PLoS ONE: Rac1 Aktivering Drevet af 14-3-3ζ Dimerisering Fremmer prostatakræft Cell-Matrix Interactions, motilitet og transendotelial Migration

Abstrakt

14-3-3 proteiner allestedsnærværende udtrykte dimere adapter proteiner, der er opstået som vigtige mediatorer af mange celle signalveje i flere celletyper. Dens virkninger er primært medieret af binding til selektive phosphoserin /threonin-proteiner. Betydningen af ​​14-3-3-proteiner i cancer er først begyndt at blive synlige og dens præcise rolle i cancer progression samt de mekanismer, som 14-3-3-proteiner medierer kræft celle funktion forbliver ukendte. Mens protein 14-3-3σ er bredt accepteret som en tumor suppressor, har 14-3-3ζ, β og y-isoformer vist sig at have tumorfremmende effekter. Trods betydningen af ​​14-3-3 familie i mediere forskellige celle processer, den nøjagtige rolle og mekanisme af 14-3-3ζ forbliver uudforsket. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi rollen af ​​protein 14-3-3ζ i prostatacancer cellemotilitet og transendothelial migration ved anvendelse biokemiske, molekylærbiologi og elektrisk celle-substrat-impedans sensing metoder samt cellebaserede funktionelle assays. Vores undersøgelse viste, at udtryk med vildtypeproteinet betydeligt 14-3-3ζ forøget Rac aktivitet i PC3 celler. I modsætning hertil ekspression af dimer-resistent mutant af protein 14-3-3ζ (DM-14-3-3) inhiberede Rac aktivitet og tilhørende phosphorylering af p21 aktiveret kinase-1 og 2. Expression med vildtype-14-3-3ζ eller konstitutivt aktiv Rac1 forbedret ekstracellulær matrix anerkendelse, lamellipodia dannelse, celle migration og trans-endotel migration ved PC3 celler. I modsætning hertil udtryk med DM 14-3-3ζ eller DN-Rac1 i PC3 celler hæmmes disse cellefunktioner betydeligt. Vores resultater viser for første gang, at 14-3-3ζ øger prostatakræft celle-matrix interaktioner, motilitet og transendothelial migration

in vitro

via aktivering af Rac1-GTPase og er et vigtigt mål for terapeutiske interventioner for prostatakræft .

Henvisning: Goc A, Abdalla M, Al-Azayzih A, Somanath PR (2012) Rac1 Aktivering Drevet af 14-3-3ζ Dimerisering Fremmer Prostata Cancer Cell-Matrix Interactions, motilitet og transendothelial Migration. PLoS ONE 7 (7): e40594. doi: 10,1371 /journal.pone.0040594

Redaktør: Ming Tat Ling, Queensland University of Technology, Australien

Modtaget: 14. marts 2012; Accepteret: 11 Juni 2012; Udgivet: 13 Jul 2012

Copyright: © 2012 Goc et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Midler var fra University of Georgia Research Foundation, Wilson Apotek Foundation og UGA College of Pharmacy gennem murene tilskud til PRS, og delvist af National Institutes of Health tilskud (R01HL103952) og American Heart Association Scientist Development Grant (0830326N) til PRS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

De syv medlemmer af 14-3-3 familie (også kendt som YWHA proteiner) vides at interagere med mere end 100 centrale signalmolekyler i normale celler og cancerceller og regulere en bred vifte af cellulære processer [1] , [2]. Generelt 14-3-3 isoformer binder til to phosphoryleringsafhængige højaffinitetsbinding motiver som RSXpSXP og RXXXpSXP [3], [4]. Da protein interaktioner med denne adapter protein er afhængige af det samme sted på protein 14-3-3 [5], hvorfor 14-3-3 kræves i så mange forskellige isoformer er en lang stående spørgsmål. Samtlige 14-3-3 isoformer danner homodimere

in vivo

, en forklaring på kravet om forskellige 14-3-3 proteiner er at danne særskilte heterodimerer med unikke motiver til specifikke ligander anerkendelse. Men mens flere 14-3-3 isoformer kan danne heterodimerer,

in vitro

, en kombination af 14-3-3 ε og ζ er den eneste kendte heterodimer, der dannes

in vivo

[ ,,,0],6].

Mens globale nedregulering af 14-3-3 udtryk medierer tumor undertrykkelse, udtryk for 14-3-3 proteiner signifikant forhøjet i flere kræftformer [7], [8], [9] [10], [11], [12]. Mens overekspression af 14-3-3 β og γ i NIH 3T3 celler er vist at inducere oncogen transformation [10], [13], den β, γ, ε, ζ og θ 14-3-3 genekspressioner har vist sig at være forhøjet i lungekræft alene [14]. Men af ​​alle de 14-3-3 gener, 14-3-3 σ og ζ er mest direkte forbundet med kræft. Protein 14-3-3 σ og f-fremkalde modsatte virkninger i mammae epitelceller [15]. Protein 14-3-3σ menes at fungere som en tumorsuppressor via induktion af en G2-M cellecyklusstandsning i de fleste cancere [16]. Dets ekspression nedreguleres i invasive urogenitale cancere såsom blære [17], prostata [18], og ovariet [19]. I modsætning hertil forøget ekspression af 14-3-3ζ, har en Drosophila homolog af ‘Leonardo’, været knyttet til forbedret tumorigenese og forventes som prognostisk markør og terapeutisk mål for kræft [20].

En korrelation mellem forøget ekspression af 14-3-3ζ og forbedret celleoverlevelse er blevet rapporteret i prostatacancerceller [21]. To uafhængige undersøgelser har også indikeret en sammenhæng mellem forhøjet udtryk for 14-3-3ζ og forekomsten af ​​prostatakræft hos mennesker [22], [23]. Den præcise rolle af 14-3-3s i prostatakræft progression er stort set ukendt. Selvom effekten af ​​14-3-3s om spredning, cellecyklus og overlevelsen af ​​kræftceller bredt studeres, uanset om 14-3-3s er nødvendige for migration af eventuelle kræft celletyper og mekanismerne, der fører til 14-3 -3-medieret retningsbestemt vandring af kræftceller er endnu ikke fastslået. Vore tidligere studier i NIH 3T3-celler har vist, at proteinet 14-3-3 over-ekspression resulterer i aktiveringen af ​​Rac1 og p21 aktiveret kinase (Pak) signalvejen mediere celle migration [24]. I den aktuelle undersøgelse, undersøgte vi den særlige rolle 14-3-3ζ og dens dimerisering i reguleringen af ​​prostatakræft (PC3) celle-matrix interaktioner, lamellipodia dannelse, motilitet på forskellige ekstracellulære matrix (ECM) proteiner og transendothelial migration via aktivering af Rac1. Vores resultater viser, at hæmning af 14-3-3ζ kan være en potentiel terapeutisk strategi i prostatakræft.

Resultater

Protein 14-3-3ζ Expression Øger med oncogen transformation i Prostata Cancer Cells

Tidligere undersøgelser har etableret en sammenhæng mellem forhøjet udtryk for 14-3-3ζ og øget forekomst af prostatakræft hos mennesker [22], [23]. Derfor søgte vi at sammenligne ekspressionsniveauerne af 14-3-3ζ blandt forskellige murine (TRAMP) og prostatakræft-cellelinier. Vores data viser, at selv 14-3-3ζ udtrykkes i ikke-tumorgene (TR-C2D) TRAMP (Transgene Adenokarcinom i Mouse Prostate) cellelinie, dets ekspression er betydeligt højere i tumorgene (TR-C2) og metastatisk (TR C2N) TRAMP cellelinjer (

s

0,05) (Figur 1A og B). Imidlertid blev en signifikant forskel i 14-3-3ζ udtryk mellem ikke-metastatisk LNCaP og metastatisk LNCaP c4-2 eller PC3 celler ikke observeret.

ζ udtryk stiger med onkogen transformation i prostata kræftceller. (A) Murine TRAMP (TR-C2D, TR-C2 og TR-C2N), humane hormon lydhør LNCaP samt hormon ufølsomme LNCaP c4-2 og PC3 prostatakræft cellelysater blev udsat for Western blot sammenlignende analyse for 14-3- 3ζ ekspression. (B) Kvantificering af ovennævnte data efter band densitometrianalyse viser forøget ekspression af 14-3-3ζ i prostatacancerceller sammenlignet med ikke-tumorigene murine TRC2D celler. (C-E) PC3-celler blev transficeret med kontrolvektor, WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ og blev underkastet levedygtighed (trypanblå assay), proliferation (MTT assay) og kolonidannelse assayet hhv. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 3).

Det er tidligere blevet vist, at 14-3-3ζ dimerisering er nødvendig for dets aktivitet i celler [26]. Derfor Derefter undersøgte vi, om ekspression og /eller dimerisering af protein 14-3-3ζ kan mediere prostatacancercellelinjer funktioner såsom proliferation, levedygtighed og kolonidannelse. Vores undersøgelse viste, at overekspression af vildtype protein 14-3-3ζ (WT-14-3-3ζ) i PC3 celler væsentligt forbedret proliferation (

s

0,001), levedygtighed (

p

0,01) og kolonidannelse (

s

0,05), sammenlignet med dem, der udtrykker styrevektor kun (Figur 1C-E). I modsætning hertil celler udtrykker dimer-resistent mutant 14-3-3ζ protein (DM-14-3-3ζ), som forhindrer dens dimerisering i PC3 * celler resulterede i signifikant reduktion i proliferation (

s

0,01 ), levedygtighed (

s

0,01) og kolonidannelse (

s

0,01), sammenlignet med de PC3 celler, der udtrykker kontrol vektor (Figur 1C-E). Samlet set indikerer disse resultater, at udtryk og dimerisering af 14-3-3ζ er nødvendig for prostatakræft celle funktion

in vitro

.

Protein 14-3-3ζ Dimerisering Drives Rac1 GTPase aktivitet i PC3 Celler

Vores tidligere studie i NIH3T3 fibroblaster viste, at protein 14-3-3 er nødvendig for aktivering af Rac1 og p21 aktiverede kinaser 1 og 2 (Pak 1/2) [24]. I den aktuelle undersøgelse, vi stilling til, om overekspression og dimerisering af protein 14-3-3ζ fører til Rac1-medieret aktivering af Pak1 /2 i prostata kræftceller. Vores undersøgelse viste, at overekspression af PC3 celler med WT-14-3-3ζ væsentligt forbedret Rac1 aktivering som det fremgår af de øgede niveauer af GTP-bundne Rac1, sammenlignet med kontrol vektor udtrykkende celler (

s

0,01) (figur 2A og B). Imidlertid ekspression med DM-14-3-3ζ i PC3-celler markant inhiberede GTP-bundne Rac1 niveauer sammenlignet med kontrol (

s Restaurant 0,05) (figur 2A og B). Så vi afgøres, om 14-3-3ζ udtryk og dimerisering er nødvendig for dens interaktion med Rac1. Vores data viste, at mens immunpræcipitering af 14-3-3ζ fra PC3 celler, der udtrykker WT-14-3-3ζ co-udfældet Rac1 (

s

0,01), denne interaktion blev afskaffet ved udtryk for PC3 celler med DM-14-3-3ζ (figur 2C og D). Samspil mellem 14-3-3ζ og Rac1 i PC3 celler blev også opnået med EGF (

s

0,05). (Figur 2E og F)

ζ udtryk og dimerisering fører til aktivering af Rac1 i prostata kræftceller. (A) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ ekspressionsplasmider sammen med kontrolvektor blev transficeret til PC3-celler og cellelysater blev underkastet Rac1 aktivitetsassay under anvendelse Pak-PBD-glutathion sepharoseperler. (B) Kvantificering af ovennævnte data ved band densitometrianalyse viser en positiv sammenhæng mellem 14-3-3ζ udtryk, dimerisering og Rac1 aktivitet. Barer skildrer Rac1 aktivitet målt ved de GTP bundet Rac1 niveauer. (C) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ ekspressionsplasmider sammen med kontrolvektor blev transficeret til PC3-celler og cellelysater blev underkastet immunpræcipitation af 14-3-3ζ og co-udfældning af Rac1 blev analyseret . (D) Kvantificering af ovennævnte data ved band densitometrianalyse. Barer skildrer Rac1 aktivitet målt ved de GTP bundet Rac1 niveauer. (E) serumudsultet PC3-celler blev behandlet med 50 pM af EGF i 12 timer og lysater blev underkastet immunpræcipitation af 14-3-3ζ og co-udfældning af Rac1 blev analyseret. (F) Kvantificering af ovennævnte data ved band densitometrianalyse. Barer skildrer Rac1 aktivitet målt ved de GTP bundet Rac1 niveauer. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 3).

Derefter analyserede vi, om 14-3-3ζ-Rac1 interaktion kan resultere i moduleringen af ​​Rac1-GTPase-aktivitet. I vores undersøgelse, overekspression af konstitutivt aktiv Rac1 resulteret i øget migration af PC3 celler på forskellige matrixproteiner. Tilsvarende ekspression med WT-14-3-3ζ resulterede også i øget phosphorylering af Pak1 /2 (

s Restaurant 0,001) (figur 3A og B). Da basale niveauer af phosphoryleret Pak1 /2 i styrevektor transfekterede PC3 celler var for lav, over-udtryk med en DN-Rac1 eller DM-14-3-3ζ viste ingen væsentlige ændringer i Pak1 /2 phosphorylering (figur 3A og B ). Mens co-ekspression af DM-14-3-3ζ med CA-Rac1 i PC3-celler viste signifikant stigning i Pak1 /2 phosphorylering sammenlignet med kontrol vektor-udtrykkende celler (

s Restaurant 0,001), co-ekspression af DN-Rac1 med WT-14-3-3ζ væsentligt forringet Pak1 /2 phosphorylering (

s

0,001). Taget sammen indikerer disse resultater, at aktivering af Rac1 er nedstrøms for 14-3-3ζ dimerisering.

(A) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) og DN-Rac1 (N

17) ekspressionsplasmider og vektor alene eller i kombinationer, blev transficeret til PC3-celler og cellelysater blev underkastet Western-analyse af phosphoryleret Pak1. (B) Kvantificering af ovennævnte data ved band densitometrianalyse. Bars skildrer Pak1 aktivitet som målt ved niveauerne af phosphorylering. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 3).

Samspil mellem Protein 14-3-3ζ og Rac1 Forbedrer Matrix anerkendelse af PC3 Cells

Siden RAC-GTPaser er mester regulatorer af cytoskeletal remodeling som reaktion på signaler fra den ekstra-cellulære mikromiljø, vi undersøgt, om graduering af protein 14-3-3ζ-Rac1 signalering i prostata cancer celler vil have nogen effekt på deres evne til at genkende og binde sig til ECM proteiner såsom fibronektin (FN), vitronectin (VN), collagen i (COLL-i) og laminin (LN ), som er rigeligt udtrykt i forskellige væv, der huser prostatacancerceller. Vores undersøgelse viste, at mens udtryk med WT-14-3-3ζ og CA-Rac1 forbedret PC3 celler vedhæftning til disse ECM-proteiner, udtryk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 væsentligt forringet denne proces (figur 4A-D) . Mens svækket adhæsion af DM-14-3-3ζ ekspression blev reddet ved co-ekspression med CA-Rac1, co-ekspression af WT-14-3-3ζ i DN-Rac1 udtrykkende PC3-celler ikke redde forringet celleadhæsion (figur 4A-D), hvilket indikerer, at 14-3-3ζ virker opstrøms for Rac1 aktivering i reguleringen af ​​PC3 celle-matrix interaktioner.

(AD) WT-14-3-3ζ, DM-14-3- 3ζ, CA-Rac1 (L

61) og DN-Rac1 (N

17) ekspressionsplasmider og vektor alene eller i kombinationer, blev transficeret til PC3-celler og serum udsultede celler blev underkastet celleadhæsionsassay på ekstracellulær matrixproteiner såsom fibronectin (FN), collagen type i (COLL-1), laminin (LN) og vitronectin (VN), henholdsvis med en celletæthed på 1 x 10

4 celler /brønd i nærvær af 10 % FBS. Bars afbilder antal PC3 celler adhæreret til specifikke ECM-proteiner. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 3 af firdobbelte).

Protein 14-3-3ζ-Rac1 Signaling Regulerer lamellipodia Formation i PC3 celler

Vores yderligere analyse ved hjælp phalloidin farvning af PC3 celler, der specifikt pletter nyligt polymeriseret aktincytoskelettet viste, at over-udtryk med WT-14- 3-3ζ eller CA-Rac1 resulterede i forøget lamellipodia dannelse i nyligt sprede celler sammenlignet med kontrol vektor, der udtrykker ubehandlede PC3-celler i nærvær af 10% FBS (figur 5A). I modsætning hertil ekspression med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 resulterede i reduceret lamellipodia dannelse sammenlignet med kontrolceller (figur 5A). Lignende effekter blev også observeret i migrerende PC3 analyserede celler til phalloidin farvning. PC3 celler, der udtrykker WT-14-3-3 eller CA-Rac1exhibited forbedret lamellipodia dannelse sammenlignet med vektor-udtrykkende celler (figur 5B). Tilsammen indikerer disse resultater, at 14-3-3ζ-Rac1 foreningen er involveret i lamellipodia dannelse i prostata kræftceller.

ζ-Rac1 samarbejdet regulerer lamellipodia dannelse i PC3 celler. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) og DN-Rac1 (N

17) ekspressionsplasmider og vektor, alene eller i kombinationer, blev transficeret til PC3-celler, udpladet på cellekultur kamre i nærvær af 10% FBS og fastsat til 40 minutter (A) eller 16 timer (B) efter udpladning. Paraformaldehyd faste celler blev farvet med Alexa Fluor (rød) mærket phalloidin at detektere nyligt polymeriseret aktincytoskelettet og lamellipodia.

Samarbejde mellem Protein 14-3-3ζ og Rac1 Forbedrer EGF-stimuleret PC3 Cell Directional Migration og transendotelial migration

Dernæst vi undersøgt, om 14-3-3ζ spiller en rolle i prostatakræft celle migration. For at gøre dette, vi transficeret androgen-responsive LNCaP celler og androgen-ufølsom PC3 celler med WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ og udsat dem for migration assay i 24 brøndsplader i nærvær og fravær af EGF. Vores resultater viste, at mens ekspression af både LNCaP og PC3-celler med WT-14-3-3ζ signifikant forøget cellemigrering i forhold til vektorkontrol udtrykkende celler (

s Restaurant 0,05) i nærvær af EGF, ekspression med DM-14-3-3ζ resulterede i nedsat cellevandring efter 24 timer (

s

0,01 for PC3 celler og

s

0,05 for LNCaP celler) (figur 6A og C) . Selvom der blev observeret en lignende tendens i fravær af EGF, data var ikke statistisk signifikant (figur 6B og D).

LNCaP og PC3 celle migration. (A-D) WT-14-3-3ζ og DM-14-3-3ζ ekspressionsplasmider eller kontrol vektor blev transficeret til LNCaP og PC3-celler. Celler blev derefter underkastet cellemigrationsassay gennem en ridse fremsat i monolag af celler. Barer skildre migration af PC3 celler som målt ved dets scratch opsving. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 4 i firdobbelte).

Næste vi bestemmes, hvis 14-3-3ζ-Rac1 samarbejde er nødvendigt for transendothelial migration samt retningsbestemte migration af PC3 celler som respons til EGF på forskellige ECM-proteiner, der er rigelige i væv huser prostata kræftceller på de forskellige stadier af tumorvækst, invasion, transendothelial migration og metastase til væv, såsom knogle. Vores analyse viste, at mens udtryk med WT-14-3-3ζ og CA-Rac1 væsentligt forbedret PC3 cellevandring på ECM-proteiner, såsom FN, VN, LN, knoglesialoprotein (BSP, Osteopontin) og SPARC (osteonectin), udtryk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 væsentligt forringet retningsbestemt vandring af PC3-celler (Figur 7A-F). Tilsvarende mens udtryk med WT-14-3-3ζ eller CA-Rac1 væsentligt forbedret transendotheliale migrering af PC3 celler, udtryk med DM-14-3-3ζ eller DN-Rac1 væsentligt forringet transendotele migration ved PC3 celler (figur 8A-C) . Ud fra følgende betragtninger forringet PC3 celle migration ved DM-14-3-3ζ udtryk blev reddet ved co-udtryk med CA-Rac1, nedsat motilitet og transendotelial migration af DN-Rac1 udtrykker PC3 celler ikke blev reddet af co-ekspression med WT-14-3 -3ζ (figur 8A-C). Kollektivt, vores resultater viser rolle 14-3-3ζ i mediere Rac1 aktivering nødvendig for PC3 celle migration og transendotelial migration.

ζ-medieret PC3 celle migration. (AF) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) og DN-Rac1 (N

17) ekspressionsplasmider og vektor, alene eller i kombination, blev transficeret til PC3-celler, og celler blev underkastet cellemigrationsassay på plast eller ekstracellulære matrix-proteiner, såsom fibronectin (FN), laminin (LN) og vitronectin (VN), osteonectin (SPARC) og Bone sialoprotein (BSP, Osteopontin) henholdsvis . Barer skildre migration af PC3 celler på forskellige ECM-proteiner målt ved dets scratch opsving. (*

s

0,001; Δ

s

0,01; #

s

0,05; n = 4 i firdobbelte).

ζ-medieret Rac1 aktivering regulerer PC3 celle transendothelial migration. (AB) WT-14-3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 (L

61) og DN-Rac1 (N

17) ekspressionsplasmider, vektorkontrol samt en kombination af DN-Rac1 og WT-14-3-3ζ, blev transficeret til PC3 celler og celler blev udsat for transendothelial migration assay

in vitro

hjælp ECIS. (C) Analyse af transendotelial migrering af PC3-celler ved 1,5 timer efter introduktion af celler til endotel monolag i ECIS-chips demonstrerer den rolle, 14-3-3ζ dimerisering på aktivering af Rac1 ved mediering transendothelial migrering af PC3-celler (Δ

p

0,01; #

s

0,05; n = 5)

diskussion

Den primære observation fra vores aktuelle undersøgelse er, at. udtryk med protein 14-3-3ζ i PC3 celler resulterer i forbedrede celle-ECM-interaktioner, lamellipodia dannelse, celle migration og transendotelial migration via aktivering af Rac1-GTPase. Vi har tidligere rapporteret, at overekspression af protein 14-3-3β resultater i forbedret Rac1 og Pak aktivitet i NIH 3T3-celler, hvilket resulterer i øget integrin aktivering, lamellipodia dannelse, celle migration og ekstracellulær matrix samling [24]. Vi har også vist, at aktivering af Rac1-Pak1 /2-vejen er involveret i oncogen transformation af Rat-1a-celler [25], hvilket indebærer, at lignende mekanisme ved 14-3-3ζ i cancerceller kan forøge tumorvækst, transendothelial migration og metastase. I den aktuelle undersøgelse, observerede vi, at ekspression med WT-14-3-3ζ i PC3-celler resulterede i forøget adhæsion og migrering af forskellige ECM-proteiner, der er rigelige i væv, som skjuler prostatacancerceller under flere faser af tumorcelleinvasion, trans-kar migration og knoglemetastaser. Men over-ekspression af en mutant af 14-3-3ζ (DM-14-3-3ζ), som tidligere er blevet vist at forhindre dets dimerisering [26], i PC3-celler ikke udviste disse virkninger, i stedet resulterede i nedsat celle adhæsion og migrering sammenlignet med kontrol PC3-celler. Mens WT-14-3-3ζ ekspression resulterede i forøget lamellipodia dannelse og øget aktivitet af Rac1-GTPase som påvist ved den forøgede phosphorylering af Pak1 /2, ekspression med DM-14-3-3ζ imod disse virkninger. Endvidere vores data indikerede, at dimerisering af protein 14-3-3ζ er nødvendig for aktiveringen af ​​Rac1, som igen regulerer motilitet og transendothelial migrering af prostatacancerceller. Alt i alt, vores undersøgelse viser en direkte sammenhæng mellem protein 14-3-3ζ og Rac1 i reguleringen af ​​ECM interaktion med PC3 celler, deres motilitet og transendothelial migration, og at forebyggelse dimerisering af 14-3-3ζ kan hæmme disse effekter.

Selvom rolle 14-3-3 proteiner i celle overlevelse og formering er blevet grundigt undersøgt, specifikke rolle 14-3-3s i reguleringen af ​​celle-matrix interaktioner, motilitet og transendothelial invasion og de molekylære mekanismer er ikke klart forstået regulere processen. Cell-matrix interaktioner og migration er de vigtigste egenskaber af de metastatiske cancerceller, og det første skridt i denne proces involverer cytoskeletal remodeling, primært styret af små Rho GTPaser [27] .To uafhængige undersøgelser identificeret protein kinase D (PKD) som kandidat protein er forbundet med F-actin dannelse og interagerer med 14-3-3 i reguleringen af ​​cytoskeletal samling [28], [29]. Men PKD var involveret i en negativ regulering af aktiv cytoskeletal remodeling i forkant med overekspression af konstitutivt aktiv PKD resulterer i forringet cellevandring via aktivering af RhoA. Andre mekanismer, som har været impliceret i 14-3-3-medieret cellemigration omfatter dens involvering i inaktivering af cortactin, et actinbindende protein, via PKD-medieret phosphorylering ved Ser298, hvilket fører til inhibering af cellemigrering [30].

Undersøgelser i det sidste årti har vist, hvor vigtigt det 14-3-3 proteiner i den positive regulering af celle migration involverer Rac1-GTPaser. Indledende bevis på 14-3-3 og Rac1 Foreningen blev først rapporteret i en CHO celle model [31]. Vores laboratorium har tidligere vist, at 14-3-3β aktiverer Rac1 og Pak1 signalering i reguleringen af ​​NIH 3T3 celle-matrix interaktion, migration og ekstracellulær matrix samling via affinitet modulerende af integrin α

5β

1 [24]. Vi viste også, at ekspression med 14-3-3β resulterer i translokationen af ​​Rac1 til membranen ruffles forbedrer Pak1 aktivitet og lamellipodia dannelse i NIH3T3. Efter denne, en nyere undersøgelse viser, at 14-3-3 styrer celle mekanik og cytokinese i

Dictyostelium

via koordinering af Rac1 aktivitet, myosin II og mikrotubuli [32]. Men der er ingen andre rapporter om sammenslutning af 14-3-3 og Rac1-GTPaser i reguleringen af ​​celle migration af eventuelle kræftceller. I den aktuelle undersøgelse, vores resultater viser, at overekspression af WT-14-3-3ζ resultater i lamellipodia dannelse i at sprede og migrere PC3 celler ligner konstitutivt aktiv Rac1 udtrykkende celler. I modsætning hertil DM-14-3-3ζ inhiberede lamelipodia formation. Vores resultater fra Rac1 aktivitet assay og phosphorylering af Pak1 /2, en downstream substrat af RAC-GTPaser, begge viste, at 14-3-3ζ aktiverer Rac1. Det forhold, at co-ekspression med DM-14-3-3ζ ikke inhiberede phosphoryleringen af ​​Pak1 /2 medieret af ekspression med CA-Rac1 indikerer, at 14-3-3ζ dimerisering er opstrøms for Rac1 aktivering. Selv om den nøjagtige mekanisme, hvormed 14-3-3ζ regulerer Rac1 aktivitet i prostatacancerceller fremgår ikke af vores resultater, ville en mulig mekanisme være interaktionen af ​​14-3-3ζ med en af ​​sine guaninnukleotid exchange faktorer (GEF) og levering til Rac1 resulterer i aktivering.

Blandt 14-3-3 isoformer, øget udtryk for 14-3-3ζ har været impliceret at udvikle tumor resistens over for kemoterapi narkotika, herunder prostatakræft [21], [33]. I modsætning hertil nedregulering af 14-3-3 udtryk sensibiliserer kræftceller til kemoterapeutiske stoffer [2], [20], herunder prostatakræft [21], implicerer det terapeutiske potentiale af 14-3-3ζ for kræftbehandling. Nylige fremskridt i SiRNA baseret knockdown af 14-3-3-proteiner samt peptidinhibitorer forhindrer dimerisering af 14-3-3 såsom R18 (difopein, en dimer af R18) [34] eller småmolekylære forbindelser såsom FOBISIN 101 [35 ] viser løftet om at udvikle anti-14-3-3 terapi for kræft.

som konklusion, vi identificerer 14-3-3ζ og Rac1 som nye partnere i vejen regulerer prostatakræft celle-matrix interaktioner, motilitet som reaktion på invasive og metastatiske stimuli samt til intravasation af prostatacancerceller. Vores resultater viser, at 14-3-3 er et potentielt mål for terapeutiske indgreb i prostatakræft.

Metoder

Reagenser, cellelinjer og antistoffer

Menneskelig PC3, LNCaP og LNCaP c4-2 celler (ATCC, Manassas, VA) blev anvendt og opretholdt i DMEM-High glucose (HyClone, Thermo Scientific, Logan, UT) med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin, og 100 pg /ml streptomycin i en CO 5%

2 atmosfære ved 37 ° C. Murine TRAMP (TR-C2D, TR-C2 og TR-C2N) celler blev begavet af Dr. Barabara Foster, Baylor College of Medicine, TX. Primære antistoffer mod phospho-Pak1 /2 Ser144 /142, 14-3-3ζ og pan-protein-14-3-3 blev indkøbt fra Cell Signaling (Boston, MA). Anti-Rac1 antistoffer, fibronectin og laminin blev opnået fra BD Biosciences (Franklin Lakes, NJ). Primære antistoffer mod β-actin blev indkøbt fra Sigma, St. Louis, MO. Alle sekundære antistoffer blev opnået fra BioRad (Hercules, CA). Alexa Fluor555-mærket phalloidin blev købt fra Invitrogen (Carlsbad, CA). Osteopontin (knoglesialoprotein), osteonectin (SPARC) og vitronectin blev købt fra R 14-3-3 E5K, L12AE til Q12QR, Y82Q, K85N, og E87Q), CA -Rac1 (Rac1-L

61), og DN-Rac1 (Rac1-N

17) konstruktioner, henholdsvis eller i kombinationer af WT-14-3-3ζ med DN-Rac1 (Rac1-N

17) konstruktioner og DM-14-3-3ζ med CA-Rac1 (Rac1-L

61), under anvendelse af Lipofectamine 2000 Invitrogen (Carlsbad, CA) transfektionsreagens i henhold til fabrikantens protokol. Protein 14-3-3 konstruktioner, der oprindeligt genereret af Joseph Avruch lab blev Massachusetts General Hospital, Boston fås fra Addgene, Cambridge, MA. Kontrolceller blev transient transficeret med tom vektor pBabe-puromycin. Ca. 70-80% transfektionseffektivitet blev opnået.

Rac1 Activation Assay

Rac1 aktivitet blev målt ved anvendelse af en Rac aktivitet assaykit fra Cytoskeleton (Denver, CO) i overensstemmelse med producentens protokol. Kort beskrevet PBD-domænet af PAK fusioneret til glutathion

S

transferase (GST) og konjugeret med glutathion-Sepharose 4B-perler blev blandet med 1 mg af det totale proteinindhold i lysatet fra PC3-celler transient transficeret med WT-14- 3-3ζ, DM-14-3-3ζ, CA-Rac1 eller DN-Rac1 plasmider eller i kombinationer af CA-14-3-3ζ med DN-Rac1 og DM-14-3-3ζ med CA-Rac1 efterfulgt ved inkubation ved 4 ° C i 1 time. Perler blev opsamlet ved centrifugering og blev vasket tre gange med vaskebuffer med 1X Komplette proteasehæmmere (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) og to gange med 1X PBS. Proteiner blev elueret ved kogning perler i 2X Laemmli prøvebuffer (BioRad, Hercules, CA) i 5 minutter, adskilt på en 12% SDS-polyacrylamidgel og blottet med Rac1 antistoffer.

trypanblåt Levedygtighed Assessment

Celler blev dyrket til konfluens i DMEM med 10% FBS. Cellerne blev udpladet i 96-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

3 celler /100 pi i DMEM og fik lov at adhærere natten over. Herefter blev cellerne transficeret med respektive plasmider og dyrket i 48 timer. Celler blev derefter dyrket i yderligere 24 timer i serumfrit betingelser. Celler blev derefter høstet ved trypsinisering, farvet med en trypanblåt-opløsning (0,04% w /v, Invitrogen, Carlsbad, CA), og talt ved anvendelse af hæmocytometer. Totale celler og trypanblåt-farvet (dvs. ikke-levedygtige) celler taltes, og procentdelen af ​​levedygtige celler blev beregnet.

celleproliferationsassay

Proliferation af PC3-cellelinjer blev bestemt ved anvendelse af ikke-radioaktivt BrdU-baserede celleproliferationsassay (Roche Applied Science) ifølge producentens protokol. Kort fortalt blev transficerede PC3-celler udpladet i 96-brønds fladbundede plader ved en densitet på 5 x 10

3 celler pr 100 pi, og fik lov at vokse i 48 timer. Celler blev derefter dyrket i yderligere 24 timer i serumfrit betingelser. PC3 Celler blev derefter underkastet en 5-brom-2-deoxyuridin assay under anvendelse af BrdU mærkning og Detection Kit III (Roche Applied Science) ifølge producentens protokol. BrdU-inkorporering i DNA blev bestemt ved måling af absorbansen ved både 450 og 690 nm på en ELISA-pladelæser. Dataene er præsenteret som gennemsnit ± S.D.

kolonidannelse Assay

Kolonidannelse assay blev udført under anvendelse af standard protokol [36].