PLoS ONE: Differential Virkninger af Tissue Culture belægningssubstrater på prostatakræft Cell Overholdelse, morfologi og adfærd

abstrakt

Svag celle-overfladeadhæsion af cellelinier til vævskultur overflader er et almindeligt problem og præsenterer tekniske begrænsninger til design af eksperimenter. For at overvinde dette problem har forskellige overfladebelægning protokoller blevet udviklet. Imidlertid har ikke foretaget en sammenlignende og præcis real-time måling af deres indvirkning på celle adfærd. Den prostatacancer LNCaP, afledt af en patient lymfeknudemetastase, er et almindeligt anvendt modelsystem i prostatakræft forskning. Imidlertid har cellernes karakteristisk svag tilknytning til overfladen af ​​vævskultur fartøjer og dækglas hæmmet deres manipulation og analyse og anvendelse i high throughput screening. For at forbedre vedhæftningen af ​​LNCaP-celler til kulturen overflade, sammenlignede vi forskellige coating reagenser (poly-L-lysin, poly-L-ornithin, collagen type IV, fibronektin og laminin) og dyrkningsbetingelser og analyseret deres indvirkning på celleproliferation, vedhæftning, morfologi, mobilitet og genekspression ved hjælp af real-time-teknologier. Resultaterne viste, at fibronectin, poly-L-lysin og poly-L-ornithin forbedret LNCaP-celler adhærens og provokeret cellemorfologi ombygninger, såsom forøgelse af nuklear og cellulære område. Disse coating reagenser inducerede også en højere ekspression af F-actin og reduceret celle mobilitet. I modsætning hertil laminin og kollagen type IV ikke forbedre vedhæftning men fremmet celle sammenlægning og påvirkede cellemorfologi. Celler dyrket i nærvær af laminin viste højere mobilitet end kontrolceller. Alle coatingbetingelser signifikant påvirket cellernes levedygtighed; Men, de ikke påvirker ekspressionen af ​​androgen receptor-regulerede gener. Vores komparative resultater giver vigtig indsigt for udvælgelsen af ​​de ideelle belægning reagens og dyrkningsbetingelser for kræft cellelinjer med hensyn til deres virkning på spredning sats, vedhæftet fil, morfologi, migration, transkriptionel respons og cellulære cytoskelet arrangement.

Henvisning: Liberio MS, Sadowski MC, Soekmadji C, Davis RA, Nelson CC (2014) Differential Virkninger af Tissue Culture belægningssubstrater på prostatakræft Cell Overholdelse, morfologi og adfærd. PLoS ONE 9 (11): e112122. doi: 10,1371 /journal.pone.0112122

Redaktør: Lucia R. Languino, Thomas Jefferson University, USA

Modtaget: August 6, 2014 Accepteret: 12. oktober 2014 Udgivet: November 6, 2014

Copyright: © 2014 Liberio et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:. Finansiering af undersøgelsen blev leveret af Eskitis Institute Griffith University og den australske Prostata Cancer Research Centre-Queensland gennem finansiering fra den australske regering Department of Health . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i multicellulær organisme væv det ekstracellulære rum omgivende celler er fyldt med en kompleks blanding af makromolekyler benævnt den ekstracellulære matrix (ECM). ECM er sammensat af polysaccharider og proteiner, såsom laminin, fibronectin, elastin, collagen, og deres relative mængde er vævsspecifik. Disse proteiner er indlejret i en polysaccharidgel. [1] På trods af de indledende tanker tjener blot som et stillads for celler, er det nu kendt, at ECM er ikke kun strukturelle men lærerigt, er ansvarlig for at regulere cellulær adfærd og påvirker deres proliferation, form, funktion, migration, overlevelse og udvikling [2] -. [5]

Mange af ECM-proteiner har vigtige adhærens funktion. [1] De fleste celler er forankringsafhængige og skal fastgøre til ECM for at overleve og formere sig. [6] Integriner er transmembrane proteiner i form af ap heterodimerer integrale for ECM protein-cellebinding. Denne interaktion genererer en kaskade af intracellulære signaler, der også kan styre differentiel genekspression. [7], [8] signalering respons er relateret til ECM molekylære sammensætning, som ændrer sig med celle respons på deres mikromiljø. [9], [10] På denne måde, er ECM er i konstant forandring at lette celle krav udviklingsmæssige plasticitet. [11] Alligevel lidt om de molekylære detaljer involveret i signaltransduktion. Cellen svar på ECM komponenter er variabel og afhængig af hvilken integrin subunits udtrykkes af cellerne. Mange forskningsgrupper har brugt forskellige ECM-proteiner i vævskultur til at ændre celle adfærd, primært cellevedhæftning. [12] – [15] Imidlertid, ud over at øge vedhæftning, belægningen proteiner kan påvirke andre aspekter af cellebiologi, påvirke de endelige resultater af assayet [16]

androgen-sensitive humane prostata-adenocarcinom. cellelinie, LNCaP, er en af ​​de mest almindeligt anvendte modelsystemer i prostatacancer (PSA) forskning. Den blev afledt af en metastatisk læsion i lymfeknuden af ​​en 50-årig kaukasisk mand i 1977. [17] Svag celle-overfladeadhæsion af cellelinjer er et fælles problem for vævskultur forskning og præsenterer tekniske begrænsninger til design af eksperimenter . Deres karakteristiske svag tilknytning til overfladen af ​​vævskultur fartøjer og dækglas har hindret deres manipulation, analyse og anvendelse i high throughput screening eftersom LNCaP-celler kan nemt forrykke gennem beskedne mekaniske kræfter som væske forskydningsspænding. For at forbedre vedhæftningen af ​​LNCaP-celler til kulturen overflade, sammenlignede vi forskellige coating reagenser (poly-L-lysin, poly-L-ornithin, collagen IV, fibronektin og laminin) og dyrkningsbetingelser, fx celletæthed, og analyseret deres indvirkning på celleproliferation, adhæsion, mobilitet og morfologi med en real-time celle analysator (RTCA). Vores resultater er et nyttigt værktøj til udvælgelse af de ideelle belægning reagens og dyrkningsbetingelser for LNCaP cellelinje med hensyn til deres virkning på spredning sats, vedhæftet fil, morfologi og cellulære cytoskelet arrangement.

Materialer og metoder

Cellekultur

LNCaP-celler (American Tissue Culture Collection, Rockville, MD) blev rutinemæssigt dyrket i RPMI vækstmedier uden phenolrødt (Invitrogen) suppleret med 10% (vol /vol) FBS (Invitrogen) . LNCaP celler blev opformeret til ikke mere end 40 passager.

Coating betingelser

Alle belægning reagenser blev fremstillet som anbefalet af producenterne. Mængden og koncentrationen af ​​de stoffer, der anvendes til belægning brøndene var 1,3 uL laminin (LAM, 0,5 mg /ml i H

2O, Invitrogen), 1 pi kollagen fra human placenta type IV (COL, 1 mg /ml i H

2O, Invitrogen), 0,4 pi fibronectin (FN, 1 mg /ml i H

2O, Invitrogen), og 0,32 pi poly-L-lysin (PLL, 1 mg /ml i H

2O, Invitrogen). Disse coating reagenser blev blandet med H

2O til et samlet volumen på 50 pi per brønd af en 96-brønds plade. 50 pi poly-L-ornithin (PLO, 0,01% i H, Sigma-Aldrich

2O) blev direkte sat til brøndene, og pladerne blev inkuberet natten over ved 37 ° C i 5% CO

2. Inkubationstiden for LAM og FN var 4 timer under anvendelse af de samme betingelser som beskrevet ovenfor. De coatede brønde blev vasket en gang med DPBS umiddelbart efterfulgt af cellepodning. Mængden af ​​belægning stoffer blev justeret i henhold til vækstområde, når forskellige kultur fartøjer blev anvendt.

Fast tid celle analysator (xCELLigence System)

Den virkelige tid celle analysator (RTCA) xCELLigence systemet ( Roche Applied Science) omfatter fire hoveddele: RTCA analyzer, den RTCA SP station, som forbliver inde i en cellekultur inkubator, den RTCA computer med integreret software, og en 96-brønd E-plade. Bunden af ​​den disponible 96-brønd E-plade er ca 80% dækket med guld mikroelektroder, der overvåger den elektroniske impedans, afsløre fysiologiske ændringer i cellerne. Celler i kontakt med elektroden vil fungere som isolatorer, hvilket fører til en stigning i impedans. Således elektrode impedans skifter proportionalt med ændringer i antal, størrelse og vedhæftning af celler, der vokser i et monolag [18], [19].

Ændringer i impedans omregnes som uden enhed sigt

celle index

(CI). CI = (Zi-Z0) /15, hvor Zi er impedans ved en individuel tidspunkt under forsøget og Z0 er impedansen ved starten af ​​forsøget. , CI er således en kvantitativ og sammensat mål for den samlede tilstand af cellerne i en elektrode indeholdende brønd [18], [19].

Først 100 pi komplet medium blev tilsat til hver brønd for måling af baggrunden. Derefter blev LNCaP-celler podet i en 96-brønd E-plade overtrukket eller belagt med de angivne reagenser som beskrevet ovenfor ved en densitet mellem 9,4 × 10

3 og 6,25 × 10

4 celler /cm

2 i tre eksemplarer. E-pladen fik lov til at inkubere ved stuetemperatur i 30 minutter og anbringes på læseren i inkubatoren til kontinuerlig registrering af cellen indeks. E-pladen blev inkuberet i 96 timer ved 37 ° C i 5% CO

2, og fastgørelsen af ​​cellerne blev overvåget via CI i 4 timer hver 2 min. Efter denne periode blev CI målt hver time i 92 timer.

celleproliferation og levedygtighed

Celler blev podet i plader med 96 brønde overtrukket eller ikke overtrukket med de angivne reagenser ved en densitet på 1,25 × 10

4 celler /cm

2. Vækst som en funktion af stigende sammenløb blev målt ved hjælp af den levende indhold cell imaging IncuCyte HD-system (Essen BioScience). Billeder blev taget med et 10x objektiv med 2 timers intervaller fra 3 separate brønde pr coating tilstand, og gennemsnit ± SD konfluens procenter blev beregnet. Metaboliske aktivitet af cellerne dyrket på de forskellige belægninger blev målt med alamarBlue efter 96 timer ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, USA). Kinetisk analyse blev udført med GraphPad Prism (GraphPad Software). Gennemsnitlige værdier af tredobbelte blev beregnet efter baggrund korrektion.

Adhæsion og kvantificering af morfologiske parametre

LNCaP-celler blev podet i en 96-brønds plade, ikke belagt eller overtrukket med de angivne reagenser ved en densitet på 3.12 × 10

4 celler /cm

2. Efter 24 timer, 48 timer, 72 timer og 96 timer blev cellerne fikseret med 4% paraformaldehyd i 20 minutter på is, permeabiliseret med 0,2% (volumen /volumen) Triton X-100 /PBS i 10 minutter, og farvet med CellMask Deep Red plasmamembran Stain (2,5 ug /ml, Invitrogen) og 1 ug /ml DAPI (Invitrogen). Vurderingen af ​​celleadhæsion udførtes måle antallet af celler tilbage fastgjort til pladen efter vasketrinene ved hjælp af Content Operette High Imaging System (PerkinElmer). Den morfologiske parametre celle område og kerner område blev kvantificeret.

Time-lapse billeddannelse

Overflader af en 6 brønd /plade blev overtrukket som beskrevet ovenfor. LNCaP-celler blev podet ved en densitet på 1,58 × 10

4 celler /cm

2 og overvåges i 96 timer. Hver 15 minutter et billede blev taget med et Zeiss Axio Observer lysmikroskop (mål 20 ×) at følge form ændringer og migration under tid. Videoerne kan findes som Video S1-S6.

Fordeling af F-actin

LNCaP celler blev dyrket på dækglas ubestrøget og belagt med de angivne reagenser til 24 timer og 96 timer. Celler blev derefter fikseret og permeabiliseret som beskrevet ovenfor, efterfulgt af farvning med rhodamin-phalloidin (1:40 Invitrogen) og 1 ug /ml DAPI (Invitrogen). Immunofluorescens komplekser blev visualiseret med et Olympus (FV1000 Spectral) konfokalt mikroskop under anvendelse af en 60 x objektiv. Optisk sektionering blev udført ved at erhverve en stak billeder ved forskellige fokale positioner langs z-aksen.

Scratch sår assay

LNCaP celler (3,12 x 10

4 celler /cm

2) blev podet i en 96-brønds Essen ImageLock plade (Essen BioScience) overtrukket eller belagt som tidligere beskrevet, og blev dyrket til konfluens i en CO

2 befugtet inkubator. Efter 24 timer blev ridse fremstillet ved anvendelse af 96-pin WoundMaker (Essen BioScience). Wound billeder blev taget hver 1 time i 36 timer, og dataene blev analyseret med den integrerede metriske Relativ sår Density del af den levende celleindhold imaging system IncuCyte HD (Essen BioScience). Eksperimentet blev udført tre gange.

Følsomhed over for simvastatin

Indflydelsen af ​​FN, PLO og PLL-coating på cellen følsomhed over for simvastatin blev undersøgt. LNCaP-celler blev podet i tre eksemplarer og dyrket i en 96-brønds E-plader som beskrevet ovenfor. Efter 24 timers inkubation blev cellerne behandlet med forskellige koncentrationer af simvastatin (Sigma-Aldrich) og overvåget hver 1 time i 60 timer under anvendelse af RTCA systemet. IC

50 for 24 timer, 48 timer og 72 timer behandling blev beregnet ved hjælp af softwaren GraphPad Prism 5 (GraphPad Software).

QRT-PCR

Overflader af en 6 vel- plade blev overtrukket som beskrevet ovenfor, og LNCaP-celler blev podet ved en densitet på 1,05 × 10

4 celler /cm

2. Efter 72 timer blev vækstmediet substitueret med trækul-strippet (androgen-forarmet) serum RPMI-medier (CSS, Invitrogen, USA) suppleret med 5% (v /v) CSS og cellerne blev dyrket i 48 timer. Endelig blev LNCaP-celler behandlet med 20% (v /v) ethanol som kontrol eller androgener R1881 (1 nM) og DHT (10 nm) i 30 timer.

Samlet RNA blev opnået ved anvendelse af RNeasy mini kit (Qiagen, USA) ifølge producentens anvisninger. Mængden og kvaliteten af ​​RNA blev målt ved anvendelse af et NanoDrop UV-spektrofotometer (ThermoFisher Scientific, USA). Prøver med en 260/280 forhold højere end 2,0, blev anvendt til efterfølgende procedurer. Prøverne blev behandlet med DNAse Amp klasse I, og 2 ug af total RNA blev revers-transkriberet under anvendelse af cDNA-syntese fremgangsmåde til qPCR kit (Invitrogen). QRT-PCR blev udført med SYBR Green Master Mix (Invitrogen) under anvendelse af 7900HT Hurtig Real-Time PCR System (Applied Biosystems). Data blev analyseret med SDS2.3 software (Applied Biosystems). MRNA-ekspressionsniveauer blev beregnet ved ΔΔCt fremgangsmåden og normaliseret i forhold til ekspressionsniveauerne af huset holde genet (GAPDH eller RPL32) af den respektive behandling og beregnet i forhold til ethanol uovertrukket kontrol. Sekvenserne for de anvendte primere er anført i tabel S1.

Resultater

FN, PLO og PLL forbedre celle-substrat vedhæftning

Den virkelige tid celle analysator (RTCA) xCELLigence er en etiket-fri metode, der måler spredning sats, vedhæftning og morfologi baseret på impedans ændringer. Ændringer i impedans omregnes som uden enhed sigt

celle indeks

(CI). Vi udførte RTCA analyse af LNCaP-celler podet i brønde forbehandlede med de forskellige belægninger på celledensiteter mellem 9,4 × 10

3-6,25 × 10

4 celler /cm

2 i en plade med 96, og undersøgt både fastgørelsen fase (24 timer efter podning) (fig. 1) og proliferation fase (24 timer til 96 timer efter podning) af cellekultur (fig. 2). Det blev antaget, at bindingen af ​​celler ud af suspensionen på substratet og cellemorfologien ændringer i forbindelse med denne proces var de største bidragydere til CI i de første 24 timer af forsøget (fig. 1). Derfor blev bidrag spredning til CI for denne periode betragtes marginal, som blev yderligere understøttet af, at LNCaP celler dyrket under lignende betingelser viste en fordobling tid på 36 timer. [20] Indeed, sammenligning af de forskellige seeding tætheder af kontrollen og overtrækket reagenser ved 3,12 × 10

4 celler /cm

2 i en plade med 96 efter 24 timer viste, at PLL øgede CI til en lignende omfang som fordobling af antallet af podede celler, dvs. fra 3,12 × 10

4-til 6,25 × 10

4 celler /cm

2 (fig. S1). Under alle celledensiteter, belægning med fibronectin (FN) resulterede i den højeste CI efter 24 timer, efterfulgt af poly-L-lysin (PLL) og poly-L-ornithin (PLO). PLL og PLO øget CI til meget lignende hastigheder på op til 3,12 × 10

4 celler /cm

2, mens PLO faldt hældningen på alle celledensiteter (fig. 2). Den laminin (LAM) belægning påvirkede ikke CI i forhold til kontrol, mens collagen type IV (COL) forårsagede CI til at stige langsommere. Interessant nok blev denne ordre ikke påvirket ved at øge antallet af podede celler. Disse resultater antydede, at FN, PLL og PLO markant forbedret vedhæftning af LNCaP-celler, med ECM protein er overlegen i forhold til de polyaminosyrer.

Cellerne blev overvåget i 24 timer for at analysere celle-substrat adhærens fra den tid celler blev tilsat til brøndene (t = 0) under anvendelse af en real-time-celle analysator (xCELLigence, Roche). Hvert datapunkt er repræsenteret ved dens midler (n = 3) ± SD.

Cellerne blev overvåget i 72 timer for at analysere virkningerne af de belægninger på LNCaP celler 24-96 h under anvendelse af en reel -tid celle analysator (xCELLigence, Roche). Dataene blev normaliseret ved 24 timer til sammenligning af skråninger. Hvert datapunkt er repræsenteret ved dens midler (n = 3) ± SD.

Proliferationen fase blev overvåget fra 24 timer efter podning af cellerne til 96 h (Fig. 2). De store bidragydere af denne fase til ændringer af CI er celleproliferation, vedhæftning og morfologi. Ved alle testede celletætheder, LNCaP-celler dyrket på LAM vises en hastighed på CI stigning, der var skelnes fra kontrollen. I modsætning hertil LNCaP celler dyrket på COL substrat viste en lag fase, hvor EF-erhvervsgrenen ikke stige op til 48 timer efter såning, og en samlet nedsat CI stigning (fig. 2B-E). Disse effekter var uafhængige af antallet af podede celler. På alle celledensiteter PLL substrat forårsagede en påviselig opbremsning i CI stigning. Den samme virkning var synlig på PLO substrat på højeste podningstæthed (6,25 × 10

4 celler /cm

2, fig. 2E), mens CI øget hurtigere på PLO-coatede substrat ved lavere seeding densiteter (Fig . 2A og B). Bortset fra den laveste celle densitet (9,4 × 10

3 celler /cm

2), CI renteforhøjelse af celler dyrket på FN substrat var konsekvent højere end kontrol (fig 2B-E.); en effekt, som syntes at være upåvirket af stigninger i antallet af seedede celler. Tilsammen høj celledensiteter ( 4,69 × 10

4 /cm

2) negativt påvirket CI når LNCaP-celler blev dyrket på substrater overtrukket med poly-aminosyrer (PLL og PLO) men var upåvirket med ECM proteiner (KOL LAM og Fn). Denne observation er af særlig betydning for cellekultur eksperimenter, hvor en høj celle konfluens er ønskelig. Endvidere en podningsdensitet på 9,4 × 10

3 celler /cm

2 var samlet skadelig for cellekultur af LNCaP-celler, hvilket resulterer i mangel på celleproliferation, hvilket sandsynligvis skyldes en mangel på celle-celle-kontakter.

Alle belægning betingelser reduceret celledeling, men ikke stærkt påvirke LNCaP cellernes levedygtighed

celle-indekset er et kombineret mål for spredning sats, vedhæftning og morfologi af cellerne. Derfor blev virkningerne af belægningen reagenser på hver af disse parametre undersøgt separat. Celledensiteten af ​​de coatede brønde steg langsommere end de ikke-coatede brønde. Celler dyrkes på FN, PLL, PLO og LAM viste lignende vækstrater (Fig. 3A). Collagen type IV var overtrækket stof, negativt påvirket celleproliferation mest. Undersøgelse af levedygtighed /metaboliske aktivitet af LNCaP celler dyrket i 96 timer på de forskellige belægningssubstrater ved Alamarblue assay viste, at alle coating reagenser reduceret levedygtighed celle, med COL lidt dårligere end de andre belægninger (fig. 3B). Denne virkning var magen til resultaterne opnået for godt konfluens på forskellige belægninger (fig. 3A). Tilsammen viste disse resultater, at belægningen reagenser påvirkes celleproliferation og metabolisme aktivitet af LNCaP-celler.

LNCaP-celler blev podet ved 1,25 × 10

4 celler /cm

2 på en polystyren med 96 brønde -plate uovertrukket eller overtrukket med poly-L-ornithin, poly-L-lysin, collagen type IV, laminin eller fibronectin. (A) Wells konfluens blev overvåget hver 2 timer i 96 timer ved hjælp IncuCyte system. (B) Metabolisk aktivitet /cellelevedygtigheden blev målt ved alamarBlue assay efter 96 timer. Hvert datapunkt er repræsenteret ved dens midler (n = 3) ± SD. Væsentlige resultater (p 0,05). Er markeret med en stjerne

COL og LAM induceret LNCaP celler til at samle

IncuCyte billeder afslørede, at LNCaP celler blev bundet til overfladen i al belægning betingelser efter 24 timer (fig. 4a). Cellerne dyrkes i brøndene pre-coated med FN, PLL, PLO, LAM, såvel som kontrol udviste en fibroblastlignende form typisk for LNCaP-celler. [21] I modsætning hertil LNCaP-celler dyrket på COL havde en rundere form. Celler dyrkes på COL og LAM tendens også til at aggregere. Desuden brøndene overtrukket med LAM og FN indeholdt flere runde celler sammenlignet med de andre belægningssubstrater (fig. 4A). Det samme blev observeret efter 96 timer (fig. 4B). Efter 96 timer, de fleste af cellerne erhvervet en spindel form i alle coatingbetingelser. Celler på KOL voksede i aggregater efter 96 timer (fig. 4B).

LNCaP-celler afbildes efter 24 timer (A) og 96 h (B) med IncuCyte systemet, 10 ×. Scale bar = 300 um. (C) Snap shots fra 96 ​​h time-lapse mikroskopi video af LNCaP celler. Pile angiver lamellipodia af polariserede celler. Scale bar = 50 um (20 ×, Zeiss Axio Observer).

For at undersøge effekten af ​​belægningen reagenser om celle mobilitet og morfologi mere detaljeret i realtid, LNCaP celler blev undersøgt ved stor forstørrelse tid-lapse mikroskopi. Svarende til IncuCyte eksperiment viste tid-lapse mikroskopi at COL og LAM (fig. 4C) forårsaget LNCaP celler til at danne aggregater. Desuden celler dyrket i LAM-coatede brønde viste tilstedeværelsen af ​​mange polariserede celler, kendetegnet ved tilstedeværelsen af ​​asymmetriske celler. De PLL- og PLO-behandlede prøver viste en lignende morfologi sammenlignet med kontrollen. Alligevel LNCaP podet på disse substrater syntes at vedhæfte hurtigere end kontrolcellerne og migrere mindre. Videoer af time-lapse mikroskopi over en periode på 96 timer kan findes i Video S1-S6.

LNCaP celler vedhæfte bedre til overflader belagt med FN, PLO og PLL, som også påvirker cellemorfologi

Attachment og cellemorfologi, der komponere en del af CI, blev undersøgt ved højt indhold screening (HCS). HCS af LNCaP-celler målt en væsentlig højere celledensitet (bedre vedhæftning) efter forbehandling af brøndene med PLO eller PLL sammenlignet med kontrollen, FN, COL eller LAM på alle tidspunkter (fig. 5A). Celler dyrket i nærværelse af FN fastgjort bedre end kontrolcellerne ved 72 og 96 timer. I forhold til cellemorfologi ændringer, blev arealet af kernen og den samlede celle areal af alle belægninger (fig. 5B og 5C). Celler dyrket på PLO, PLL og Fn i 96 timer viste øget nukleare og cellulære områder på mindst 8% og 18%, når det blev sammenlignet med kontrol. I forhold til kontrol, COL og LAM faldt de nukleare og cellulære områder med 7% og 10%, og 15% og 14%, hhv.

Celler blev analyseret for celletæthed (A), nuklear område (B ) og cellulære område (C) på fire forskellige tidspunkter ved hjælp af en højt indhold screening instrument (Operette).

de forskellige belægning reagenser påvirkes F-Actin organisation

for at undersøge ændringerne i cellemorfologi og mobilitet for LNCaP-celler i flere detaljer, udførte vi konfokal fluorescensmikroskopi og undersøgte F-actin organisering af LNCaP-celler, såsom tilstedeværelsen af ​​lamellipodia ved 24 timer (fig. 6a) og 96 timer (fig. 6B) post-podning. Disse strukturer består af parallelle-bundtet actinfilamenter der Probe underlaget at beslutte, hvor og hvordan bør etableres de centrale sammenvoksninger til fastgørelse. Desuden er disse filamenter bidrager til dannelsen af ​​actin stress fibre. [22], [23] adhæsion og spredning af celler involverer remodellering af cytoskelettet. Dynamiske strukturer kaldet fokale kontakter dannes omkring integriner ved de vedhæftning sites. Integrinerne er bundet til ECM komponenter på den ene side, og til actinfilamenter kaldet stress fibre på den anden side. Anvendelsen af ​​kraft i den ene side årsag reaktion på den anden, og dette, sammen med integrin signalveje, bestemmer cellen form. [3] I overensstemmelse med de observerede i time-lapse mikroskopi eksperiment resultater, vi observeret mange polariserede celler efter 24 timer på Fn og LAM-behandlede dækglas (fig. 6A). Hertil kommer, efter 96 timer blev det observeret, at fibrene blev mere desorganiseret med nogle corticale actin ophobning omkring cellen krop og en reduceret række stress fibre i nærvær af FN (fig. 6B). Desuden FN forårsagede en væsentlig stigning i actin farvning, og cellerne mistede deres polaritet (fig. 6B).

Celler blev dyrket på dækglas uden belægning (kontrol), eller overtrukket med fibronektin (FN), laminin (LAM), poly-L-lysin (PLL), poly-L-ornithin (PLO) eller collagen type IV (COL IV). Efter 24 timer (A) eller 96h (B) blev celler farvet for F-actin med rhodamin-phalloidin, modfarvet med DAPI og analyseret ved konfokal fluorescensmikroskopi (60 ×, Olympus). Pile angiver lamellipodia af polariserede celler og pil hoveder markerer filopodia. Scale bar = 50 um.

Celler dyrkes i nærvær af PLL og PLO (fig. 6) udviste en mere diffus actin mønster med nogle koncentreret actin-farvning på cellen periferien ved 24 timer og 96 timer . Tilstedeværelsen af ​​mange actin bundter og radialt udvidede actinfilamenter omkring cellerne, som kaldes filopodia, blev observeret. Kernerne i celler dyrket på PLL viste en stærk DAPI intensitet ved 24 timer (fig. 6A), som blev reduceret efter 96 timer (fig. 6B). Endvidere kernerne vokset i størrelse efter 96 h.

Efter 24 timer blev cellerne i brøndene overtrukket med COL (fig. 6A) viste en actin mønster svarede til kontrollen. Alligevel efter 96 timers vækst, actinfilamenter blev mere organiserede end i kontrolgruppen (fig. 6B).

PLL, PLO, eller Fn-coatede brønde øger binding af LNCaP-celler og faldt lidt celle mobilitet , mens LAM øger migration

Morfologiske ændringer er normalt forbundet med ændringer af andre celle egenskaber, herunder motilitet, differentiering og metabolisk aktivitet. [24] For at løse denne mulighed, blev motiliteten af ​​LNCaP-celler dyrket på polystyren behandlet med de forskellige coating reagenser vurderet i et sårhelende assay (fig. 7). LNCaP-celler blev podet i 24 timer i brønde overtrukket med FN, LAM, PLL, PLO eller KOL og cellemonolaget blev ridset under anvendelse af en 96-polet WoundMaker. Kvaliteten af ​​sårene genereret på PLL, PLO, eller Fn-coatede brønde var overlegen i forhold til kontrollen (ingen belægning) og LAM, som vurderet ved den relative glatte kanterne af bunden samt en meget lignende sårområde (Fig . S2). En anden iagttagelse var, at LNCaP-celler dyrket i PLO eller PLL-behandlede brønde koloniseret brønden i en semi-organiseret mønster, hvor de langstrakte cellelegemer blev rettet ind parallelt (fig. S2). Forbehandling med LAM forbedrede ikke vedhæftningen af ​​LNCaP-celler i sammenligning med kontrollen, og WoundMaker genererede sår med ujævne kanter og andet område. LNCaP-celler løsnet som store plader af celler fra Col-behandlede brønde, når de behandles med WoundMaker (data ikke vist), hvilket indikerer, at COL var ringere end uovertrukne brønde og ikke egnet til denne anvendelse. Analyse af den relative sår massefylde viste, at celler dyrket under tilstedeværelse af LAM migreret 62% hurtigere i sårområdet end kontrolcellerne efter 36 timer (fig. 7). Til sammenligning PLL, PLO og FN forårsaget LNCaP-celler til at migrere langsommere end kontrollen, viser en reduktion af sår densitet med 15%, 33% og 20% ​​dyrkes under disse betingelser henholdsvis. Især LNCaP celler viste en fordobling tiden omkring 36 timer, som observeret i de RTCA eksperimenter, [20] tyder på, at de observerede virkninger på såret tæthed var forårsaget hovedsageligt af celle migration og ikke spredning.

Relativ sår massefylde på forskellige tidspunkter af LNCaP-celler over en periode på 36 timer. Målingerne er fra sår foretaget på et monolag af LNCaP-celler dyrket i nærvær af forskellige coatingbehandlinger og kontrol.

PLL sensibiliserer LNCaP-celler for HMGCR inhibitoren simvastatin

Tidligere undersøgelser har vist, at et overtræk med ECM komponenter kan påvirke følsomheden af ​​celler til forskellige lægemidler. For eksempel har LAM og FN blevet rapporteret at øge modstanden mod ioniserende stråling og til det cytotoksiske lægemiddel Ukrain i human tumor og normale celler

i

vitro

. [25] Det blev endvidere rapporteret, at overholdelse af en FN substrat induceret cholesterolsyntese ved aktivering af HMGCR og også øget fedtsyresyntese i humane fibroblaster og rotte hepatomceller, mens en PLL substrat eller FN i opløsning havde ingen virkning på disse veje [ ,,,0],26].

Derfor er virkningen af ​​overtrækket reagenser PLL, PLO og FN på følsomheden af ​​LNCaP-celler til HMGCR inhibitoren simvastatin blev undersøgt ved RTCA, og IC

50 blev beregnet for behandlingsperioder af 24 timer, 48 timer og 72 timer (fig. S3). LAM og COL effekter blev ikke analyseret, fordi disse coating reagenser havde negative virkninger på LNCaP celle-overflade vedhæftning og forårsagede celle aggregering. Mens IC

50 for simvastatin var forholdsvis ens blandt de fire coating betingelser ved 24 timer, PLL øget følsomhed over LNCaP-celler til HMGCR inhibitoren ved to gange efter 48 timers behandling ved sammenligning med kontrol (fig. S3) . Efter 72 timer, LNCaP-celler dyrket på en PLL substrat vises et tre gange lavere IC

50. Tilsvarende PLO og FN øget følsomhed over LNCaP-celler til simvastatin med to gange i forhold til kontrollen ved 72 timer. Det er imidlertid blevet observeret, at PLO, PLL og Fn reducerede cellelevedygtigheden med en tredjedel på 96 h (fig. 3B). Derfor kan sensibilisering af LNCaP celler ved PLO og FN for at simvastatin være faktisk virkningen af ​​disse belægninger på cellelevedygtighed. I dette tilfælde, kun PLL høj grad kan bevidstgøre LNCaP celler til HMGCR inhibitor simvastatin i en tidsafhængig måde.

Androgen lydhørhed og AR signalering var generelt ikke påvirket af belægningen betingelser

I den sund voksen prostata epitel, AR ekspression og celleadhæsion til det underliggende lag forekommer i separate cellelag, nemlig i luminal og basale celler. Derfor veje af AR signalering og celleadhæsion er usandsynligt at interagere direkte. [29] Under udviklingen af ​​prostatakræft, ændre maligne luminale epitelceller fra celle-celleadhæsion til celle-substrat-adhæsion, og signaler fra celleadhæsion og AR er co-udtrykkes. [27] LNCaP-cellelinien er en vigtig model til undersøgelse androgen receptor (AR) -medieret signalering i prostatacancer. Det blev for nylig vist, at ændringer til celle-celle-kontakter og den ekstracellulære matrix ændret respons LNCaP-celler til androgener.