PLoS ONE: myeloid Suppressor cellereduktion øger antitumoraktivitet i Lung Cancer

Abstrakt

Baggrund

myeloid afledte suppressorceller (MDSC) er vigtige regulatorer af immunreaktioner. Vi evaluerede mekanistisk rolle MDSC udtømning på antigen-præsenterende celle (APC), NK, T-celle aktiviteter og terapeutiske vaccination reaktioner i murine modeller af lungekræft.

vigtigste resultater

Individuel antistof medieret udtømning af MDSC (anti-Gr1 eller anti-Ly6G) forøgede antitumoraktivitet over lungekræft. I sammenligning med kontroller, MDSC udtømning forbedret APC aktivitet og øget hyppighed og aktivitet af NK og T-celle-effektorer i tumoren. Sammenlignet med kontroller, anti-Gr1 eller anti-Ly6G behandling ført til øget: (i) CD8 T-celler, (ii) NK-celler, (iii) CD8 T eller NK intracytoplasmatisk ekspression af IFNy, perforin og granzym (iv) CD3 T celler, der udtrykker aktivering markør CD107a og CXCR3, (v) reducerede CD8 T-celle-IL-10-produktion i tumorer (vi) reduceret tumor angiogene (VEGF, CXCL2, CXCL5 og Angiopoietin1 og 2. gennemløb), men forøget anti-angiogene (CXCL9 og CXCL10 ) ekspression og (vii) reduceret tumor farvning af endotel markør Meca 32. Immuncytokemi af tumorsektioner viste reduceret GR1 udtrykkende celler med øget CD3 T-celle infiltrater i anti-Gr1 eller anti-Ly6G grupper. MDSC udtømning ført til en markant hæmning i tumorvækst, forbedret tumor celle apoptose og nedsat migration af tumorer fra den primære lokalitet til lungerne sammenlignet med kontrolgruppen. Terapeutiske vaccination svar blev forbedret

in vivo

efter MDSC udtømning med 50% af de behandlede mus helt udrydde etablerede tumorer. Behandlede mus, der afviste deres primære tumorer erhvervet immunologisk hukommelse mod en sekundær tumor udfordring. De resterende 50% af musene i denne gruppe havde 20 fold reduktioner i tumor byrde sammenlignet med kontrolgruppen.

Betydningen

Vores data viser, at målrette MDSC kan forbedre antitumor immunreaktioner tyder på en bred anvendelighed af kombineret immune tilgange mod kræft. Denne mangesidede fremgangsmåde kan vise sig nyttig mod tumorer, hvor MDSC spiller en rolle i tumor immune skatteunddragelse

Henvisning:. Srivastava MK, Zhu L, Harris-White M, Kar U, Huang M, Johnson MF, et al. (2012) myeloid Suppressor cellereduktion øger antitumoraktivitet i lungekræft. PLoS ONE 7 (7): e40677. doi: 10,1371 /journal.pone.0040677

Redaktør: Devanand Sarkar, Virginia Commonwealth University, USA

Modtaget: Marts 16, 2012; Accepteret: 12 juni 2012; Udgivet: den 16. juli, 2012 |

Dette er en åben-adgang artiklen, fri for alle ophavsrettigheder, og kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål. Værket gøres tilgængeligt under Creative Commons CC0 public domain dedikation

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af University of California Los Angeles Lung Cancer Program, Department of Veterans Affairs Medical Research fonde, National Institutes of Health ( NIH) Tilskud (RO1 CA95686, RO1 CA126944 og P50 CA90388), National center for Fremme Translationelle Sciences, Grant UL1TR000124, og tobaksrelaterede sygdomme Program Award Program for University of California (15RT-0207 og 20FT0082). Indholdet er alene forfatternes ansvar og repræsenterer ikke nødvendigvis de officielle synspunkter NIH. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Da denne undersøgelse blev udført RS var ansat i University of Virginia, Charlottesville. RS er nu ansat på Norvartis Institutes of Biomedical Research. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Lungekræft er stadig en skræmmende helbredsproblem med mere end 1,1 millioner dødsfald tilskrives lungekræft verdensplan årligt [1]. Med de eksisterende terapeutiske indsats overlevelsen for patienter med lungecancer langsigtet er fortsat lav, og dermed er behov for nye terapeutiske strategier. Selvom cancerimmunterapi tilbyder en attraktiv terapeutisk mulighed, aktivering af immunsystemet alene ikke tilstrækkelig til antitumoraktivitet. Vi forventer, at kombinerede terapier, der er målrettet veje for immunaktivering og mekanismer i immunsuppression vil være nødvendigt for at bekæmpe lungekræft. Tumormikromiljøet består af tumorceller, stroma, blodkar, immune infiltrater og ekstracellulære matrix. Genetiske ændringer i onkogener og tumorsuppressorgener eller epigenetiske ændringer i tumor, som modulerer tumorvækst og invasion i det omgivende væv orkestrere persistens af inflammatoriske infiltrater. Disse cellulære infiltrater modulere tumor udvikling og progression. Tumoren infiltrater varierer efter størrelse og sammensætning i forskellige tumortyper og på forskellige stadier af tumor udvikling. Tumor programmer de cellulære infiltrater at opretholde en dysreguleret betændelse, der er hypo reagerer på tumoren. Bidrager til den cellulære inflammatoriske infiltrater er myeloide afledte suppressorceller (MDSC), som negativt modulere immunreaktioner og fremme tumorprogression og metastaser [2].

MDSC er en heterogen population af umodne myeloide celler, der består af myeloide stamceller og forstadier af makrofager, granulocytter og dendritiske celle (DC) [3]. Hos mus er MDSC identificeret ved antistoffer, der registrerer celleoverfladeekspression af Gr1 og CD11b. Stigninger i antallet af MDSC fremkalde stærk naturlig undertrykkende aktivitet hos kræftpatienter [4], [5] eller tumor-bærende mus [4], [6], [7]. Det er blevet påvist, at Gr1 + CD11b + immunsuppressive celler er i stand til at inhibere T-celle proliferative respons induceret af alloantigener [8], CD3 ligering [9], eller forskellige mitogener [10], [11], og kan også hæmme IL 2 udnyttelse [12] samt NK celle aktivitet [5], [13]. Disse undersøgelser indikerer, at progressiv tumorvækst er forbundet med nedregulering af T-celle responser og at MDSC er involveret i negative immunregulatoriske mekanismer. I murine tumormodeller, stigninger i MDSC i tumorer, milte, knoglemarv og blod nedregulerer T-cellereaktioner [2]. På baggrund af ovenstående oplysninger, er det vigtigt at forstå konsekvenserne af MDSC udtømning i modulering af immunrespons i lungekræft.

I denne undersøgelse har vi vurderet bidrag Gr1 eller Ly6G udtrykker myelomonocytiske celler på 3LL tumor vækst og terapeutisk vaccination reaktioner i C57BL /6-mus. Vores resultater viser, at MDSC udtømning øget APC aktivitet og augmented hyppigheden og aktiviteten af ​​NK og T-celler effektorer, der førte til reduceret vækst tumor, forbedrede terapeutiske vaccination svarene og tillagt immunologisk hukommelse. Vores data giver støtte til udviklingen af ​​agenter, der er målrettet MDSC til kombineret immun baseret terapeutiske tilgange i lungekræft.

Materialer og metoder

cellelinier og reagenser

murine Lewis lungecarcinom (3LL, H-2

b, også kendt som LLC, ATCC CRL-1642) opnået fra American Type Culture Collection (Manassas, VA), DC2.4 (venlig gave fra KL Rock Dana Farber Cancer Institute, Boston , Mass.) [14] og β galactosidase reporter T-celle hybridom (B3Z), som genkender k

b klasse i molekyle og et ovalbumen (OVA) peptid blev SL8 (SIINFEKL) opnået fra N Shastri (UC Berkeley, CA) [15] blev anvendt i disse undersøgelser. 3LL-OVA-celler blev genereret ved transfektion af 3LL parentale celler med OVA-konstruktionerne opnået fra Dr. Frelinger (University of Rochester, NY). Ekspressionsvektorerne koder enten i fuld længde æg eller trunkeret OVA- (138-386) (Ova ikke-sekretorisk) blev transficeret under anvendelse af Lipofectin (GIBCO /BRL) ifølge producentens instruktioner. Selektion med det passende lægemiddel blev udført som beskrevet [16]. Stabile 3LL-OVA transfektanter blev udvalgt efter OVA ELISA af cellelysater og klonet ved begrænset fortynding i plader med 96 brønde. For forsøgene beskrevet i denne undersøgelse anvendte vi 3LL-OVA, der udtrykte den afkortede OVA- (138-386). Dyrkningsmediet (CM) indeholdt RPMI 1640 (Irvine Scientific, Santa Ana, CA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (Gemini Bioproducts, Calabasas, CA), penicillin (100 enheder /ml), streptomycin (0,1 mg /ml), og 2 mmol /l glutamin (JRH Biosciences, Lenexa, KS). Fluorescein isothiocyanate-, phycoerythrin-, allophycocyanin-, PerCP- eller APC-Cy7-konjugerede anti-muse mAb’er mod CD3 (145-2C11), CD4 (RM4-5), CD69 (H1.2F3) og CD8a (53-6,7) blev indkøbt fra BD Biosciences (San Diego, CA). Fluorescerende-konjugeret muse Abs: anti-CD49b, anti-CD11 c, anti-CD69, anti-CD44, anti-perforin, anti-granzym, anti-IL10, anti-IFNy, anti EpCam og anti-CD107a var fra eBioscience (San Diego , CA) og anti-Gr1, anti-CD45 og anti-CD11 var fra Biolegend (San Diego, CA). Neutralisering Abs til: Gr1 (RB6-8C5), Ly6G (1A8) var fra BioXCell (West Lebanon, NH) og Keratin var fra Sigma. IL-2, IFNy, IL-12, IL-10 og TNFa blev kvantificeret med cytokinspecifikke ELISA kits (eBioscience). Følsomhed: IL-2 (3 pg /ml), IFNy (3 pg /ml), IL-12 (3-5 pg /ml), IL-10 (30 pg /ml) og TNFa (8 pg /ml). Ovalbumen protein og Bradford protein kvantificering farvestof blev opnået fra Sigma (St. Louis, MO). Vævsfordøjelse buffer bestod af [0,2 mg /ml collagenase A (Boehringer Mannheim /Roche, Indianapolis, IN), DNAse 25 U /ml (Sigma) og 0,3 U /ml Dispase (Invitrogen, Carlsbad, CA) i RPMI. T-celle oprensningssøjler blev indkøbt fra R 0,05 dag 14 vs dag 7) , (** p 0,005 dag 21 vs dag 14).

1C

,

MDSC fra tumorbærende mus undertrykke DC2.4 APC aktivitet at aktivere antigenspecifikke CD8 T-celler til at udskille IL-2 (* p 0,05 med MDSC sammenlignet med uden MDSC) ,

1D

,

MDSC fra tumor, der bærer mus undertrykker anti-CD3 /CD28 stimulerede CFSE mærket T-celle proliferation.

1Di

,

repræsentant FACS CFSE intensitet grunde til T-celle proliferation (med eller uden MDSC).

1D-ii

,

Geometrisk middelværdi (GM) for T-celler CFSE intensitet repræsenteret som søjlediagrammer. (* P 0,05 med MDSC vs uden MDSC), værdier afspejler gennemsnit ± standardfejl af middelværdien (SEM), n = 8 mus per gruppe

immunologisk hukommelse

Splenocytter. fra mus, der havde afvist den sekundære tumor udfordring blev overvåget for T-celle immunhukommelse fænotype ved farvning for T-celle-hukommelse overflademarkører CD44, CD69 og intracytoplasmatisk IFNy med eller uden stimulering med OVA-protein (2,5 mg /ml natten over)

in vitro

. IFNy udskilles af spenocytes (5 x 10

6) i kultursupernatanten blev kvantificeret ved ELISA og CD4 og CD8 T-celle-IFNy eller IL-10-produktion blev kvantificeret ved farvning /flowcytometri. Splenocytter fra naive mus tjente som kontroller.

2A

,

Ændringer i tumor volumen efter anti-Gr1 eller anti-Ly6G Ab medieret MDSC udtynding.

2B

,

Ændringer i tumor vægte for MDSC forarmet og kontrolgrupper (dag 21).

2C

,

Repræsentative FACS plots og søjlediagrammer for hyppigheden af ​​CD11 + Gr1 + MDSC i tumor efter anti-Gr1 eller anti-Ly6G Ab behandling.

2D

,

Repræsentative FACS grunde til hyppigheden af ​​CD11 + Gr1 + MDSC i tumor efter anti-keratin Ab behandling.

2E

,

repræsentant APC aktivitet i tumor at aktivere CD8 antigen-specifikke T-celler til at udskille IL-2 efter anti-Gr1, anti-Ly6G, isotypekontrol Ab og fortynder behandling.

2F

,

CD107a aktivering markør udtryk på T-celler i tumor efter MDSC udtynding.

2G

,

Total renset milt T-celle cytolyse mod 3LL forældrenes tumor (E: T 10: 1, 5: 1) for den MDSC forarmet grupper og isotypekontroller. Der var ingen forskel i T-celle cytolyse af forældrenes 3LL celler mellem fortynder og isotype kontrolgruppen (data ikke vist). Der var ingen ændringer i T-celle cytolyse imod de ikke relateret B16 tumorer mellem MDSC forarmet grupper og kontroller (data ikke vist). Data i alle paneler er repræsentative for 2-3 uafhængige forsøg (data, gennemsnit ± SEM, p-værdier: i forhold til kontrol * p 0,05, ** p 0,005, n = 6 mus /gruppe

Antigen Processing and Presentation Assay

DC 2.4 eller BMA eller en enkelt cellesuspension af tumor fordøjelse (5-10 x 10

4 c /brønd) fra kontroller, anti-Gr1 eller anti-Ly6G behandlet tumorbærende mus blev co-dyrket med OVA-protein (2,5 mg /ml), og MHC klasse i begrænsede CD8 T-cellelinje B3Z (10

5 c /brønd) i CM i tredobbelte brønde i en 96-brønds plade i 24 . hrs IL-2 udskilt af de aktiverede CD8 T-celler i supernatanten blev kvantificeret ved ELISA

3A

,

H .. E i lunge sektioner til at vurdere lunge metastase efter MDSC udtømning

3C

Hyppigheden af ​​tumor infiltrater (CD3, CD4, CD8, CD11 c, F480 eller CD49b), 3

D

,

NK-celler, der udtrykker IFNy, perforin og granzym,

3E

, CD8 udtrykker IFNy, perforin og granzym men reducerede IL-10-ekspression analyseret ved flowcytometri.

3F

,

Tumor cytokin udtryk (IFNy, IL-12, TNF og IL-10) efter MDSC udtynding. (Data, gennemsnit ± SEM, * p 0,05 sammenlignet med kontrolgruppen, n = 8 mus /gruppe)

flowcytometri

Flowcytometri blev udført for følgende T-celle overflade. markørerne CD3, CD4, CD8, CD69 på enkelt cellesuspension af splenocytter eller tumorceller fordøjelser efter behandling som beskrevet ovenfor. Splenocytter og tumorcellelinier fordøjelser blev også evalueret for NK-celler med overfladen markør CD49b. CD4 T, CD8 T og NK-celler blev individuelt bedømt for intracytoplasmatisk perforin, granzym, IFNy eller IL-10. CD107a på T-celler blev vurderet ved celleoverfladefarvning /flowcytometri. Til analyser af leukocytiske infiltrater i tumorvævet blev tumorer mekanisk dissocieret på en trådnet ved knusning med en 10 ml sprøjte og inkuberet i vævsfordøjelse puffer ved 37 ° C i 25 min. Cellerne blev filtreret gennem 70 um nylon sier (BD Biosciences, Bedford, MA), farvet med specifikke markører og analyseret ved flowcytometri. Prøver blev erhvervet på et FACSCanto (BD Biosciences /FACSCalibur flowcytometer (Becton Dickinson, San Jose, CA) på University of California, Los Angeles, Jonsson Cancer Center flowcytometri Core Facility. I alt 10.000 til 25.000 hændelser blev erhvervet og celler farvning positiv inden for den samlede levende cellepopulation blev analyseret under anvendelse FCS Express 3 (de novo Software, Canada). celler inkuberet med irrelevante isotype-matchede antistoffer og ufarvede celler fungerede som kontroller.

4A

,

IHC for kløvet caspase 3 i tumor sektioner efter MDSC udtynding. pilene er vejledende for kløvet caspase 3 farvning.

4B

,

AnnexinV og PI farvning i tumor fordøjer ved flowcytometri.

4C

,

Relativ caspase 8 udtryk ved QRTPCR normaliseret med β-actin udtryk i tumorvæv.

4D

,

endotel MECA 32 cellemarkør ekspression og samlede T-celle CXCR3 ekspression i tumorer ved flowcytometri.

4E-H

,

Relativ pro-angiogen og antiangiogen markør-ekspression i tumorer ved QRTPCR normaliseret ved β- actin. MDSC depletion faldt pro-angiogene (VEGF-a, CXCL2, CXCL5, Ang1 og Ang2) (4E-F), men steg antiangiogen (CXCL9 og CXCL10) (4G) og CXCR3 (4H) ekspression i tumorerne. (Data, gennemsnit ± SEM, p-værdier: i forhold til kontrol * p 0,05, n = 8 mus /gruppe)

5A

,

repræsentant. H pile indikerer tumor.

5B

,

Tumorbelastning evalueret af celleoverfladefarvning for EpCAM i en enkelt cellesuspension af tumor fordøjer og kvantificeres ved flowcytometri. (Data, gennemsnit ± SEM, p-værdier: i forhold til kontrol * p 0,05, n = 8 mus /gruppe)

CFSE Based cytolyseassay

I alt cytolytisk T-celle aktivitet. i milten mod parentale 3LL tumorceller eller syngene B16 melanomceller blev evalueret efter behandling med anti-Gr1 eller anti-Ly6G Ab på dag 21 efter podning med tumoren. Tumormål blev mærket med CFSE på dosis (1 uM) i PBS i 15-20 minutter i overensstemmelse med producentens anvisninger. Efter vask blev de mærkede mål inkuberet med T-celler oprenset fra milte med T-celle-søjler (R 6E, Milt produktion af IFNy, 6F, Hyppighed af IFNy-producerende CD4 og CD8 hukommelse (CD44) og aktivering (CD69) markering udtrykkende T-celler. 6G, geometriske gennemsnit af IFNy producerende memory T-celler fra vaccination plus anti-Gr1 behandling efter stimulering med OVA protein i forhold til naive kontroller. (Data, gennemsnit ± SEM, p-værdier: i forhold til kontrol * p 0,05, n = 8 mus /gruppe)

CFSE Mærkning og T cellesuppression Analyser

T-celler blev oprenset fra milte ved hjælp af T-celle isolation kolonner. Efter to gange vask med PBS, rensede T-celler (2 x 10

6 celler /ml) blandet med et tilsvarende volumen af ​​10 uM CFSE opløsningen i 10 minutter. Reaktionen blev afsluttet ved tilsætning af 10 volumener kold RPMI 1640/10% FBS. Mærkede celler (1 x 10

6 celler /ml) blev vasket to gange med PBS /2% FBS. I en U-bund 96 brønd celledyrkningspladen præ-coatet med anti-CD3-Ab (5 ug /ml), oprensede T-celler (2 x 10

5) blev dyrket i DMEM suppleret med 10% FBS og anti- CD28 Ab (5 ug /ml) i 72-96 timer. For at bestemme virkningen af ​​MDSC på T-celleproliferation, CFSE mærkede T-celler blev co-dyrket med oprenset Gr1 milt MDSC (2-4 x 10

5) fra 3LL bærende mus eller naive mus og ændringer i proliferation blev vurderet ved strømning cytometri. MDSC blev isoleret fra milte ved mærkning af cellesuspensioner med rotte-anti muse Gr1 mAb (eBioscience), efterfulgt af magnetisk antistof celleseparation anvendelse af anti-rotte mikroperler (Miltenyi Biotec). De isolerede celler blev . 90% ren for CD11 + Gr1 + udtrykkende MDSC som bestemt ved flowcytometri

Cytokine ELISA

cytokiner (IFNy, TNFa, IL-10 og IL-12) i splenocyt kultursupernatanter eller fra milt- eller tumor homogenater blev bestemt ved ELISA og pladerne aflæst ved de angivne bølgelængder med en mikropladelæser (Amersham Biosciences, Sunnyvale, CA).

tumor vævssektionering og Immunhistokemi

for at bestemme omfanget af lymfocytter infiltrerer tumorer fra de forskellige behandlingsgrupper, C57BL /6 mus med 7-dages tumorer blev injiceret

ip

med Gr1-specifikke (200 pg /dosis) eller Ly6G specifikke (200 ug /dosis) eller isotype IgG2b Ab (200 ug /dosis) hver 48. timer for 2 uger. Ikke-nekrotiske tumorer blev isoleret og indlejret i paraffin og serielt i snit til 5-um tykkelse. Sektionerne blev H

Ang-2

F, 5’CAAGAGCTCGGTTGCTATCCGTAA-3 ‘R, 5’ GTCCATGTCACAGTAGGCCTTGAT3 «;

VEGF-en

F, 5’TGTACCTCCACCATGCCAAGT-3 ‘R, 5’CGCTGGTAGACGTCCATGAA-3’;

CXCL5

F, 5’GGTCCACAGTGCCCTACG-3 ‘R, 5’GCGAGTGCATTCCGCTTA-3’;

CXCL2

F, 5’AGTGAACTGCGCTGTCAATG -3 ‘R, 5’GAGAGTGGCTATGACTTCTGTCTG-3’;

CXCL9

F, 5’GCACGATCCACTACAAATCCC-3 ‘R, 5’GGTTTGATCTCCGTTCTTCAGT-3’;

CXCL10

F, 5’CCAAGTGCTGCCGTCATTTTC-3 ‘R, 5’TCCCTATGGCCCTCATTCTCA-3’; og

CXCR3

F, TCTCCCTACGATTATGGGGAAAA-3 ‘og R, 5’GGTTCTGTCAAAGTTCAGGCT-3’.

Statistiske Analyser

Alle data præsenteres som gennemsnit ± SE. Statistisk analyse blev udført under anvendelse af Prism (GraphPad Software). Vi brugte variansanalyse for data med flere grupper, uparret Students

t

-test for dual sammenligning.

P

værdier 0,05 blev betragtet signifikant

Resultater

MDSC Øget i tumorbærende mus som en funktion af tumorvækst

For at fastslå virkningen. af 3LL tumorvækst på hyppigheden af ​​MDSC blev ikke nekrotiske tumorer, blod, milt eller BM evalueret for Gr1 + CD11b + udtryk (dag 7, 14 og 21 efter tumor podning). Svarende til fund af MDSC stigning i kræftpatienter [4], [5], der blev forøget MDSC frekvens i 3LL tumor bærende mus. MDSC frekvens øges i blodet (2-4 gange), milt (2,6-4 gange) og BM (1,5-2 gange) af tumorbærende mus i sammenligning med kontrol naive mus (Figur 1A-B). Dag-7 tumorer havde en lavere frekvens af MDSC sammenlignet med dag 14 og 21. Hyppigheden af ​​MDSC i tumoren fordøjelser blev yderligere styrket på dag 21 (3 gange) sammenlignet med dag 14 tumorer (Figur 1A-B). For at bekræfte de immunsuppressive virkninger af MDSC, vi evaluerede funktionen af ​​milt MDSC fra tumorbærende mus på hæmningen af ​​DC2.4 APC aktivitet eller T-celleproliferation. For

in vitro

DC APC aktivitet evaluering, valgte vi celle numre af DC og OVA specifikke CD8 T-celler, der producerede høje niveauer af IL-2 ved assaybetingelserne at give klare forskelle i IL-2 niveauer i tilstedeværelse eller fravær af MDSC. MDSC fra naive mus ikke undertrykke DC APC aktivitet. Selvom MDSC fra dag 7 tumor bærende mus undertrykte DC APC aktivitet, den undertrykkende effekt var lavere i forhold til MDSC fra dag 14 og 21 tumor bærende mus (Figur 1C). Desuden har MDSC fra naive mus ikke hæmme anti-CD3 /CD28 stimulerede CFSE mærket T-celle proliferation og MDSC fra dag 7 tumor bærende mus havde en lavere undertrykkende kapacitet på T-celle proliferation i forhold til MDSC fra dag 14 og 21 tumor bærende mus