kan bidrage til de fænotypiske ændringer til fordel for carcinogenese, omfatter hæmmede apoptose, forbedret tumorcelleproliferation, øget invasionsevne, forstyrrelse af celleadhæsion, fremme af angiogenese, og hæmmede immun overvågning. Disse begivenheder kan bidrage til udvikling og progression af kræft [6-8].

Apoptose spiller en vigtig rolle i mange biologiske arrangementer, herunder morfogenese, cellefornyelsen og eliminering af skadelige celler. En forstyrrelse i apoptose kan give en overlevelse fordel maligne celler, der huser genetiske ændringer og dermed fremme udviklingen af ​​kræft [9,10]. Den centrale hændelse i apoptosis er den proteolytiske aktivering af en klasse af cystein aspartyl-specifikke proteaser, caspaserne. Initiator Caspaser spalter effektor-caspaser, som igen nedbrydes en række intracellulære proteinsubstrater og derved inducerer de karakteristiske morfologiske kendetegn for apoptose [11]. Disse caspase aktiviteter hæmmes af inhibitorer af apoptose proteiner (IAP) familie. Indtil nu har otte menneskelige IAP’er blevet identificeret, herunder c-IAP1, c-IAP2, NAIP, XIAP, ILP-2, BRUCE, Survivin og Livin [12]. Livin blev for nylig identificeret til at være et hidtil ukendt anti-apoptotisk gen. Livin rekrutteres til døden receptorsignalering komplekser, hvor det hæmmer aktivering af caspaser, der er ansvarlige for apoptose og beskytter celler fra forskellige pro-apoptotiske stimuli. Livin er associeret med induktion af onkogene fænotyper, herunder invasion, motilitet, celleproliferation og inhibering af apoptose i humane cancercellelinier [13-16]. Derudover er Livin ekspression i langt størstedelen af ​​humane cancere forbedret og korreleret med udviklingen af ​​kræft og progression [17-22]. Silencing af Livin genet under anvendelse lille interfererende RNA (siRNA) falder tumorvolumen ved at inducere apoptose i en xenograft model for colorectal cancer [23]. Derfor er Livin betragtes som en potentiel terapeutisk mål for behandling af kolorektal cancer.

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere, om Livin påvirker onkogene biologiske opførsel af humane kolorektal cancer celler, for at evaluere Livin udtryk i humane kolorektal cancer væv, og undersøge korrelationen mellem Livin med apoptose, tumorcelleproliferation og klinisk-patologiske funktioner, herunder overlevelse.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Denne undersøgelse blev godkendt af Institutional Review bestyrelse Chonnam National University Hwasun Hospital (Jeonnam, Korea). Et skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver deltager før overtagelsen væv. Alle deltagere gav skriftligt samtykke fra deres oplysninger, der skal lagres på hospitalet databasen og bruges til forskning.

Patienter og vævsprøver

Tyve kolorektal cancer væv og parrede normale colon væv blev indsamlet ved coloskopisk biopsi for RNA og protein forberedelser på Chonnam National University Hwasun Hospital. Formalin-fikseret og paraffin-embedded vævsprøver fra 161 tilfældigt udvalgte patienter, som havde gennemgået kirurgi for tarmkræft på Chonnam National University Hwasun Hospital mellem januar 2004 og december 2004, var opnået for immunhistokemi. Ingen patienter havde undergået præoperativ strålebehandling eller kemoterapi. Patologiske rapporter og kliniske historier på tidspunktet for kirurgi blev revideret i medicinske journaler. Vævsblokke blev udvalgt ved at se originale patologiske objektglas og vælge blokke, der viste forbindelsen mellem normal colon epitel og tumor region. Tumorer blev iscenesat i overensstemmelse med amerikanske Blandede kræft iscenesættelse systemet [24]. Overlevelse blev målt fra tidspunktet for operationen indtil opfølgning den 31. december, 2010.

Cell kultur og siRNA transfektion

SW480 og DKO1 Humane kolorektal cancer cellelinjer blev opnået fra American Type Culture Collection (Rockville, MD, USA) og dyrket i DMEM (Hyclone, Loan, UT, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone) i en fugtig inkubator ved 37 ℃ med en CO 5%

2 atmosfære. Livin og krypterede siRNA blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA) og Qiagen (Valencia, CA, USA), hhv. Livin cDNA blev subklonet i pcDNA3.1-vektoren (Invitogen, Carlsbad, CA, USA). Livin konstruktion blev bekræftet ved sekventering. Den specifikke gen blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine

TM RNAiMAX og Lipofectamin

TM 2000 (Invitrogen) i overensstemmelse med producentens anbefalinger og derefter inkuberet i 48 timer. Desuden blev celler transficeret med pcDNA3.1-vektor selektivt behandlet med 5-fluoruracil (5-FU) (10 pg /ml, Choong-Wae, Chung-Nam, Korea) i 48 timer.

Reverse transcription- polymerasekædereaktion (RT-PCR)

Totalt RNA blev ekstraheret under anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) og revers-transkriberet med MMLV transskription reagenser (Invitrogen) ifølge producentens anbefalinger. PCR-amplifikation af cDNA blev udført ved anvendelse af gen-specifikke primere og Go Taq

® DNA-polymerase (Promega, Madison, WI, USA). Følgende specifikke primere blev anvendt; Livin 5′-CACACAGGCCATCAGGACAAG-3 ‘/5′-ACGGCACAAAGACGATGGAC-3′; GAPDH 5’-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3 ‘/5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3’.

Western blotting

Cellelysater fremstillet ved anvendelse af M-PER

® pattedyrprotein Extraction reagens (Thermo, Rockford, IL, USA) med Halt

TM fosfatase-hæmmer og Halt

TM proteaseinhibitorcocktail (Thermo). Totale proteiner blev elektrooverført på PVDF-membraner (Millipore, Billerica, MA, USA), og de specifikke proteiner blev blottet med det primære antistof. Følgende antistoffer blev anvendt: antistoffer mod Livin, X-kromosom bindende IAP (XIAP), Survivin og β-tubulin blev indkøbt fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA). Antistoffer mod ekstracellulært signal-reguleret kinase (ERK), phospho-ERK, p38, og phospho-p38, c-Jun NH

2-terminal kinase (JNK), phospho-JNK, phospho-Akt, Akt, phospho-p65 , spaltet caspase (3, 7 og 9), spaltes poly (ADP-ribose) polymerase (PARP), cyclin-afhængig kinase 4 (CDK4), CDK6, cyclin D1, cyclin D3, cyclin B1, p21, p27, p57, p15, p16 og anden mitokondrier-afledt aktivator af caspaser /direkte IAP-bindende protein med lav pI (SMAC /DIABLO) blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA, USA). Immunoreaktive proteiner blev visualiseret ved den forøget kemiluminescens påvisningssystem HRP substrat (Millipore) og LAS-4000 luminescerende billedanalysator (Fujifilm, Tokyo, Japan).

Cell invasion assay

Invasive evne blev beregnet med antallet af celler, der passerede gennem Transwell filterkamrene (Corning Inc., Corning, NY, USA) med 8 um porer. Transwell filtre blev coatet med 1% gelatine natten over og tørret ved stuetemperatur (RT). Celler blev podet på levedygtige celler af 2 x 10

5 i 0,2% BSA-medium i det øvre kammer. Humant plasma fibronectin (Calbiochem, La Jolla, CA, USA) blev tilsat som en kemoattraktant til 0,2% BSA-medium i det nedre kammer. Efter en 24 timers inkubation blev de invaderede celler på undersiden af ​​Transwell farvet med Diff-Quik-opløsning (Sysmex, Kobe, Japan) og talt i fem udvalgte felter under et lysmikroskop. Data er udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse af antallet af celler /felt i tre individuelle eksperimenter. Salg

cellemigrationsassay

cellemigrationsassay blev udført under anvendelse Kultur-indsatser (2 x 0,22 cm

2; Ibidi, Regensburg, Tyskland). For at oprette et sår hul blev celler podet i Kultur-Indstik, der blidt blev fjernet efter en 24 timers inkubation med sterile pincetter. Forløbet af sårlukning blev fotograferet med et omvendt mikroskop. Afstanden mellem hullerne blev normaliseret til 1 cm efter opsamling fra tre tilfældige steder.

Cell levedygtighed

Cell levedygtighed blev bestemt med EZ-CyTox (tetrazoliumsalte, WST-1) celleviabilitetstest kit (Daeil Lab Inc., Seoul, Korea). Efter anvendelse af WST-1 reagens ved 37 ℃, blev cellelevedygtighed målt ved anvendelse af en mikropladelæser (Infinite M200, Tecan, Austria GmbH, Wien, Østrig) med Magellan V6 dataanalyse software (Tecan). Tredobbelte brønde blev anvendt til hvert eksperiment og alle forsøg blev udført mindst tredobbelt.

Flowcytometrisk analyse

Transficerede celler blev trypsinbehandlet, opsamlet i PBS og resuspenderet i 1X bindingspuffer (BD Biosciences , San Diego, CA, USA). Cellesuspensioner blev inkuberet i APC Annexin V og 7-amino-actinomycin D (BD Biosciences) ved stuetemperatur. For cellecyklusanalyse blev cellerne inkuberet i 10 ug /ml ribonuclease A (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) og 50 pg /ml propidiumiodid (PI) ved stuetemperatur i mørke. Populationen af ​​Annexin-V-positive celler og cellecyklus fase blev analyseret under anvendelse af en BD Cell Quest

® Version 3.3 instrument (Becton Dickinson, San José, CA, USA) og WinMDI udgave 2.9 software (The Scripps Research Institute, San Diego, CA, USA).

Immunhistokemi

Paraffin vævssnit fra patienter blev afparaffiniseret, rehydreret og hentet med hentning buffer. Vævene blev behandlet med et peroxidase-blokerende opløsning (Dako, Carpinteria, CA, USA) for at blokere endogen peroxidase-aktivitet og inkuberet med polyklonalt kanin-anti-humant Livin i primære fortyndingsmiddel opløsning (Invitrogen) natten over ved 4 ° C. Efter vask i TBST blev vævene farvet ved anvendelse Dako, Fast

TM Envision HRP /DAB detektionssystem (Dako). Farvede væv blev set og fotograferet under et lysmikroskop.

Evaluering af Livin udtryk

Immunofarvede prøver blev evalueret uafhængigt af to observatører uden kendskab til de klinisk-patologiske data. Hvis der var en uoverensstemmelse, opnået enighed efter yderligere vurdering. Intensiteten af ​​positive cancerceller blev vurderet på en skala fra fire: 0, ingen farvning af cancerceller; 1, svag farvning; 2, moderat farvning; 3, stærk farvning. Procentdelen af ​​farvede cancerceller blev også vurderet på en skala fra fire: 0, ingen; 1, 10%; 2, 10-50%; 3, 50%. Intensiteten rating blev ganget med procent pletten bedømmelse at opnå en samlet score. Den gennemsnitlige samlede score for de 161 tumorer analyserede var 4,0. Således blev den gennemsnitlige samlede score på 4,0 valgt som cut-off point for at diskriminere Livin udtryk status. Prøver med en score . 4 blev betragtet som positiv, og dem med en score ≤ 4 blev betragtet som negative udtryk

Vurdering af tumorcelleproliferation

Prolifererende tumorceller blev visualiseret ved farvning immunhistokemisk anvendelse af et anti-Ki-67-antistof (MIB-1; fortyndet 1: 150; Dakopatts, Glostrup, Danmark). Distinct nukleare Ki-67 immunoreaktivitet blev betragtet som positive. Ki-67 mærkningsindeks (KI) præsenteres som antallet af Ki-67-positive kerner /1000 tumor cellekerner. KI er blevet anvendt til at estimere den proliferative evne af tumorceller.

Terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret deoxyuridintriphosphat (dUTP) nick endemærkning (TUNEL) assay

apoptotiske celler og legemer var påvist ved anvendelse af deadend

TM Kolorimetrisk TUNEL System (Promega, Madison, WI, USA) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev vævssnittene afvokset og hydratiseret gennem en gradueret alkohol serie. Permeabilisering blev derefter udført i proteinase K opløsningen i 15 minutter. Mærkning blev udført ved tilsætning af enzymet TdT-reaktionsblandingen til vævssnit på objektglassene i 60 minutter i en 37 ℃ fugtigt kammer. Mærkede celler blev udviklet ved anvendelse streptavidin HRP og 3,3-diaminobenzidin enzymsubstrat. En kvantitativ metode til beregning apoptotiske celler blev anvendt af to uafhængige patologer. Alle sektioner blev undersøgt under høj effekt felter (forstørrelse på 40 x 10). Markerne blev udvalgt i den højeste markeret område, for hver enkelt sag. Den apoptotiske indeks (AI) blev udtrykt som antallet af positive kerner herunder apoptotiske legemer blandt 1000 tumor cellekerner.

Statistisk analyse

Data fra mindst tre uafhængige forsøg blev anvendt til at sammenligne mellem grupper . Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelser. Studerendes

t

-test blev anvendt til at bestemme statistisk signifikans for den tværpolitiske gruppe sammenligninger. Den χ

2-test og Fishers eksakte test, hvor det er relevant, blev anvendt til sammenligning Livin ekspression med forskellige klinisk-patologiske parametre. Forholdet mellem Livin udtryk og KI eller AI blev evalueret af den studerendes

t

-test. Aktuarmæssige overlevelsesrater for patienter med positiv eller negativ Livin ekspression blev vurderet ifølge Kaplan-Meier-metoden, og forskellene blev testet med en log-rank test. Det statistiske pakke for Social Sciences (SPSS /PC + 15,0, Chicago, IL, USA) blev anvendt til alle analyser. En p-værdi 0,05 blev betragtet som signifikant.

Resultater

Virkningen af ​​Livin på invasion, migration og proliferation af humane kolorektal cancerceller

For at undersøge funktionen af ​​Livin på onkogen biologisk adfærd kolorektal cancer celler, blev Livin siRNA eller pcDNA3.1-Livin bruges til at styre det endogene Livin genekspression i SW480 og DKO1 humane kolorektale cancer cellelinjer. Livin genekspression i alle testede celler, viste en specifik reduktion på mRNA og protein niveauer ved transfektion af Livin siRNA og en specifik forøgelse af transfektion af pcDNA3.1-Livin. Antallet af invaderende Livin siRNA-transficerede SW480 og DKO1 celler var 30,2 ± 3,1 og 55,3 ± 11,0, mens 51,8 ± 9,5 og 115,3 ± 10,3 celler blev observeret for scrambled siRNA-transficerede celler. Celler blev målt i seks tilfældige 0,5 × 0,5 mm

2 mikroskopiske felter anvendelse af 10 ug /ml fibronectin som en kemoattraktant. Forskellen mellem de to celletyper var signifikant (p = 0,015 og p 0,001, henholdsvis). I modsætning hertil blev antallet af invaderende celler steget betydeligt i pcDNA3.1-Livin transficerede SW480 og DKO1 celler sammenlignet med tomme-pcDNA3.1 transfekterede celler (p = 0,024 og p = 0,012, henholdsvis) (figur 1A). Den kunstige sår hul i plader af scrambled siRNA-transficerede celler blev betydeligt smallere end i Livin siRNA-transficerede celler ved 48 h i SW480 og på 24 timer i DKO1 celler (p = 0,012 og p = 0,016, henholdsvis). Den kunstige sårhullet i pcDNA3.1-Livin transficerede SW480-celler blev signifikant smallere end den tomme-pcDNA3.1 transficerede celler efter 24 og 48 timer (p = 0,034 og p = 0,008, henholdsvis) (figur 1B). Den celleproliferationsassay blev udført ved 2, 3, 4, og 5 dage efter transfektion af Livin siRNA eller pcDNA3.1-Livin at få adgang til potentialet i Livin på celleproliferation. Prolifererende celler, som bestemt ved absorbans, faldt betydeligt i Livin siRNA-transficerede SW480-celler sammenlignet med scrambled siRNA-transficerede celler ved 3, 4 og 5 dage (p = 0,005, 0,001 og 0,022, henholdsvis), men ingen signifikant forskel blev observeret i DKO1 celler. Derudover er der i alle testede celler, var der ingen signifikant forskel på celleproliferation mellem pcDNA3.1-Livin og tomme-pcDNA3.1 transfekterede celler (Figur 1C).

(A) Virkningen af ​​Livin på invasion af kolorektal cancer celler. Invasionen assay under anvendelse siRNA eller pcDNA3.1-transficerede celler blev udført. Farvede invaderende celler blev talt, og er repræsenteret som en graf mellem grupperne. Antallet af LS-transficerede celler, der invaderede var signifikant lavere end den for SS-transficerede celler. Antallet af indtrængende celler var signifikant højere i LV-transficerede celler sammenlignet med EV-transficerede celler (gennemsnit ± standardafvigelse [SE], n = 6; * p 0,05). (B) Virkningen af ​​Livin om migration af kolorektal cancer celler. Den sårhelende assay under anvendelse siRNA eller pcDNA3.1-transficerede celler blev udført og grafer af cellemigrering vises som relative helbredende afstande. Cellemigrering signifikant forstyrret i LS-transficerede SW480 og DKO1 celler og voksede i LV-transficerede SW480-celler (gennemsnit ± SE, n = 3; * p 0,05). (C) Virkningen af ​​Livin om spredning af kolorektal cancer celler. Absorbansen indikerer prolifererende levedygtige celler faldt i LS-transficerede SW480-celler, men der var ingen signifikant forskel på celleproliferation mellem LV og EV transficerede celler (gennemsnit ± SE, n = 3; * p 0,05). SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Virkningen af ​​Livin på apoptose i humane kolorektale cancerceller

Vi udførte flowcytometrisk analyser at evaluere virkningen af ​​Livin på apoptose. Cellen apoptotisk sats induceret af transfektion af Livin siRNA steget markant, sammenlignet med induceret ved transfektion af scrambled siRNA (6,9

vs.

19,6%) i SW480 celler, men Livin knockdown havde en minimal indflydelse på apoptose (11,3

vs.

16,7%) i DKO1 celler (figur 2A). 5-FU er velkendt at inducere apoptose og påvirke cellens cyklus af kræftcellerne. Overekspression af Livin ved transfektion af pcDNA3.1-Livin inhiberede apoptose af SW480-celler som respons på 5-FU, men overekspression af Livin havde en minimal indflydelse på apoptose i DKO1 celler (figur 2A). Vi undersøgte yderligere caspase-specifikke aktiviteter for at bestemme aktivering af caspaser under knockdown og overekspression af Livin. Spaltede caspase-3 og -7 og PARP udtryk blev opreguleret i SW480 og DKO1 celler efter Livin knockdown og ned-reguleres efter overekspression af Livin (figur 2B). Som vist i figur 2C blev Survivin proteinniveauet reduceret på grund af Livin knockdown i SW480 og DKO1 celler, men XIAP og SMAC /DIABLO proteinniveauer ændredes ikke som reaktion på livin knockdown. Derudover blev den survivin, XIAP og SMAC /DIABLO proteinniveauer ikke ændret efter overekspression af Livin.

(A) Andelen af ​​apoptotiske celler induceret ved transfektion af LS var større end den induceret ved transfektion af SS (6,9 vs. 19,6%) i SW480 celler, men Livin knockdown havde en minimal indflydelse på apoptose (11,3 vs. 16,7%) i DKO1 celler. Overekspression af Livin ved transfektion af LV inhiberede apoptose af SW480-celler som respons på 5-FU, men overekspression af Livin havde en minimal indflydelse på apoptose i DKO1 celler (B) Ekspression af spaltet caspase-3, -7, -9 og PARP proteiner. Caspase-3 blev -7 og PARP-ekspression forhøjet i SW480 og DKO1 celler efter Livin knockdown, og faldt efter overekspression af Livin (C) Ekspression af apoptose regulatoriske proteiner. Survivin proteinniveau faldt efter Livin knockdown i SW480 og DKO1 celler, men XIAP og SMAC /DIABLO protein niveauer blev ikke ændret som reaktion på Livin knockdown. Derudover blev Survivin, XIAP og SMAC /DIABLO protein niveauer ikke ændret efter overekspression af Livin. PARP; Poly (ADP-ribose) polymerase, XIAP; X-kromosomet bindende IAP, SMAC /DIABLO; anden mitokondrier-afledte aktivator af caspaser /direkte IAP-bindende protein med lav pi, SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin, 5-FU; 5-fluorouracil, 7-AAD; 7-amino-actinomycin D.

Virkningen af ​​Livin på cellecyklus arrest i humane kolorektale cancerceller

Vi udførte flowcytometrisk analyser at afsløre, om Livin kunne ændre cellecyklus distribution. Livin knockdown resulterede i standsning af cellecyklus i G0 /G1-fasen af ​​SW480-celler og S-fasen af ​​DKO1 celler (figur 3A). 5-FU behandling induceret cellecyklusstop i subG1 fase af SW480 og G0 /G1 fase af DKO1 celler. Overekspression af Livin inhiberede 5-FU-induceret standsning af cellecyklus i SW480-celler og havde en minimal indflydelse på DKO1 celler (figur 3A). Dernæst vi evaluerede effekten af ​​Livin på forskellige CDK hæmmere (CDKIs) involveret i cellecyklus arrest i humane kolorektale cancerceller. Som vist i figur 3B, p27 proteinniveau steg markant med Livin knockdown, og faldt med overekspression af Livin i SW480 og DKO1 celler. Imidlertid blev p21, P57, P15 og P16 protein niveauer ikke ændret som reaktion på knockdown og overekspression af Livin. Cycliner og CDK’er er negativt reguleret af CDKIs. Derfor undersøgte vi virkningen af ​​Livin på udtrykte niveauer af cyclin D1, cyclin D3, cyclin B1, CDK4 og CDK6. Som vist i figur 3C, cyclin D1, cyclin D3, CDK4 og CDK6 proteinniveauer blev signifikant nedsat ved Livin knockdown, og øget cyclin D1 og CDK4 ved overekspression af Livin i SW480 og DKO1 celler.

( A) Livin knockdown resulterede i standsning af cellecyklus i G0 /G1-fasen af ​​SW480-celler og S-fasen af ​​DKO1 celler. 5-FU behandling inducerede standsning af cellecyklus i subG1 fase af SW480 og G0 /G1-fasen af ​​DKO1 celler. Overekspression af Livin inhiberede 5-FU-induceret standsning af cellecyklus i SW480-celler og havde en minimal indflydelse i DKO1 celler. Et repræsentativt eksperiment af tre uafhængige forsøg er vist. (B) Ekspression af cyclin-afhængig kinase (CDK) inhibitor proteiner. Den p27 protein niveauet var signifikant forhøjet ved Livin knockdown og faldt med overekspression af Livin i SW480 og DKO1 celler. Imidlertid blev p21, P57, P15 og P16 protein niveauer ikke ændret som reaktion på knockdown eller overekspression af Livin. (C) Ekspression af cycliner og cyclinafhængige kinase (CDK’er) proteiner. Cyclin D1, cyklin D3, CDK4 og CDK6 protein niveauer blev signifikant reduceret med Livin knockdown og øget cyclin D1 og CDK4 ved overekspression af Livin i SW480 og DKO1 celler. SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Virkningen af ​​Livin på intracellulære signalveje, der er involveret i apoptose og cellecyklusstop i humane kolorektale cancerceller

Vi undersøgt effekten af ​​Livin på stimulering af intracellulære signalveje, der fører til apoptose og cellecyklus arrest i SW480 og DKO1 celler til at udforske de potentielle mekanismer involveret i apoptose og cellecyklusstop. Phosphoryleringsniveauerne af ERK1 /2, JNK og p38 blev nedreguleret i Livin knockdowned SW480 og DKO1 celler (figur 4). Men Akt og p65 phosphoryleringsniveauerne forblev uændret ved Livin knockdown. Derudover ERK1 /2, JNK, p38, Akt og p65 phosphoryleringsniveauerne forblev uændret ved overekspression af Livin.

De phosphoryleringsbegivenheder niveauer af ERK1 /2, JNK og p38 nedsat følgende Livin knockdown af SW480 og DKO1 celler. Men Akt og p65 phosphoryleringsniveauerne viste ingen ændring efter Livin knockdown. Derudover ERK1 /2, JNK, p38, Akt og p65 phosphoryleringsniveauerne blev ikke ændret ved overekspression af Livin. SS; scramble siRNA, LS; Livin siRNA, EV; Empty-pcDNA3.1, LV; pcDNA3.1-Livin.

Livin udtryk i human colorectal cancer og metastatisk lymfeknude væv

For at bekræfte resultaterne af de kolorektale cancer cellelinje undersøgelser, vi evalueret Livin udtryk ved RNA og protein-niveauer ved RT-PCR, Western blotting og immunhistokemi i humane colorektale cancervæv, parrede normale colorektal slimhinde, og metastatiske og ikke-metastatiske lymfeknude væv af samme patienter taget fra coloskopisk biopsi og kirurgiske prøver. I de coloskopisk biopsiprøver bekræftede vi opregulering af Livin ekspression i cancervæv sammenlignet med den i parret normal slimhinde på RNA og protein niveauer (p = 0,035 og p = 0,020, henholdsvis) (figur 5A, B). I paraffin vævssnit, gjorde Livin protein ikke eller kun svagt immunfarvet ved normal colorektal mucosa (figur 6A). Immunfarvning af den Livin protein blev overvejende identificeret i kernerne i cancerceller men var ikke påviselig i tumoren stroma (figur 6A). Immunfarvning af Livin i metastatiske lymfeknudevæv var signifikant stærkere end i ikke-metastatiske lymfeknude væv (figur 6B). Den samlede score for Livin immunfarvning i metastatisk lymfeknude væv var signifikant højere end i nonnmetastatisk lymfeknude væv (

P

0,001) (Figur 6C)

(A) Livin mRNA-ekspression. (B) Livin proteinekspression. Ekspression af Livin opreguleres i cancervæv sammenlignet med parrede normale slimhinde på mRNA og proteinniveauer i friske coloskopisk biopsiprøver. Hver søjle repræsenterer middelværdien ± SE 20 tilfælde. * P 0,05 versus normal colorektal slimhinde. T; colorektal cancer væv, N; parret normal kolorektal slimhinde.

(A) Livin protein blev overvejende immunofarves i kerner af kræftceller, men ikke eller kun svagt immunofarves i normal kolorektal slimhinde (× 100). (B) Den immunfarvning af Livin i metastatiske lymfeknuder væv var betydeligt stærkere end i ikke-metastatiske lymfeknude væv (× 100). (C) Den samlede score for Livin immunfarvning i metastatisk lymfeknude væv var signifikant højere end i ikke-metastatiske lymfeknude væv (* p 0,001). T; colorektal cancer væv, N; parret normal kolorektal slimhinde, NL; ikke-metastatisk lymfeknude væv, ML; metastatisk lymfeknude væv.

Korrelationer mellem Livin udtryk og tumorcelleproliferation og apoptose i humane kolorektal kræft

Ki-67 immunoreaktivitet blev overvejende findes i kerner af kræftceller (figur 7A ). Den KI for 161 tumorer varierede fra 21.9 til 85,6 med en gennemsnitlig KI på 52,8 ± 15,1. Ingen signifikant forskel blev observeret mellem Livin ekspression og KI (p = 0,504) (tabel 1). Standard morfologiske kriterier for apoptotiske celler ved anvendelse af TUNEL-assayet er tilstedeværelsen af ​​beaded eller indskrumpet chromatin og apoptotiske legemer med en klar ring (figur 7B). AI for 161 tumorer var fra 0,6 til 30,0 med en gennemsnitlig AI på 8,8 ± 5,6. Middelværdien AI værdi Livin-positive tumorer var 6,4 ± 3,7, hvilket var betydeligt lavere end AI i Livin-negative tumorer (p = 0,009) (Tabel 1).

(A) immunfarvning af Ki-67 . Immunfarvning af Ki-67 viser stærke kernekraft positivitet i kræftcellerne, men er sjældent positiv i den normale kolorektal slimhinde (× 200). (B) Påvisning af apoptotiske celler (pil) ved TUNEL-farvning. Apoptotiske celler med klassiske egenskaber ved DNA kondensation er vist at have en halogen bestående af pyknotiske kerne og indskrumpet cytoplasma (pilespids) i colorektale cancervæv men TUNEL-farvning er ikke positiv i normal colorektal mucosa (× 400). TUNEL, terminal deoxynucleotidyltransferase (TdT) -medieret deoxyuridintriphosphat (dUTP) nick ende mærkning. T; colorektal cancer væv, N; parret normal kolorektal slimhinde.

Indeks

alt (n = 161)

Livin udtryk

p-værdi

Negativ (n = 86)

Positiv (n = 75)

KI (Mean ± SD) 52,8 ± 15.151.1 ± 14.754.3 ± 15.60.504AI (Mean ± SD) 8,8 ± 5.611.3 ± 6.46.4 ± 3.70.009Table 1 . Korrelationer mellem Livin udtryk og tumorcelleproliferation og apoptose i tarmkræft

KI, Ki-67 mærkning indeks.; AI, apoptotisk indeks;