PLoS ONE: Self-Fornyelse og pluripotens Erhvervet gennem Somatisk Omprogrammering Human Cancer Stem Cells

Abstrakt

Menneskelig inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) er omprogrammeres ved forbigående ekspression af transkriptionsfaktorer i somatiske celler. Ca. 1% af somatiske celler kan omprogrammeres til iPSCs, mens de resterende somatiske celler differentielt omprogrammeres. Her har vi etableret inducerede pluripotente cancer stamceller-lignende celler (iCSCs) som selvfornyende pluripotente celle kloner. Stabile ICSC linjer blev etableret fra ustabile induceret epithelial stamcelle (iESC) linjer gennem re-plating efterfulgt af embryoid krop dannelse og seriel transplantation. iCSCs delte udtryk for pluripotente markørgener med iPSCs, bortset fra

REX1

LIN28

, mens udstillet udtryk for somatiske markørgener

EMP1

PPARy

. iESCs og iCSCs kunne generere teratomer med høj effektivitet ved implantation i immunsvækkede mus. Det andet iCSCs isoleret fra dissocierede celler af teratom fra de første iCSCs blev stabilt vedligeholdt, der viser en genekspressionsprofilen ligner de første iCSCs. I første og andet iCSCs, transgen-afledte

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

, og

c-myc

blev udtrykt. Sammenlignende global genekspression analyser vist, at de første iCSCs lignede iESCs, og klart forskellig fra menneskelige iPSCs og somatiske celler. I iCSCs, genekspression kinetik kernen pluripotens faktor og Myc-relateret faktor var pluripotente type, mens Polycomb kompleks faktor var somatiske type. Disse resultater viser, at pluripotente tumorigenicitet kan tillægges somatiske celler gennem opregulering af kernen pluripotens og Myc-relaterede faktorer, før etableringen af ​​IPSC molekylære netværk ved fuld omprogrammering via nedregulering af den Polycomb kompleks faktor.

Henvisning: Nagata s, Hirano K, Kanemori M, Sun LT, Tada T (2012) selvfornyelse og pluripotens erhvervet gennem Somatisk Omprogrammering human Cancer stamceller. PLoS ONE 7 (11): e48699. doi: 10,1371 /journal.pone.0048699

Redaktør: Martin Pera, University of Melbourne, Australien

Modtaget: Juli 18, 2012; Accepteret: September 28, 2012; Udgivet: November 8, 2012 |

Copyright: © 2012 Nagata et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde understøttes af JSP’er Kakenhi, tilskud nummer 23390067. de finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke eksisterer konkurrerende interesser.

Introduktion

Kræft stamceller (CSCS), som er subpopulationer af tumorceller, funktion i opretholdelse af kræft gennem initiering og udbredelse af fastholde tumorvækst [1]. CSCS menes at være centrale mål for kræftbehandling, men detaljerne i deres genetiske og epigenetiske signaturer er uklare. Som en guld standard til at definere CSC egenskaber, en seriel transplantation assay baseret på evnen til at forny sig selv og generere tumorer er blevet meget udbredt [2]. En afgørende begivenhed i initierende kræftformer er aktivering af selvfornyelse maskiner, som er normalt begrænset til stamceller. Derfor er det sandsynligt, at CSCS deler flere genekspression signaturer påvist i pluripotente stamceller. Faktisk pluripotente markørgener,

Oct4

Nanog

, er udtrykt i nogle kræftformer [3], [4], og onkogen

Myc

er involveret i frembringelsen af mange cancere [5].

Tvungen ekspression af en kombination af transkriptionelle faktorer, Oct4, Sox2, Klf4, og c-myc (OSKM), kan fremme direkte omprogrammering af humane og muse somatiske celler i induceret pluripotente stamceller celler (iPSCs) [6], [7]. I direkte omprogrammering,

Oct4

Sox2

, som er centrale pluripotens faktorer, fungerer som regulatorer af udviklingsmæssige og transskription-associerede processer [8],

Myc

henvender gener overvejende involveret i cellulær metabolisme, cellecyklus, og protein synteseveje [9]. Desuden

Myc

funktioner til at øge effektiviteten ved at regulere p53 pathway [10]. Dette tyder på, at de fælles veje kan anvendes både i købet af pluripotens og tumorigenese. Hos mennesker blev CSC-lignende celler transformeret fra primære hudfibroblaster ved den stabile ekspression af hTERT, H-RASV12, og SV40 LT og ST-antigener [11]. Hos mus blev CSCS genereret fra mus inducerede pluripotente stamceller (iPSCs) ved dyrkning med et konditioneret medium af cancercellelinjer, som var en efterligning af carcinom mikromiljø [12]. Således kunne globale ændringer af transskription signatur gennem direkte omprogrammering eller alternative dyrkningsbetingelser fremme omdannelsen til CSCS. I denne sammenhæng er det muligt, at tvungen ekspression af OSKM i somatiske celler inducerer direkte omprogrammering i CSCS. For at løse de molekylære mekanismer involveret i embryonale stamceller (ES) celler og CSCS, tre funktionelt forskellige gen-sæt, kaldet Core (core pluripotens faktorer), Kina (Polycomb undertrykkende komplekse faktorer), og Myc (Myc-relaterede faktorer) moduler, foreslås nylig blev anvendt til sammenlignende analyser af globale gen aktivitet mellem forskellige typer af celler [9].

Her for at behandle spørgsmål af, om menneskelige induceret cancer stamceller-lignende celler (iCSCs) kan genereres ved somatisk omprogrammering gennem konventionel OSKM viral induktion, og hvordan menneskets iCSCs, men ikke iPSCs, genereres, først vi isoleret iCSCs fra cellepopulationer, som har erhvervet evnen til at forny sig selv efter tvungen udtryk for eksogen OSKM i humane somatiske fibroblaster TIG1. iCSCs har den egenskab pluripotens som verificeret af teratom dannelse via seriel transplantation til immunsvækkede mus. Især den genekspression signatur viste, at iCSCs fortsætter visse somatiske celler hukommelse, selv efter opregulering af pluripotente markørgener gennem omprogrammering. Vores resultater viste, at opregulering af gen sæt til Core og Myc moduler er tilstrækkelig til egenskaberne af selv-fornyelse og pluripotens, og sekventiel nedregulering af gen-apparater for Kina modulet er påkrævet for at installere den korrekte iPSC underskrift på somatiske celler. Disse resultater viser, at iCSCs og iPSCs deler en omprogrammering vej fra somatiske kerner i pluripotente og selvstændige vedvarende kerner, og derefter divergerer til iCSCs eller iPSCs.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Forsøg med mus blev udført i overensstemmelse med den institutionelle retningslinje af Kyoto University, Japan. Vores dyreforsøg (W-3-6) gennemgås og tilladt af dyret forskningsudvalg af Kyoto University, Japan.

Cell kultur

Humane føtale lungefibroblaster (TIG1) leveret af JCRB cellebank blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) (Sigma-Aldrich, USA) indeholdende 10% FBS, og blev inficeret med Oct4, Sox2, Klf4 og c-myc retrovira. På dag 4 efter infektion blev cellerne podet i en 10 cm dyrkningsskål på fødeceller. På dag 5 efter infektion, blev dyrkningsmediet skiftet til iPSC medium (DMEM /Nutrient Mixture F-12 Ham (DMEM /F12) (Sigma-Aldrich) suppleret med 20% af knockout serum udskiftning (Invitrogen, USA), 10 ng /ml bFGF (Peprotech, USA), L-glutamin og ikke-essentielle aminosyrer og 2-mercaptoethanol). Kolonier, som kunne selv forny og udvide, blev samlet op og podet på feeder celler omkring dag 30. For at isolere de menneskelige iPSCs og inducerede epiteliale stamceller (iESCs) blev hver koloni samlet op og reseeded i Matrigelcoatede retter med mus embryonale fibroblast (MEF) -konditioneret iPSC medium.

For embryoid krop (EB) dannelse, blev små iESC aggregater dannet af natten hængende dråbe kultur i MEF-conditioned iPSC medium. Aggregater blev dyrket i bakterielle dyrkningsskåle i 5-7 dage, og derefter dyrket i gelatine-coatede fad med DMEM indeholdende 10% FBS.

I tumor-afledt cellekultur, tumorer blev skåret i små stykker, dissocieret med collagenase, og udpladet på gelatineovertrukne retter med 10% FBS indeholdende DMEM. Etablerede ICSC linjer blev holdt i gelatine-coatede skål med DMEM /F12 (Wako, Japan) suppleret med 15% FBS, 1000 U /ml LIF (Chemicon, USA), L-glutamin, penicillin-streptomycin, natriumbicarbonat, natriumpyruvat, og 2-mercaptoethanol gennemgående passage anvendelse af 0,25% trypsin /EDTA.

RT-PCR

i RT-PCR-analyser blev totalt RNA fra dyrkede celler ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen). cDNA blev syntetiseret ud fra 1 ug totalt RNA med Superscript III (Invitrogen) under anvendelse af vilkårlige hexamerer efter producentens anvisninger. Alle PCR-forsøg blev udført med annealingstemperaturen ved 57 ° C. Primer sekvenser anvendt i denne undersøgelse er opsummeret i tabel S1.

Immuncytokemi

Dyrkede celler blev fikseret med 4% PFA (paraformaldehyd) /PBS (phosphatbufret saltvand) i 10 minutter ved stuetemperatur , vasket med PBST (0,1% Triton X-100 i PBS), derefter forbehandlet med blokerende opløsning (3% BSA og 2% skummetmælk (Difco, USA) i PBST) ved 4 ° C natten over. Cellerne blev inkuberet med primære antistoffer; anti-OCT4 (01:50; Santa Cruz Biotechnology, USA), anti-SOX2 (1:500, Abcam, UK) og anti-NANOG (1:200, ReproCELL, Japan), anti-CDH1 (1:200; TaKaRa , Japan), anti-SSEA4 (1:500, Hybridoma Bank, USA), og anti-TRA-1-60 (1:500; Millipore, USA) antistoffer ved 4 ° C natten over. De blev derefter inkuberet med sekundære antistoffer; anti-kanin IgG eller anti-muse-IgG konjugeret med Alexa 488 (1:500; Molecular Probes, USA) i blokerende buffer i 1 time ved stuetemperatur. Cellerne blev modfarvet med DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindol) og monteret med en SlowFade lys antifade kit (Invitrogen).

Tumordannelse

En celle suspension af 5,0 x 10

5 iESCs eller iCSCs i 200 pi DMEM blev subkutant injiceret i lyskeområdet eller transplanteres ind i nyren kapsler af immundeficiente SCID-mus (Clea, Japan). Tumorer blev kirurgisk dissekeret ud 5-7 uger efter implantation, fikseret med 4% paraformaldehyd i PBS og indlejret i paraffin. Afsnit 5 um i tykkelse blev farvet med hæmatoxylin og eosin.

Microarray og databehandling

For microarray-analyser, blev 1 pg total RNA mærket i henhold til standard Affymetrix protokoller og hybridiseret til Affymetrix humane genom U133 Plus 2.0 Array (prøver af human oprindelse). Rå data blev normaliseret ved MAS 5.0 metoden ved hjælp af biologisk leder pakken på R-programmet (https://www.r-project.org/). Varme kort af genekspressionsprofilen for alle gener i hver cellelinje blev visualiseret ved MeV programmet (https://www.tm4.org/mev/). Hierarkiske klynger blev beregnet ved Pearsons korrelationskoefficient (r) og visualiseret af pvclust pakken på R-program. For scatter plot analyser blev rådata normaliseret ved Robust Multichip Gennemsnitlig (RMA). Scatter plots blev visualiseret ved hjælp af biologisk leder pakken på R-program.

Resultater og Diskussion

Isolering af iESCs og iCSCs

Menneskelige iPSCs blev samlet op som kolonier omkring 30 dage efter retroviral transduktion af Oct4, Sox2, Klf4 og c-myc i de somatiske fibroblaster TIG1, en cellelinie isoleret fra human føtal lunge (fig. 1A). Effektiviteten af ​​iPSC generation var mindre end 1%, og de andre populationer af celler blev differentielt omprogrammeres. Nogle af de forskelligt omprogrammerede somatiske celler viste ejendom selvfornyelse dannede kolonier bestående af celler (iESCs) med epitelcelle morfologi i MEF-condition iPSC medium (fig. 1A). iESCs blev opretholdt med epitelcelle morfologi for omkring 10 passager, da var tilbøjelige til at differentiere (fig. S1A). Derfor, for at analysere differentiering potentiale iESCs blev EB induceret af suspensionskultur (fig. 1B). Succesfuld dannet iESC EB’er viser pluripotens som analyseret ved RT-PCR (fig. 2A) blev fæstnet på bunden til dyrkningsskåle at isolere selvfornyelse stamceller. Derfor blev de første (1.) ICSC linjer isoleret ved plukning celle klumper af udvidede EB’er i tre uafhængige forsøg stabilt opretholdt i mere end 20 passager, eller re-belagte fra frosne-lagrede celler (fig. 1B). For at bekræfte identiteten af ​​de 1st iCSCs blev den anden (2.) iCSCs isoleret fra tumorer genereret af seriel transplantation med injektion af 1st iCSCs ind i lyske regioner af immundefekte SCID mus i to uafhængige forsøg (fig. 1C). Den 2. iCSCs ligner de 1st iCSCs blev stabilt vedligeholdt med træk af epitelcelle morfologi og robust cellevækst i mere end 20 passager (fig. 1C). Dernæst at udforske pluripotens af iESCs, 1st iCSCs, og 2. CSCS blev cellerne transplanteret ind nyre kapsler eller ingvinale områder af SCID-mus. Dannelse af teratomer indeholdende ecotoderm, mesoderm og endoderm derivater blev påvist med hematoxylin og eosin-farvning ved høj frekvens i alle celletyper (fig. 2B), hvilket indikerer, at de tre celletyper var stamceller erhverver pluripotens, trods epitelcelle morfologi.

(A) Generation af iPSCs og iESCs gennem direkte omprogrammering af primære føtale fibroblaster (TIG1). (B) Generation af de første (1.) iCSCs ved at vælge en celle klump (gul cirkel) gennem iESCs-afledte embryoide organer (iESC EB) dannelse. (C) Generation af anden (2.) iCSCs ved at vælge en celle klump (gul cirkel) via seriel transplantation af 1st iCSCs.

(A) Angivelse af eksogene, pluripotente markør, og afstamning markør gener i embryoide legemer (EBS) dannet med iESCs og iPSCs ved RT-PCR-analyser. (B) Paraffinsnit af teratomer, som blev genereret af iESCs, 1. iCSCs, og 2. iCSCs implantation, blev farvet med hematoxylin og eosin. NE, neuroepithelium (ektoderm); CA, brusk (ektoderm); MU, muskel (mesoderm); RE, respiratorisk epitel (endoderm).

Gen-ekspression profil iESCs og iCSCs

For at undersøge genekspression i iESCs og iCSCs, globale genekspression profiler opdaget af genekspression microarray analyser blev sammenlignet. Blandt TIG1, iESCs, 1st iCSCs, og iPSCs, iESCs og iCSCs ligner hinanden. Interessant, iESCs og iCSCs var mere ligner somatiske celler, og TIG1 snarere end menneskelige pluripotente celler (iPSCs og ES-celler), selv med en ensartet høj udtryk for eksogene

Oct4

,

Sox2

,

Klf4

, og

c-myc

(fig. S2 og fig. 3A og 3B). I overensstemmelse med dette, data om zonekort analyser viste, at iESCs opretholdt en mellemtilstand mellem somatiske fibroblaster TIG1 og pluripotente iPSCs (fig. 3A). Mere detaljeret, analyser scatter plot viste, at iESCs, udtryk af somatiske markørgener

MAB21L1

NR2F2

var høj til iPSCs, mens ekspressionen af ​​pluripotente markørgener T

DGF1, NANOG, ZIC2

og

TPD52

ligner iPSCs (fig. 3A). Svarende til iESCs blev 1st iCSCs karakteriseret ved ekspression af nogle somatiske markørgener. RT-PCR-analyser bekræftet, at ekspression af endogene pluripotente markørgener,

OCT4

,

SOX2

,

NANOG

,

REX1

,

LIN28

var naturligvis lav, mens somatisk markørgener,

EMP1

,

PPARy

,

FOXF2

, og

NR2F2

var stærkt til udtryk i 1. og 2. iCSCs (fig. 3A og 3B), hvilket indikerer, at epigenetisk omprogrammering gik halvvejs til at slette den somatiske hukommelse og etablere en pluripotent transskription netværk. Lav ekspression af NANOG blev påvist ved immunocytokemi i 1. og 2. iCSCs, mens høj ekspression af endogent OCT4 /eksogent Oct4 og endogent SOX2 /exogent Sox2 blev påvist (fig. 3C). Immuncytokemi analyser vist, at pluripotente markører CDH1 og SSEA4 svagt blev udtrykt i iESCs og iCSCs, mens højt i iPSCs. Desuden ekspressionen af ​​TRA-1-60 blev påvist i iPSCs, men ikke iESCs og iCSCs (Fig. S3). Kollektivt, iESCs og iCSCs beholdt en cellulær tilstand mellem TIG1 og iPSCs.

(A) Genekspression microarray analyse blandt TIG1, iESCs, iCSCs, og iPSCs. Varme kort (øverste panel) viser differentielt udtrykte gener i somatiske og pluripotente gener. Scatter plots (nederste panel) viser sammenligning af globale genekspression profiler. Gul; gener i Core modul, blå; gener i Kina-modulet, og rød; gen i Myc-modulet. (B) Ekspression analyse af pluripotente markørgener, somatiske celle markørgener, og exogene gener i TIG1, iPSCs, iESCs, 1. iCSCs, og 2. iCSCs ved RT-PCR-analyser. (C) Angivelse af pluripotente markørproteiner (grøn) i iESCs, 1. iCSCs, og 2. iCSCs ved immuncytokemi. Cellekerner modfarves blå med DAPI (blå). Exo-, exogent; Endo-, endogene.

Acquisision af pluripotens før etableringen af ​​iPSC identitet

I processen med omprogrammering somatiske celler i iPSCs, celler gradvist ændre deres ekspressionsmønstre og morfologi. Således at sammenligne genekspressionsprofiler af forskellige typer omprogrammering celler, et integreret system til udtryk profiler, hvad angår kinetikken af ​​moduler, er påkrævet. Tre ES celle moduler, Core, Kina, og Myc (CPM), som er funktionelt adskilles, er blevet defineret [9]. Core modul indeholder kendte faktorer i kernen regulerende kredsløb, såsom

NANOG, OCT4, SOX2, TCF3

, og

REX1

. PRC Modulet indeholder gen generelt undertrykt i ES-celler, herunder

HOX

klynge gener. Den Myc Modulet består af gener, der er fælles mål for syv faktorer, myc MAX, NMYC, DMAP1, E2F1, E2F4, og ZFX. Desuden blev ES-celle-lignende modul defineret til at skelne mellem ES-celler, voksne væv stamceller og humane cancere [13]. Her viser vi data med CPM-moduler, da analyse med data fra ES-celle-lignende modul blev sammenlignelig med data for Core modul af CPM-moduler, som omfattede pluripotente markørgener.

For at omprogrammere TIG1 ind iESCs, opregulering af Core og Myc modulerne var påkrævet (fig. 4 og fig. S4). iESCs og iCSCs var præget af den høje aktivitet i Kina og Myc moduler, mens Core modul var høj i iESCs og lav i iCSCs. Det var afgørende at indføre en barriere til sletning somatisk hukommelse, Kina modulet bibeholdt høj aktivitet i alle TIG1, iESCs, og iCSCs som det fremgår af

FOXF2

NR2F2

(fig. 3A). For at blive fuldt omprogrammeres i iPSCs fra TIG1, induktion af nedregulering af Kina-modulet var nødvendig (fig. 4 og fig. S4), hvilket indikerer, at færdiggørelsen af ​​etableringen af ​​IPSC-transkriptionel netværk er forbundet med nedregulering af Kina-modulet.

Egenskaber af selv-fornyelse og pluripotens er forbundet med forbigående eller kontinuerlig opregulering af Core og Myc moduler, men ikke Kina modul. C, Core modul; P, PRC modul; M, Myc modul.

Stabile cellelinjer, TIG1, ICSC, og iPSC, var præget af gensidig aktivitet af Core og Kina moduler, mens ustabile iESCs viste samtidig opregulering af de to moduler , hvilket tyder på, at gener kategoriseret i de to moduler fungerede konkurrencedygtig i omprogrammering. Især købet af selv-fornyelse og pluripotens var forbundet med opregulering af Core og Myc, men ikke Kina, moduler (fig. 4). Disse data viste, at ejendommen selv-fornyelse og pluripotens kunne tillægges somatiske kerner før fuld omprogrammering i iPSCs. Konstateringen af, at en bestemt celle population af iESCs blev omprogrammeret i iPSCs spontant støttede dette begreb (fig. S1B). Kriterierne for selv-fornyelse og pluripotens er almindeligt brugt til at definere menneskelige iPSCs. Dog kan den egenskab at selv-fornyelse og pluripotens tillægges en række celletyper gennem omprogrammering mere end forventet, og det er nødvendigt, men ikke tilstrækkeligt, til at definere iPSC identitet.

For at omprogrammere somatiske celler til iCSCs, opregulering af Myc-modulet er en central begivenhed. Promotorområder bundet af MYC er forbundet med histon H3 lysin4 trimethylation (H3K3me3), som er positivt korreleret med dannelsen af ​​åbne chromatin, og genaktivering som en epigenetisk signatur [9]. Endvidere MYC interagerer med histonacetyltransferaser, som er forbundet med transkription aktivering komplekser [14]. Myc-modulet letter cellestofskiftet ved at aktivere generelle gener. Gener i Core-modulet er også opreguleret gennem somatisk omprogrammering til iCSCs.

OCT4

,

SOX2

, og

NANOG

, som er centrale Core modul spillere, undertrykke udviklingsmæssigt vigtige homeodomæneproteiner gennem co-besættelse af deres målgener, mens fremme selv- fornyelse og pluripotens ved positiv regulering af gener, der koder komponenter af centrale signalveje [15]. Under disse i betragtning, Core og Myc modulerne spiller en rolle i giver funktionerne i selv-fornyelse og pluripotens på somatiske kerner, mens fortsat høj aktivitet i Kina modul i TIG1, iESCs, og iCSCs hindrer nulstilling af somatiske hukommelse af nogle udviklingsmæssigt vigtige homeodomæneproteiner (fig. 4). Polycomb undertrykkende komplekser, især Polycomb undertrykkende kompleks 2, der indeholder EZH2, Eed, og Suz12, er afgørende repressorer af gener i forbindelse med H3K27me3 [16]. For at nulstille den somatiske hukommelse af gener med en homeodomæne i iESCs og iCSCs og over-skrive ES celle-lignende epigenetisk signatur i de omprogrammerede kerner af iESCs bør aktiviteten af ​​Kina modulet kontinuerligt eller forbigående reduceres. Relativt nedsat aktivitet i Kina modulet kan være en central begivenhed for omprogrammering somatiske celler til iPSCs. Det er spekuleret at manglende H3K27me3 spiller en vigtig rolle i at fremme omprogrammering fra præ-iPSCs til iPSCs i den sene fase af omprogrammering [17]. Den skæbne af somatiske celler, uanset om de omprogrammeres til iCSCs eller iPSCs, kunne bestemmes ved aktivitet i Kina modulet, efter at erhverve evnen til selv-fornyelse og pluripotens (fig. 4).

Støtte Information

Figur S1.

Spontan differentiering af iESCs og konvertering til iPSCs. (A) Differentiering af iESCs efter langvarig kultur. (B) Konventionel iPSCs (højre panel) blev genereret fra en lille koloni (gul cirkel i venstre panel), der optræder i iESC kultur ved høj celletæthed

doi:. 10,1371 /journal.pone.0048699.s001

(TIF )

Figur S2.

Global genekspression analyse af iESCs og iCSCs. Komparativ analyse af globale genekspression profil i iPSC, humane embryonale stamceller (ES) celle, iESC, 1. ICSC, og TIG1 linjer ved genekspression microarray analyse

doi:. 10,1371 /journal.pone.0048699.s002

( TIF)

Figur S3.

Ekspression af pluripotente markørproteiner i iESCs og iCSCs. Ekspression af markør celleoverfladeproteiner, CDH1, SSEA4, og TRA-1-60 blev detekteret som grøn fluorescens, mens cellekerner var som blå med DAPI

doi:. 10,1371 /journal.pone.0048699.s003

( TIF)

Figur S4.

Gennemsnitlige genekspression værdier (log2) af CPM-moduler i i somatiske celler og pluripotente stamceller

doi:. 10,1371 /journal.pone.0048699.s004

(TIF)

tabel S1.

Primere for RT-PCR-analyser

doi:. 10,1371 /journal.pone.0048699.s005

(DOC)