PLoS ONE: miR-203 Hæmmer Cell Proliferation og Migration af Lung Cancer Cells ved Målretning PKCα

Abstrakt

PKCa (protein kinase C alpha, PRKCA) er en vigtig protein involveret i flere trin af signalveje i lunge cancer, og microRNAer (miRNA) har også vist sig at deltage i lunge carcinogenese. Det er imidlertid ikke klart, hvordan PKCa og miRNA er korreleret i sygdommen. I denne rapport, vi havde til formål at identificere nye miRNA, der er målrettet PKCa og studere deres biologiske funktion. Ved hjælp af bioinformatik analyse, vi forudsagde en roman kandidat, miR-203, og fandt differentielle ekspressionsmønstre af miR-203 og PKCa i humane lunge cancer væv. Desuden har vi eksperimentelt valideret MIR-203 som en direkte regulator af PKCa. Endelig demonstrerede vi, at målretningen af ​​PKCa ved MIR-203 spillet en afgørende rolle i reguleringen af ​​celleproliferation, apoptose og migration i lungecancerceller. Sammenfattende denne undersøgelse identificerer en roman miRNA, der er målrettet PKCa og illustrerer, at nedregulering af PKCa af miR-203 modulerer biologiske processer lungekræft celler

Henvisning:. Wang C, Wang X, Liang H, Wang T , Yan X, Cao M, et al. (2013) miR-203 Hæmmer Cell Proliferation og migration af Lung Cancer Cells ved Målretning PKCa. PLoS ONE 8 (9): e73985. doi: 10,1371 /journal.pone.0073985

Redaktør: Jun Li, Sun Yat-sen University Medical School, Kina

Modtaget: April 8, 2013; Accepteret: 24 juli 2013; Udgivet 10. september, 2013 |

Copyright: © 2013 Wang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra National Natural Science Foundation of China (nr. 81.101.330, 31.271.378, 81.250.044 og J1103512) og Natural Science Foundation i Jiangsu-provinsen (nr. BK2011013 og BK2012014). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

lungekræft er den hyppigste årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan, og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) tegner sig for ca. 80% af alle tilfælde [1]. Størstedelen af ​​lungekræft (56%) er diagnosticeret på et fjernt tidspunkt fordi tidlig sygdom er typisk asymptomatisk; kun 15% af tilfældene er diagnosticeret på en lokal scene [2]. Faktisk patienter med lungekræft udviser ofte tumorcelleinvasion og metastase før diagnose som gør nuværende behandlinger, herunder kirurgi, strålebehandling og kemoterapi ineffektiv. Den samlede 5-års overlevelsesrate for ikke-småcellet lungekræft er meget lav (17,1%). Derfor er afgørende for designe nye terapeutiske midler, der vil forbedre overlevelsesraten studere den molekylære basis for lungekræft.

Protein kinase C (PKC) er en serin /threonin-kinase, som spiller en central rolle i flere signaltransduktion veje, herunder dem, der er involveret i cellulær proliferation, differentiering og apoptose [3-5]. Den PKC familien indeholder 10 relaterede isoformer med forskellige cofaktor krav, væv og subcellulær fordeling, og substrat specificitet [6]. Familien er opdelt i konventionelle (cPKCs: α, βI, βII, og γ), roman (nPKCs: δ, ε, η, og θ), og atypisk (aPKCs: f-og ι /Å-) underklasser. PKC, herunder PKCa (PRKCA), spiller en rolle i lungekræft. Niveauet af PKCa protein er betydeligt højere i NSCLC cellelinier (H1355, A549, H1703, H157, og H1155) ved sammenligning med primære humane lunge epiteliale celler (NHBE); derfor kan øget PKCa ekspression være et generelt træk ved NSCLC-celler [7]. Der har været flere rapporter om rolle PKCa i cellulær proliferation, apoptose og migration af lungekræft celler. PKCa er blevet vist at binde og phosphorylere stilladset protein diske stor homologe 1 (DLG1) og fremmer cellemigration i NSCLC-celler [8]. Derudover, undertrykkelse af PKCa øger cytotoksicitet og mutagenicitet blyacetat (Pb) -behandlede CL3 humane lungecancerceller [9]. Staurosporin, et potent PKC-inhibitor, kontrollerer celleadhæsion, mobilitet og invasion af A549-celler [10]; IL1-beta inducerer ekspressionen af ​​urokinase plasminogen aktivator (uPA) via PKCa, hvilket fører til migration af A549 NSCLC-celler [11].

microRNA (miRNA) er kritiske regulatorer af genekspression [12,13] . Modne miRNA binder target mRNA’er på komplementære steder i 3′-utranslaterede regioner (3′-UTR’er) eller i de kodende sekvenser og derved undertrykke ekspressionen af ​​målgenet [14,15]. miRNA er dereguleret i human lungekræft og spiller en vigtig rolle i carcinogenese [16]. For eksempel er lav ekspression af lad-7a og høj ekspression af MIR-17-92 klynge forbundet med en dårlig klinisk resultat i lungecancer [17,18]. MIR-34 familien er også undertrykt i kræft og er involveret i p53-associeret tumor undertrykkelse i mange kræftformer [19-23], herunder lungekræft [24]. Disse resultater understreger behovet for en dybtgående søgen efter miRNA afvigende udtryk under lunge carcinogenese, der kan spille kritiske roller i regulering lungekræft vækst eller tumorigenese.

Selv om deregulering af miRNA og PKCa spille vigtige roller i lunge carcinogenese , ingen korrelation mellem PKCa og miRNA er blevet rapporteret. I denne undersøgelse, vi ser for miRNA, der kunne målrette PKCa og indflydelse cellulære funktion.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Den lungekræft og matchede normale tilstødende vævsprøver var stammer fra patienter, der gennemgår et kirurgisk indgreb på Nanjing Drum Tower Hospital (Nanjing, Kina). Alle patienterne eller deres værger forudsat skriftligt samtykke og den etiske komité fra Nanjing Universitet og Nanjing, Drum Tower Hospital godkendt alle aspekter af denne undersøgelse. Vævsfragmenter blev straks nedfrosset i flydende nitrogen på tidspunktet for kirurgi og opbevaret ved -80 ° C. Frosne væv blev homogeniseret og total RNA blev ekstraheret under anvendelse af TRIzol Reagens (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. De kliniske funktioner i patienter er anført i tabel 1.

Alder

Køn

Patologisk Stage

Tumor Hystotype

148MIIIA (T2b, N2, CMO) planocellulært Carcinoma270FIA (T1b, Nej, CMO) Adenocarcinoma362FIIB (T3, nej, CMO) Adenocarcinoma455FIIIA (T3, N2, Mo) Adenocarcinoma567MIB (T1, nej, Mo) Adenocarcinoma649MIV (T4, N2, M1a) AdenocarcinomaTable 1. De kliniske træk ved patienter med lungecancer.

CSV Hent CSV

Cells, reagenser og antistoffer

Humane lungeadenokarcinom A549 celler blev købt fra Kina Cell Culture center (Shanghai, Kina). Cellerne blev holdt i Dulbeccos modificerede Eagle-medium (DMEM; Gibco, CA, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og blev dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære med 5% CO

2. Syntetiske RNA-molekyler, herunder pre-MIR-203, og den krypterede ikke-kodende RNA (ncRNA) blev indkøbt fra Ambion (Austin, TX, USA). Anti-PKCa (H-7) og anti-GAPDH (6C5) antistoffer blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (CA, USA). Celletælling Kit-8 blev købt fra Dojindo (Japan). FITC-Annexin V Apoptose Detektion Kit I opnåedes fra BD Biosciences (CA, USA).

miRNA og siRNA transfektion

MIR-203 overekspression blev opnået ved transfektion af celler med præ-miR- 203, et syntetisk RNA-oligonukleotidet, der efterligner mIR-203-precursor, og en ncRNA tjente som en negativ kontrol. Tre siRNA sekvenser rettet mod forskellige steder af humant PKCa cDNA (si-PKCa) blev designet og syntetiseret ved Invitrogen. En krypteret siRNA, der ikke målrette humant PKCa cDNA blev inkluderet som en negativ kontrol. siRNA-sekvenser var som følger: si-PKCa # 1: 5′-GGAUGUGGUGAUUCAGGAU-3 ‘(sense); si-PKCa # 2: 5’-GCAAAGGACUGAUGACCAA-3 ‘(sense); si-PKCa # 3: 5’-AAGCUCCAUGUCACAGUACGA-3 ‘(sense)

A549-celler blev podet i plader med 6 brønde og blev transficeret den følgende dag under anvendelse af lipofectamin 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. . For hver brønd, lige store doser (100 pmol) af krypterede ncRNA, præ-MIR-203, krypteret siRNA, eller si-PKCa blev tilsat. Celler blev høstet 24 timer efter transfektion. Ekspressionsniveauet af MIR-203 blev analyseret ved kvantitativ RT-PCR, mens PKCa proteinniveau blev bedømt ved Western blot ved anvendelse af et antistof mod PKCa. Disse prøver blev normaliseret ved blotting med et antistof mod GAPDH. Den ImageJ software blev anvendt til at kvantificere protein niveauer. Den siRNA sekvens med de bedste forstyrrende effekt (si-PKCa # 3) blev valgt og anvendt i yderligere undersøgelser.

Overekspression af PKCa

Et pattedyr ekspressionsplasmid der koder for den menneskelige PKCa åbne læseramme uden 3′-UTR blev købt fra Invitrogen. En tom plasmid tjente som en negativ kontrol. Den PKCa overekspression plasmid blev transficeret i A549-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner.

RNA-isolering og kvantitativ RT-PCR

Totalt RNA blev ekstraheret fra de dyrkede celler under anvendelse af TRIzol reagens (Invitrogen) ifølge producentens instruktioner. Til kvantitativ RT-PCR-analyse af PKCa og p-actin-transskripter, 1 ug totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA under anvendelse af et oligdT og Thermoscript Reverse Transcriptase (Takara, Dalian, Kina). Real-time PCR for PKCa og p-actin-transskripter blev udført på en Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) under anvendelse SYBR green dye (Invitrogen). PCR reaktioner blev udført i et 20 pi reaktion, herunder 1 pi cDNA, 1 × QuantiTect SYBR green PCR Master Mix, og 0,5 uM sense- og antisense-primere. Reaktionerne blev inkuberet i en 96-brønds plade ved 95 ° C i 5 minutter, efterfulgt af 40 cykler ved 95 ° C i 30 s, 60 ° C i 30 s og 72 ° C i 30 s. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt. Efter reaktionerne blev kørt, blev de tærskelværdier cyklusser (C

T) bestemmes ved hjælp af faste tærskelindstillinger. Sekvenserne af sense- og antisense-primere anvendt til amplifikation af PKCa og β-actin var som følger: PKCa (sense): 5′-GTGGCAAAGGAGCAGAGAAC-3 ‘; PKCa (antisense): 5’-TGTAAGATGGGGTGCACAAA-3 ‘; β-actin (sense): 5’-AGTACTTCCTC TGCCCTGCTGCAG-3 ‘; β-actin (antisense):. 5’-AGGGCAGGCAGCGTATATACAGGA-3 ‘

Assays at kvantificere modne MIR-203 blev udført under anvendelse Taqman microRNA prober (Applied Biosystems) ifølge producentens anvisninger. Kort fortalt, 1 ug samlet RNA blev revers-transkriberet til cDNA under anvendelse af AMV revers transkriptase (Takara) og en hårnåle-RT-primer (Applied Biosystems). Real-time PCR blev udført under anvendelse af et TaqMan PCR-kittet på et Applied Biosystems 7300 Sequence Detection System (Applied Biosystems). Alle reaktioner, herunder ingen skabelon kontrol, blev kørt i tre eksemplarer. Efter reaktionerne var C

T-værdier blev bestemt under anvendelse af fast tærskelværdi indstillinger. I eksperimenterne er præsenteret her, var miRNA i cellerne normaliseret til ekspressionen af ​​U6 snRNA. Den relative mængde af MIR-203 til det indre U6 bekæmpelse blev beregnet ved anvendelse af ligning 2

-ΔCT, hvor ΔC

T = C

T MIR-203-C

T U6.

miRNA target forudsigelse

De miRNA, der kan målrette PKCa blev bestemt ved hjælp af algoritmer fra Targetscan (https://genes.mit.edu/targetscan/) [25], PicTar (http: //pictar .bio.nyu.edu /) [26], og Miranda (https://cbio.mskcc.org/cgi-bin/mirnaviewer/mirnaviewer.pl) [27].

Plasmidkonstruktion og luciferaseanalyse

en delvis sekvens af det humane PKCa 3′-UTR, som omfatter den forudsagte mIR-203 bindingssteder, blev syntetiseret ved Invitrogen, med en ekstra 3′-phosphorylering modifikation. Sekvensen var som følger: PKCa 3′-UTR (sense): 5′-CTAGTTCTAAGGACGTTGCTGAACAAGCGTGTGAAATCATTTCAGATCAAGGATAAGCCAGTGTGTACATATGTA-3 ‘; PKCa 3′-UTR (antisense): 5’-AGCTTACATATGTACACACTGGCTTATCCTTGATCTGAAATGATTTCACACGCTTGTTCAGCAACGTCCTTAGAA-3 ‘. En dobbeltstrenget molekyle blev dannet ved annealing af disse to enkelte kæder ved 60 ° C, og denne duplex blev indsat i p-MIR-rapport plasmid (Ambion). Effektiv insertion blev bekræftet ved sekventering. For luciferase reporter assays celler blev dyrket i plader med 6 brønde, og hver brønd blev transficeret med 2 pg ildflueluciferase reporterplasmid, 2 ug β-galactosidase-ekspressionsvektor (Ambion), og ens mængder af krypterede ncRNA eller præ-miR- 203 under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen). Den β-galactosidase-vektor blev anvendt som en transfektion kontrol. Celler blev analyseret under anvendelse af luciferase assay kits (Promega, Madison, WI, USA) 24 timer efter transfektion. De rapporterede data repræsenterer tre uafhængige forsøg.

Cell levedygtighed assay

levedygtighed A549 celler blev bestemt ved anvendelse af Cell Counting Kit-8 (Dojindo), i henhold til producentens anvisninger. Kort beskrevet blev A549-celler udpladet ved 5,0 x 10

3 celler per brønd i plader med 96 brønde og inkuberet natten over i DMEM-medium suppleret med 10% FBS. Efter transfektion blev 10 pi CCK-8 væske tilsat til test brønd og inkuberet i 3 timer. Absorbans (

A

) blev derefter målt ved en bølgelængde på 450 nm.

cellemigrationsassay

Migrationen evne A549 celler blev testet ved hjælp af en Transwell Boyden Chamber (6,5 mm, Costar, Cambridge, MA). Celler blev behandlet med ncRNA, præ-MIR-203, eller siRNAs i 6 timer og blev suspenderet i serumfrit DMEM-medium i en koncentration på 4 x 10

5 celler /ml; derefter, 4 × 10

4 celler /brønd blev tilsat til det øvre kammer. Samtidig 0,5 ml DMEM suppleret med 10% FBS blev tilsat til det nedre rum, og Transwell-holdige plader blev inkuberet i 18 timer i en CO 5%

2 atmosfære mættet med H

2O. Ved slutningen af ​​inkubationen de celler, der var kommet ind i nedre overflade af filtermembranen (vandrende celler) blev fikseret med 4% paraformaldehyd i 15 minutter ved stuetemperatur; cellerne blev derefter vasket tre gange med destilleret vand og farvet med 0,1% krystalviolet i 15 minutter ved stuetemperatur. Cellerne tilbage på den øvre overflade af filtermembranen (ikke-vandrende) blev forsigtigt skrabet med en vatpind. Billeder af vandrende celler blev taget med et fotomikroskop (BX51, Olympus, Japan). Celle migration blev kvantificeret ved blind tælling af migrerede celler på den nedre overflade af membranen; fem felter blev talt pr kammer.

Cell apoptose assay

Fireogtyve timer efter transfektion med ncRNA, præ-MIR-203, eller siRNA blev A549-celler behandlet med 200 pM hydrogenperoxid ( H

2O

2) i 30 min for at inducere apoptose. I henhold til fabrikantens anvisninger af FITC-Annexin V Apoptose Detektion Kit I (BD Biosciences) blev cellerne derefter vasket to gange med koldt PBS og resuspenderet i 1 × bindingspuffer i en koncentration på 1 × 10

6 celler /ml . Celler (1 x 10

5-celler) blev overført til en 5 ml kultur rør, og FITC-Annexin V og propidiumiodid (PI) blev tilsat. Cellerne blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur i mørke og blev analyseret ved flowcytometri (BD Biosciences) inden for 1 time af farvning.

Statistisk analyse

Alle billeder af Western blotting, celle apoptosis assays og migration assays var repræsentative for mindst tre uafhængige forsøg. De viste data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse (S.D.). En 2-tailed Students

t

test blev anvendt til sammenligninger, og en

s

værdi. 0,05 blev betragtet som signifikant

Resultater

Prediction af miRNA, der kan målrette PKCa

Ved hjælp af tre miRNA target forudsigelse programmer (Targetscan, PicTar og Miranda), vi forudsagde, at miR-203 mål i PKCa mRNA udskrift.

forudsete vekselvirkninger mellem mIR-203 og dets målsteder i PKCa 3′-UTR er illustreret i figur 1A. Som vist i denne figur, er der en potentiel MIR-203 målområde i 3′-UTR af PKCa-mRNA-sekvens. De minimale fri energi værdier af disse interaktioner er -27,6 kcal /mol, som bestemt ved RNA hybrid-analyse [28]. Endvidere blev perfekt baseparring mellem frøet region (kernesekvensen, der omfatter de første 2-8 baser af det modne miRNA) og de beslægtede mål bemærket (figur 1A), og MIR-203 bindende sekvenser i PKCa 3′- UTR er stærkt konserverede på tværs af arter (figur 1B).

A, skematisk beskrivelse af hypoteserne duplexer dannet af interaktionerne mellem de PKCa 3′-UTR-bindingssteder og mIR-203. Den forudsagte struktur af baseparret hybrid afbildet. Forbundne baser er angivet med en

sorte linje

, og G: U-par er angivet med

tre prikker

. Den forudsagte frie energi af hybriden er angivet. B, sekvensliniestilling af det formodede MIR-203 bindingssteder på tværs af arter. De frø supplerende lokaliteter er markeret i

rød

, og alle nukleotider i regionerne er bevaret i flere arter, herunder menneske, mus og rotter.

Differential ekspressionsmønstre af miR-203 og PKCa i humane lungecancer væv

miRNA er generelt menes at negativt regulere ekspressionen af ​​deres mål gennem translationel undertrykkelse eller mRNA nedbrydning [29,30]. Derfor, hvis en miRNA medierer nedbrydningen af ​​dets målrettede mRNA’er bør denne miRNA og dens mål har modsatte ekspressionsmønstre. Baseret på dette, vi undersøgte udtrykket mønstre af miR-203 og PKCa i de samme 6 par lungekræft og tilsvarende noncancerous vævsprøver. Ved brug af kvantitativ real-time PCR-analyse påviste vi, at ekspressionen af ​​MIR-203 var signifikant lavere i humane lunge cancer væv end i de tilstødende normale væv (figur 2A); i modsætning hertil PKCa-mRNA-ekspression blev mærkbart højere i cancerceller (figur 2B).

A, kvantitativ real-time PCR-analyse af den relative MIR-203-ekspression i 6 par lungekræft væv (LCT) og noncancerous væv (NCT) prøver. B, kvantitativ real-time PCR-analyse af den relative PKCa-mRNA-niveau i de samme 6 par LCT og NCT prøver. Resultaterne i A, og B er præsenteret som middelværdi ± S.D. af tre uafhængige forsøg (*,

s

0,05; **

s

0,01)

Validering af PKCa regulering af miR-203

for yderligere validering, humane lungeadenocarcinom A549-celler blev transficeret med ncRNA eller præ-mIR-203, og cellerne blev analyseret for ekspression af mIR-203 ved kvantitativ RT-PCR 24 timer efter transfektion. Alle celler, som blev transfekteret med præ-MIR-203 viste en signifikant forøget ekspression af det modne MIR-203 (figur 3A). For at afgøre, om overekspression af miR-203 havde nogen effekt på niveauerne af PKCa, vi gentog ovennævnte eksperimenter og undersøgt ekspressionen af ​​PKCa protein og mRNA 24 timer efter transfektion. Som vist i figur 3B, blev ekspressionen af ​​PKCa-protein signifikant reduceret med indførelsen af ​​præ-MIR-203, hvorimod celler transficeret med scrambled ncRNA opretholdt en betydelig mængde PKCa protein. Tilsvarende celler transficeret med præ-MIR-203 havde nedsat mængde PKCa-mRNA i forhold til celler transficeret med ncRNA (figur 3C). Hos dyr er miRNA menes at virke hovedsageligt gennem translationel undertrykkelse snarere end mRNA spaltning [30], men nye undersøgelser viser, at metazo miRNA kan reducere niveauerne af mange af deres mål udskrifter, ikke kun mængden af ​​protein afledt af disse udskrifter [31 ]. Vores data tyder på, at miR-203 regulerer ekspressionen af ​​PKCa på både Udskriften og protein niveauer, og i betragtning af større fald i PKCa protein, kan det handle mere på translationel undertrykkelse end mRNA nedbrydning.

A, overekspression af miR -203. A549-celler blev podet i en 6-brønds plade og transficeret den følgende dag. For hver brønd, 100 pmol krypteret ncRNA eller præ-MIR-203 blev tilsat. Niveauerne af MIR-203 blev vurderet ved kvantitativ RT-PCR 24 timer efter transfektion. Til sammenligning blev ekspressionsniveauerne af MIR-203 i ncRNA-transficerede celler sat til 1.

y

-aksen viser arbitrære enheder, der repræsenterer de relative MIR-203 ekspressionsniveauer. Resultaterne er præsenteret som gennemsnittet ± S.D. af tre uafhængige forsøg (***

s

0,001). B, Immunblot for endogen PKCa protein i A549-celler, der enten var mock transficeret eller transficeret med ncRNA eller præ-MIR-203 i 24 timer. GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Billeder af Western blot-assay blev analyseret ved anvendelse af ImageJ software, og en statistisk analyse er vist i det højre panel (middelværdi ± standardafvigelse .; **

s Restaurant 0,01). C, kvantitativ RT-PCR-analyse af PKCa-mRNA-niveauer i A549-celler behandlet med røræg ncRNA eller præ-MIR-203.

y

aksen viser relative PKCa mRNA-niveauer normaliseret til niveauerne af β-actin (gennemsnit ± standardafvigelse .; *,

s

0,05). D, direkte erkendelse af PKCa 3′-UTR af miR-203. Enten vildtype (wt) eller mutant (mut) MIR-203-bindingssteder (den sekvens, der interagerer med 2-8 baser af MIR-203 blev muteret) i PKCa 3′-UTR er afbildet. Ildflueluciferase reportere indeholdende enten vildtype (wt) eller mutant (mut) human PKCa 3′-UTR blev co-transficeret i A549-celler sammen med røræg ncRNA, eller præ-MIR-203. Ved 24 timer efter transfektion blev cellerne analyseret under anvendelse af et luciferase-assay kit. Ildflueluciferase værdier blev normaliseret til p- galactosidase aktivitet og afbildet som relativ luciferaseaktivitet. Til sammenligning blev luciferaseaktiviteten i ncRNA-transficerede celler sat som 1. Resultaterne er præsenteret som gennemsnit ± S.D. af tre uafhængige forsøg (**

s

0,01).

PKCa er et direkte mål for miR-203

For at afgøre, om de negative regulatoriske virkninger mIR-203 udøves på PKCa-ekspression blev medieret gennem binding af mIR-203 til de formodede sites i 3′-UTR af PKCa-mRNA, kondenseret vi del af PKCa 3′-UTR, som omfatter den forudsagte mIR-203 binding sites nedstrøms for ildflueluciferase reporterplasmidet. Det resulterende plasmid blev indført i A549-celler sammen med en transfektion kontrol plasmid ekspressionsvektorer β-galactosidase og præ-MIR-203 eller den krypterede ncRNA. Som forventet overekspression af MIR-203 resulterede i et signifikant fald i luciferase reporter aktiviteten, som blev normaliseret til p- galactosidaseaktivitet, sammenlignet med celler behandlet med scrambled ncRNA (figur 3D). Derudover introducerede vi punktmutationer i tilsvarende frø komplementære steder i PKCa 3′-UTR at fjerne den forudsagte miR-203 bindingssted. Som vist i figur 3D, mutationer i de komplementære frø sites næsten fuldt reddet undertrykkelsen af ​​reporter-aktivitet forårsaget af ekspression af præ-MIR-203. Dette antyder, at bindingsstedet bidrager kraftigt til miRNA: mRNA interaktion, der medierer posttransskriptionel inhibering af PKCa ekspression. Afslutningsvis vores resultater viser, at MIR-203 direkte genkender 3′-UTR af PKCa-mRNA-transkriptet og binder til det at nedregulere dets ekspression.

rolle MIR-203 medieret PKCa nedregulering i celleproliferation, apoptose, og celle migration

for at undersøge de cellulære fænotyper udløst af miR-203 medieret nedregulering af PKCa, A549 celler blev transficeret med enten præ-miR-203 eller si-PKCa og analyseret for ændringer i celleproliferation, apoptose og migration.

som vist i figur 4A, mest effektive interferens af PKCa ekspression kan opnås ved si-PKCa # 3 (opkaldt si-PKCa bagefter) transfektion, sammenlignet med kontrollen siRNA. Vi bestemt de spredning satser A549 celler med nedsat ekspression af PKCa eller overekspression af miR-203 ved hjælp af Cell Counting Kit-8. I modsætning til kontrol siRNA-transficerede celler, celler transficeret med si-PKCa prolifererede til en meget lavere pris (figur 4B). Endvidere blev en signifikant forskel blev observeret i de proliferationshastigheder mellem cellerne transficeret med ncRNA og præ-MIR-203 (figur 4C).

A, validering af siRNA mod PKCa. Tre siRNA’er rettet mod forskellige steder i humant PKCa cDNA og en kodet kontrol siRNA blev transficeret ind A549-celler under anvendelse af Lipofectamine 2000. Western blot-analyse viser PKCa proteinniveauer ved 24 timer efter transfektion. Normaliseret kvantificering af immunoblots blev udført fra uafhængige forsøg. Data er præsenteret som gennemsnit ± S.D. (**

s

0,01). B, cellelevedygtighed assay på 12, 24, 36, og 48 timer efter transfektion af A549-celler med lige store doser af kontrol siRNA eller si-PKCa, eller C, lige store doser af krypterede ncRNA eller præ-MIR-203 (middelværdi ± SD; **

s

0,01). D, Western blot-analyse af proteinniveauet af PKCa i A549-celler transficeret med ncRNA, præ-MIR-203, eller præ-MIR-203 plus PKCa overekspression plasmid, og en statistisk analyse er vist i det højre panel (middelværdi ± SD; **

s

0,01). E, Immunblot for PKCa protein i A549-celler, der enten var mock transficeret eller transficeret med PKCa overekspression plasmid. F, cellelevedygtighed assay på 12, 24, 36, og 48 timer efter transfektion af A549-celler med ncRNA, præ-MIR-203, præ-MIR-203 plus PKCa overekspression plasmid, eller PKCa overekspression plasmid alene (middel ± SD; * *

s

0,01; ***

s

. 0,001)

Efterfølgende undersøgte vi, om overekspression af PKCa er tilstrækkelig til at vende den hæmmende virkninger af miR-203 på PKCa og biologiske processer i lungekræft celler. Et plasmid konstrueret til specielt at udtrykke den åbne læseramme i fuld længde (ORF) af PKCa uden MIR-203-responsive 3′-UTR blev konstrueret og transficeret ind i præ-MIR-203 transficerede A549-celler. Sammenlignet med celler transficeret med præ-MIR-203 cellerne transficeret med præ-MIR-203 og PKCa overekspression plasmid udviste signifikant højere niveauer af PKCa (figur 4D), hvilket antyder, at MIR-203-resistente PKCa reddede PKCa undertrykkelse forårsaget af mIR-203. Celler transficeret med PKCa overekspression plasmid alene viste også mere ekspressionsniveauet af PKCa sammenlignet med celler transficeret med et tomt plasmid kontrol (figur 4E). Følgelig overekspression af PKCa reddet MIR-203 medieret nedregulering af proliferationshastigheder af A549-celler (Figur 4F). Disse resultater antyder, MIR-203 kunne inhibere celleproliferation med lyddæmpende PKCa.

Efter A549-celler blev transficeret med præ-MIR-203, ncRNA eller si-PKCa i 24 timer, de blev behandlet med 200 pM hydrogen peroxid i 30 minutter for at inducere apoptose. Vi undersøgte derefter apoptose i celler med en forøget MIR-203-ekspression eller tavshed PKCa ved flowcytometri analyse. Sammenlignet med celler transficeret med ncRNA, procentdelen af ​​apoptotiske celler i pre-MIR-203 transfektion var væsentligt højere, fra 7,64% til 14,01%, henholdsvis (figur 5). Sammenlignet med celler transficeret med kontrol siRNA, transfektion med si-PKCa lidt, men ikke signifikant, forøges procentdelen af ​​apoptotiske celler, fra 7,98% til 10,16%, henholdsvis. Disse resultater antyder, MIR-203 kan fremme celle apoptose, men denne virkning kun delvis er afhængig af sin nedregulering af PKCa.

A549-celler blev transficeret med lige store doser af krypterede ncRNA eller præ-MIR-203, eller ens doser af kontrol siRNA eller si-PKCa. Celleapoptose profiler blev analyseret ved flowcytometri. Den biparametriske histogram viser celler i tidlige (nederste højre kvadrant) og sene apoptotiske tilstande (øverste højre kvadrant). Levedygtige celler er dobbelt negativ (nederste venstre kvadrant). Forsøget blev gentaget tre gange, og en statistisk analyse vises i højre panel (gennemsnit ± SD; **

s

0,01)

Vi vurderede rolle. mIR-203 i cellemigrering under anvendelse Transwell assay. Som vist i figur 6A, blev vandringshastigheden af ​​A549-celler transficeret med præ-MIR-203 faldt betydeligt sammenlignet med celler transficeret med kontrol ncRNA. Derudover transfektion med si-PKCa bemærkelsesværdigt reducerede antallet af A549-celler, der passerede gennem transwell kammeret. Endvidere, når A549-celler blev samtidig transficeret med præ-MIR-203 og PKCa overekspression plasmid, PKCa dramatisk genvundet migrationen svækket af MIR-203 (figur 6B). Tilsammen vores data tyder på, at miR-203 sandsynligvis modulere celle migration ved nedregulering PKCa.

A, Transwell analyse af A549 celler behandlet med lige store doser af røræg ncRNA eller pre-miR-203, eller lige store doser af kontrol siRNA eller si-PKCa. Repræsentative billeder fra tre uafhængige forsøg er vist i venstre panel, og en statistisk analyse vises i højre panel (gennemsnit ± standardafvigelse .; **

s

0,01). B, repræsentative billeder af Transwell-analyse af A549-celler, der blev transficeret med ncRNA, præ-MIR-203, præ-MIR-203 plus PKCa overekspression plasmid, eller PKCa overekspression plasmid alene, er vist i det øverste panel, og en statistisk analyse er vist i det nederste panel (gennemsnit ± SD; **

s

0,01).

diskussion

Ud over lungekræft, PKCa er også en kritisk faktor i mange andre cancerformer. Det har vist sig, at PKCa, δ og ι var signifikant mere rigelig i hepatocellulært carcinom (HCC) væv sammenlignet med ikke-tumor levervæv [32]. Immunhistokemi-analyse bekræftede, at ovennævnte normale PKCa-niveauer kan findes i human HCC [33,34]. Da PKCa blev indført i MCF-7 brystcancer cellelinje, cellemigration og invasion forøges [35]. Det blev rapporteret, at behandling af SK-Hep-1 HCC med antisense betydeligt PKCa undertrykt cellevækst, cellemigration og invasion [36]. De samme resultater blev reproduceret ved hjælp af PKCa /β-hæmmer Go6976, som var i stand til signifikant at hæmme proliferation, migration og invasion i dårligt differentierede HCC celler. Disse forsøg antydede, at PKCa er en praktisk forskning retning for forståelse cancerudvikling.

MIR-203 blev rapporteret til at fungere som en tumor-undertrykkende microRNA, og dets ekspression blev nedreguleret i larynx carcinomceller [37]. Undersøgelser fra en anden gruppe viste, at MIR-203-ekspression blev nedreguleret i LNCaP, DU145, PC3, VCap, og MDA-PCa-2b prostatacancer-cellelinier [38]. Vi fandt, at ekspression af MIR-203 i lungekræft væv var betydeligt lavere end for de hosliggende normale væv. Det er også blevet vist, at MIR-203 funktioner i forskellige cancerformer. Den ektopiske udtryk for miR-203 i prostata cancer cellelinjer kan påvirke spredning, apoptose, og migration [38,39], mens overekspression af miR-203 i larynx carcinomceller reduceret cellelevedygtighed og førte til en cellecyklusstop i G1 fasen [37].