PLoS ONE: El Cell-Substrat Impedans Sensing (ECIS) med mikroelektrode Arrays for Undersøgelse af Cancer Cell – Fibroblaster Interaction

Abstrakt

tumor mikromiljø, herunder stromaceller, omgivende blodkar og ekstracellulære matrix komponenter, har blevet defineret som en afgørende faktor, der påvirker proliferation, lægemiddel-resistens, invasion og metastase af maligne epitelceller. Blandt andre faktorer, har kommunikation og interaktion mellem kræftceller og stromale celler blevet rapporteret at spille afgørende roller i fremme kræft og progression. For at undersøge disse relationer, blev en on-chip co-kultur udviklet til at studere cellulære interaktion mellem A549-humane lungecarcinomceller og MRC-5-humane lungeepitelceller i både normale sprednings- og behandlingsbetingelser. Kort fortalt blev en co-dyrkningsindretning bestående af 2 individuelle fluide kamre parallelt, som var adskilt af en 100 um hegn anvendes til celle mønsterdannelse. Mikroelektroder arrays blev installeret inden hvert kammer herunder elektroder på forskellige afstande væk fra konfrontation linje for den elektrokemiske impedimetric sensing vurdering af celle-til-celle indflydelse. Efter hegnet blev fjernet, og celle-til-celle-kontakt forekom, ved at vurdere impedans signalrespons repræsenterer celle tilstand og opførsel, både direkte og indirekte celle-til-celle interaktioner gennem konditionerede medier blev undersøgt. Virkningen af ​​specifikke afstande der fører til forskellige påvirkninger af fibroblastceller på kræftceller i co-kultur miljø blev også defineret

Henvisning:. Tran TB, Baek C, Min J (2016) Elektrisk Cell-Substrat Impedans Sensing (ECIS) med mikroelektrode Arrays for Undersøgelse af Cancer Cell – fibroblaster Interaction. PLoS ONE 11 (4): e0153813. doi: 10,1371 /journal.pone.0153813

Redaktør: Jonghoon Choi, Chunag-Ang University, Republikken Korea

Modtaget: 12. februar 2016 Accepteret: April 4, 2016; Udgivet: 18 April, 2016

Copyright: © 2016 Tran et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af BioNano Health-Guard Research center, finansieret af Ministeriet for Videnskab, IKT Future Planning (MSIP) Korea som Global Frontier Project (H-GUARD_2015M3A6B2063548) og blev støttet af nanomateriale Technology Development Program gennem National Research Foundation Korea (NRF), finansieret af Sydkorea regering (MSIP) (NRF-2014M3A7B4051907).

konkurrerende interesser: forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

der er stigende dokumentation for, at tumor mikromiljø, herunder stromale celler, inflammatoriske celler, ekstracellulære. matrix (ECM), cytokiner, fartøjer og vækstfaktorer, spiller en vigtig rolle i initiering, progression og invasion af kræft [1-3]. Under tumorigenese, cancerceller interagerer dynamisk med omgivende stromale celler, såsom fibroblaster, fedtceller og residente immunceller. Blandt disse, fibroblaster udgør den største gruppe af stromaceller og synes at fungere fremtrædende i cancer progression [4-5].

først beskrevet i slutningen af ​​19

århundrede, fibroblaster er aflange, ikke-vaskulær , ikke-epiteliale og ikke-inflammatoriske celler af bindevævet med udvidede celleprocesser, der viser en tenformet eller spindel-lignende form i profil. Fibroblaster udfører mange vigtige funktioner, herunder aflejring af ECM, regulering af epitelial differentiering og regulering af inflammation; de er også involveret i sårheling [5]. Under normal proliferation i raske organer, fibroblaster syntetiserer og udskiller forskellige typer af collagener (dvs. type I, III og V) samt fibronectin og proteoglycaner, som er de væsentlige bestanddele af ECM [6]. Fibroblaster secernerer også type IV collagen og laminin, der bistår i dannelsen af ​​basalmembranen [7]. I sårede organer, fibroblaster spiller en vigtig rolle i helingsprocessen ved at invadere læsioner og generering ECM at tjene som et skelet for andre celler [8].

I den tidlige fase af tumorigenese, cancerceller danner en neoplastisk læsion inden for grænserne af basalmembranen men adskilt fra det omgivende væv [9]. De basalmembranen, fibroblaster, immunceller, kapillærer og ECM omkring kræftcellerne danner et område, der kaldes tumor mikromiljø. Da princippet kilde til ECM komponenter, er fibroblaster defineres som et centralt cellulær komponent af tumorer. I tilknytning til cancerceller, kan normale fibroblaster erhverve en konstant aktiveret fænotype ved direkte celle-celle-kommunikation eller ved forskellige stimuli, der opstår, når vævsbeskadigelse forekommer [10]. Aktiverede fibroblaster udviser UP-forskrifter ECM-nedbrydende matrixmetalloproteinaser-2, 3 og 9 (MMP-2, MMP-3 og MMP-9) samt mange vækstfaktorer, der inducerer proliferative signaler til tilstødende epitelceller [11] . Fra denne tæt samarbejde, et spørgsmål opstår om heterotypiske cellulære interaktioner mellem tumorceller og fibroblaster i tumor mikromiljø. I det seneste årti, har en række undersøgelser afklaret effekten af ​​fibroblaster om forskellige aspekter af kræft celle adfærd, herunder proliferation, angiogenese, invasion, metastase og lægemiddelresistens; dog cancerceller adfærd er endnu ikke fuldstændigt forklaret. Prominent, Stoker et al. (1966), Wadlow et al. (2009) og Flaberg et al. (2011, 2012) har vist, at normale fibroblaster kan hæmme væksten af ​​kræftceller

in vitro

og de betegnes denne effekt som nabo undertrykkelse [12-15]. Flaberg et al. (2012) designet en co-kultur-assay med H2A-mRFP-mærkede tumorceller på et monolag af fibroblaster [15]. I løbet af 62,5 timer blev tumorceller proliferation og motilitet signifikant inhiberet af fibroblasterne ved direkte celle-til-celle-interaktion. For fuldt ud at forstå disse effekter, vi conjectured om der er en indirekte nabo samspil mellem fibroblaster og kræftceller, som vi betegnes som en afstand effekt. Den givne hypotese er, at den inhibitoriske virkning af fibroblaster på cancerceller er en funktion af afstanden mellem disse 2 celletyper i et fælles stromal mikromiljø.

I denne undersøgelse har vi foreslået en simpel co-kulturmodel med indlejret high-throughput mikroelektrode arrays (MEA) ved hjælp af en elektrisk celle-substrat impedans sensing (ECIS) assay (figur 1) til at overvåge tumor celle betingelser kontinuerligt, når de konfronteres med dyrkede fibroblaster. Denne elektriske Målemetode blev anvendt i denne undersøgelse på grund af de fremtrædende fordele; denne metode er ikke-invasiv, enkel at opsætte, let at udføre, overordentlig følsomme over for cellulære betingelser og i stand til real-time overvågning [16,17]. MEA blev mønstret på begge sider af cellekultur områder ved forskellige afstande fra adskillelseslinien. I løbet af celle-interaktioner, hver elektrode registrerer kontinuerligt en impedans signal gennem en high-throughput dataopsamlingssystem. Denne type impedimetric data er blevet anerkendt for at afspejle cellulær vedhæftning, breder, spredning og levedygtighed i behandling forhold med miljøgifte, lægemidler og kemikalier, samt andre stoffer

(A) mikroelektrode arrays (1.: arbejder elektrode, 2: fælles modelektrode) blev fremstillet på eksperimentelle objektglas (76mm x 52mm) ved fælles fotolitografiske processer. SU-8 photoresist blev anvendt som passiveringslag at dække de ledende spor. (B) Den sensing platformen blev opdelt i 2 områder, en for kræftcellerne og en for microenvironment agenter. Adskillige mirco mellemstore arbejdsforhold elektroder blev installeret i hvert område på forskellige afstande: 100, 250, 650, 1450 og 3050μm langt fra konfrontation linje. (C) En enkelt elektrode var 100 um i diameter. (D) Et billede af en reel chip efter co-dyrkning af 2 forskellige celletyper på 2 sider. (E) Den co-kultur mønsterdannelsesprocessen bruger en dual-kammer mug. (E

1) Efter behandling af overfladen for cellekultur blev cellen chip placeret på designet stativ, og dual-kammer skimmel blev fastsat til den korrekte placering af skruer. De 2 kamre blev separeret hinanden med en 100 um tyk væg for celle mønsterdannelse. (E

2) Efter at cellerne i både kammeret var fæstnet til chipoverfladen blev den dobbelt-kammer støbeform erstattet af en brønd-typen åben reservoir. En PDMS seng blev også installeret for at forhindre opløsning i at lække. Cellen chip blev forbundet til målesystemet og blev holdt i inkubatoren under målingerne.

I denne undersøgelse viste vi den inhiberende virkning af MRC-5-humane lungefibroblaster på den normale proliferation af A549 humane lungecancerceller. Impedans signal forskelle blev bestemt indirekte påvise afstanden virkning mellem MRC-5 og A549-celler i en co-kultur miljø. Især i drug behandlingsbetingelser, vi også observeret en intensiv undertrykkelse i direkte fibroblast-cancer interaktion, som var højere end den, der udøves ved indirekte interaktion. Endvidere blev den inhiberende virkning af fibroblaster bekræftes ved hjælp af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS) -metoden i en blandet kultur-model. Vores undersøgelse havde til formål at efterligne en

in vivo

terapeutisk stromale effekt på tumor progression med en ny afsløring og analyseteknik i realtid domæne.

Materialer og metoder

MEA fabrikation

MEA mønster blev fremstillet på glas objektglas (52 mm × 76 mm) ved fælles fotolitografiske processer ved hjælp af AZ-5214E ​​(MicroChemicals GmbH, Tyskland) som en negativ fotoresist for et lift-off processen. Den mønsterdannelse blev efterfulgt af aflejring af et 250 Å /500 Å Ti /Au dobbeltlag ved hjælp af en e-beam fordampning systemet og de unødvendige dele var selektiv fjernes i acetone. Efter elektroderne blev dannet, vi udførte en anden fotolitografi skridt til at anvende en 2 um tykt lag af SU-8 2002 (MicroChem, USA) som en isolation lag for guld spor, så kun elektroderne arrays og kontaktpads’ene expodes.

Cellekultur

MRC-5 humane lungefibroblaster og A549 humane lungecancerceller blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA, USA) og blev dyrket i RPMI-medium 1640 (Gibco ) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco) og 1% antibiotika /antimykotika (Gibco). Disse celler blev opretholdt i stand på 37 ° C og 5% CO

2 og sub-dyrket under behandling af trypsin-EDTA (Gibco) opløsning. Antallet af celler blev talt ved hjælp af Cellometer (Cellometer Auto T4, USA).

Cell mønster på MEA chip

I denne undersøgelse blev cellen mønstrede ved hjælp af en fælles fysisk barriere metode til at skabe cellefrie regioner for kollektiv celle migration [18]. En fysisk barriere blev anvendt forud for celle seeding at blokere celle blanding, og fjernelsen af ​​den fysiske barriere initierer celle migration og konfrontation proces. Akryl inventar til cellen chip og dobbelt-kammer mug var designet AutoCAD og blev fremstillet ved hjælp af en CNC-fræser (Fig 1E). Inden de anvendes til celledyrkning, blev alle de enheder steriliseret i en alkohol bad og blev tørret i en ovn med UV-lys. Efter dobbelt-kammer Formen blev fastgjort til cellen chip i den korrekte position ved hjælp af skruer, blev hvert kammer behandlet med en collagen-opløsning (10%) i 15 min ved stuetemperatur for at fremme celleadhæsion. Derefter blev kamrene vasket med 1X PBS, og de 2 typer cellesuspension (5 x 10

5 celler /kammer) blev injiceret i de 2 separate kamre. Efter 12 timer, når begge celletyper havde fæstnet godt og havde dannet et monolag på chippen overfladen, blev kamrene adskilles og blev erstattet af reservoiret well-typen. Cellen chip var forbundet til ECIS systemet og holdt i inkubatoren under målingerne.

CellTracker farvning for migration kontrol

MRC-5 fibroblaster blev farvet med CellTracker før co-kultur at vurdere deres migration ind i området af A549 tumorceller. Kort fortalt, MRC-5-celler blev dyrket i en celledyrkningsskål (SPL), og blev høstet ved anvendelse af trypsin-EDTA (Gibco). Cellerne blev centrifugeret, supernatanten blev fjernet, og cellerne blev resuspenderet i 1 ml dyrkningsmedium (RPMI-1640 med 10% FBS, 1% PS, 25 mM HEPES, Gibco). Cellen opløsning fik 20 uM CellTracker

TM (Life Technologies, CellTracker

TM Green CMFDA), og cellerne blev efterfølgende inkuberet i 30 min. Derefter blev cellerne centrifugeret, og supernatanten blev fjernet; derefter blev cellerne resuspenderet i 1 ml frisk dyrkningsmedium. De farvede celler blev derefter klar til at blive injiceret i co-kultur kammer som beskrevet i celle mønsterdannelse afsnittet. Den cellefarvning blev bekræftet under anvendelse af fluorescensmikroskopi (Eclipse 80i, Nikon).

flowcytometrianalyse

A549 og MRC-5-celler (5 x 10

5 celler /ml) blev dyrket i 6-brønds plader for både mono-kultur af A549-celler og co-kultur af A549 og MRC-5-celler). Hver celletype blev behandlet med 30 uM af curcumin (Sigma-Aldrich) i 3 dage. Derefter blev cellerne vasket tre gange med kold PBS (Sigma-Aldrich) og suspenderet bindingspuffer (10 mM HEPES, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCI

2, pH 7,4, Sigma-Aldrich). Hver prøve fik 5 uM Annexin V konjugeret Alexa Fluor® 594 (Life Technologies, excitation /emission: 590/617 nm) og blev inkuberet i 15 minutter ved stuetemperatur. Cellerne blev analyseret ved anvendelse af en Accuri C6 flowcytometer (BD Bioscience), og dataene blev analyseret med FlowJo software (Treestar).

MTS assay

Curcumin (Sigma-Aldrich) blev fremstillet i DMSO og fortyndet til ønskede koncentrationer i celledyrkningsmedier. Til eksperimentet blev celler dyrket ved 1 x 10

4 celler /100 pi af den oprindelige seeding beløb i en 96-brønds celledyrkningsplade i 24 timer. A549-celler og MCR-5-fibroblaster blev behandlet med forskellige koncentrationer af curcumin (1, 10, 30, 50, 70, 100 og 500 uM) i 3 dage. Cell Counting Kit-8-opløsning (Dojindo Inc.) blev fortyndet til 1:10 med medium og tilsat til hver brønd af pladen, og derefter blev cellerne inkuberet i 4 timer. Celleproliferation blev målt ved 450 nm under anvendelse af en Wallac 1420 VICTOR3 V mikropladelæser.

Målesystem

An Agilent 4284A Impedans Precision Meter (Agilent CA, USA) og en konstrueret switching relæ kredsløb blev opereret til samtidig impedansen af ​​elektroderne arrays. De måleforhold var 10 mV og 10 kHz ved 5 min intervaller. LabVIEW (National Instrument, TX, USA) software blev anvendt til at kontrollere måleren og registrere numeriske data til en pc, og derefter dataene blev automatisk plottet på en real-time diagram.

Statistisk analyse

Alle data blev udtrykt som middel (± SD) af 3 gentagelser. Statistisk analyse blev udført ved en envejs faktoriel ANOVA efterfulgt af Tukey s ærligt signifikant forskel (HSD) test af forskellen. Forskelle blev anset for at være statistisk signifikant ved p-værdier mindre end 0,05.

Resultater

MEA karakterisering via monokulturer af tumorceller og fibroblaster

I den første eksperimentelle trin, MEA celle chips blev valideret via monokulturer af A549 tumorceller og MRC-5-fibroblaster i normale proliferative tilstande. Før betjening af cellen målesystem blev arrays justeres (ved LabVIEW) for at normalisere de systematiske forskelle, såsom ledninger, lodning og ledende spor. Den normaliserede cellefrie modstand i hvert elektrode blev fastsat til 2,6 kQ. Figur 2A viser modstanden reaktioner, når enkelte elektroder blev udfordret af forskellige koncentrationer af A549 celler. De opnåede i løbet af 16 timer data blev monteret af en bakke algoritme til en vækst /S-formet model (OriginPro 9). Under 1,25 × 10

5 celler /brønd, modstanden kurver svarede godt til montering kurver. Ved højere celledensiteter, en lag-fase optrådte fra 4 timer til 8 timer, når cellerne blev omarrangere sig på binding sitet før dannelse et monolag på elektroderne. For nemt at estimere levedygtigheden i hele denne undersøgelse, en dimensionsløs parameter betegnes cellen index (CI) blev defineret som den relative ændring i målte elektriske modstand og kan beregnes under anvendelse af ligningen belowwhere R

i er modstand af cellen-dækket elektroder og R

cellefrit er modstanden af ​​tomme elektroder (2,6 kOHM). Efter 16 timer blev en kalibreringskurve plottet, som repræsenterede korrelationen mellem CI værdi og cellepodning densitet (figur 2B).

(A) Resistance responser af MEA for forskellige koncentrationer af A549-tumorceller i monokultur til 16 h (ved 10mV, 10kHz). (B) Denne kalibrering kurve repræsenterer sammenhængen mellem A549 celletæthed og celle indeksværdi. (C) MTS resultater fra af monokulturer af A549-celler og MRC-5-fibroblaster efter 72 timers eksponering for curcumin. IC50-værdierne for A549-celler og MRC-5-celler var 50 uM og 30 uM. Dataene er vist som middel (± SD) af 3 gentagelser.

Derudover blev A549 tumorceller og MRC-5-fibroblaster separat behandlet med forskellige doser af curcumin til at definere en passende behandling betingelse for samdyrkning undersøgelse. Curcumin har vist sig effektiv til at inducere apoptose samt inhibering af proliferation af lunge adenocarcinom cellelinie-A549 [19]. I denne undersøgelse blev curcumin valgt at lave behandlingen miljø for den foreslåede co-kulturmodel. En MTS-assay blev udført, og en cellelevedygtighed kurve blev plottet efter 72 timer (fig 2C). Resultaterne viste, at curcumin har en signifikant toksisk virkning på både tumorceller og fibroblaster ved 10 uM. IC50-værdierne for A549-celler og MRC-5-celler var 50 uM og 30 uM. Dosen behandling ved 30 uM blev valgt til efterfølgende samdyrkning eksperiment, hvor tumorceller blev samtidigt er udsat for både den toksiske virkning af curcumin og den inhiberende virkning af tilstødende fibroblaster.

Inhiberende virkning af fibroblaster på tumorceller i blandet kultur

tumorcelleproliferation i denne type co-kultur model bestemmes af egenskaberne af både cancerceller og fibroblasterne, som kunne udøve modsatrettede proliferative virkninger

in vitro

. For eksempel AG09877 fibroblaster stimulerer proliferation af carcinoma T47D-celler, mens AG04351 fibroblaster udviser en vækst-hæmning effekt på samme kræft celle linje [13]. For at bestemme de gensidige virkninger mellem A549 og MRC-5, blev en FACS-assay udført med en blandet kultur-model under anvendelse af disse 2 cellelinjer. Ordningen Påvisningen var baseret på forskelle i phosphatidylserin (PS) placering mellem raske celler og apoptotiske celler. I normale levedygtige celler, er PS placeret på den cytoplasmatiske overflade af cellemembranen. Når cellerne begynder at undergå apoptose, er PS omplantes fra indersiden til ydersiden af ​​cellemembranen og udsættes for ydre cellulære miljø. Ved hjælp af en specifik phospholipid-bindende protein (Annexin V-konjugeret Alexa Fluor® 594) og en flowcytometri sorteringssystem, kan de tidlige stadier apoptotiske celler skelnes fra hele cellepopulationen.

Som vist i figur 3 , curcumin behandling i monokulturer inducerede apoptose i både A549-celler og MRC-5-celler på 9,87% og 19,05% apoptotiske celler. Dette forhold var mindre markant end vores MTS resultater samt resultaterne af andre tidligere undersøgelser [20]. Disse forskelle blev forklaret af manglen af ​​døde celler, som ikke kan skelnes ved FACS med kun PS-farvning.

Forskellige procentdele af apoptotiske celler blev opnået i de A549 tumorceller og MRC-5 fibroblaster monokulturer og i den blandede kultur af disse 2 cellelinjer. [En farve tal kan ses i online spørgsmål].

I blandede kulturer uden en nabo effekt mellem tumorceller og fibroblaster, blev et forhold af totale apoptotiske celler forventes fra 9,87% til 19,05% i de samme forsøgsbetingelser. Interessant nok blev forholdet af apoptotiske celler i de blandede kulturer bestemt til at være 33.71%. Dette resultat antydede, at celle-til-celle inhiberende virkning var til stede parallelt med den toksiske virkning af curcumin for begge celletyper. Imidlertid særlige virkninger for hver cellelinie var vanskeligt at bestemme ved hjælp af FACS.

Inhiberende virkning af fibroblaster på den normale proliferation af tumorceller

For at diskriminere særlige bidrag hver cellelinie til den samlede hæmmende effekt, vi undersøgte cellulære betingelser via impedans reaktioner i en co-kultur model. Rå modstand data af A549-celler ved forskellige afstande væk fra fibroblaster (0,1, 0,25, 0,65, 1,45 og 3,05 mm) blev lineært monteret og normaliseret, som vist i fig 4A. De tilsvarende resistens data efter 24 timer og 48 timer blev omdannet til CI værdier ved hjælp af ligningen vist i afsnit 1 (fig 4B). Under den første 24 timer efter celle kontakt, afstanden effekten var utydelig, og Cl-værdier viste ikke signifikante forskelle mellem 1

st elektrode array (0,1 mm) og 5

th elektrode array (3,05 mm) .

(a) Cellular modstand reaktioner (på 10mV, 10kHz) af A549 tumorceller som funktion af tid og afstand fra fibroblaster løbet 54 timers co-kultur i normale vækstbetingelser. De rå data blev lineært-udstyret og konverteret til CI værdi i forhold til det cellefri elektrode respons (2,6 kQ). (B) Cl-værdier af tumorceller ved 5 forskellige afstande væk fra de dyrkede fibroblaster. Efter 48 timer i co-kultur, Cl-værdier indikerede, at tumorceller, som blev konfronteret med fibroblaster var klart inhiberet sammenlignet med fjerne celler. (* P 0,02). (C) Lys-field billeder af konfrontationen mellem tumorceller og fibroblaster ved 0 timer og 48 timer. Skalaen søjle repræsenterer 200 um.

En væsentlig forskel i proliferationen af ​​A549-celler blev observeret ved 48 timer. CI værdier af A549 celler i direkte kontakt og tilstødende kontakt med fibroblaster (dvs. ved en

st og 2

nd elektrode arrays) faldt lidt fra 6.12 og 6,23-5,57 og 5,77, mens de af yderligere A549 celler (dvs. ved 3

rd, 4

th og 5

th elektrode arrays) opretholdt stabile impedans svar på sammenflydende celledensitet (fig 4C). Disse resultat viste klart, at fibroblaster kan inhibere det proliferative rate af tumorceller i konfronteret kulturer mere effektivt end virkninger medieret gennem medierne miljø

fibroblaster-tumorceller interaktion i behandlingsbetingelser:. Indlysende nabo virkning over afstande

for at give en fuld forståelse af nabo virkning mellem fibroblaster og tumorceller

in vitro

, vi konstrueret en co-kultur model med MRC-5 celler og A549 celler i terapeutiske forhold. Curcumin blev indført i de konfronteret kulturer på den tidligere definerede koncentration, 30 pM; impedans blev derefter overvåget for følgende 84 timer. De gennemsnitlige responser blev normaliseret og ikke-lineært tilpasset ved anvendelse af en dosis-respons-algoritmen (Fig 5A). Interessant nok blev afstanden virkning tydeligt demonstreret på tidlige tidspunkter efter eksponering lægemiddel (Fig 5A og 5B). Efter 24 timer, de gennemsnitlige Cl-værdier var de opnåede 5,57, 5,77, 6,35, 6,34 og 6,40 for tumorceller, der var placeret ved 0,1, 0,25, 0,65, 1,45 og 3,05 mm væk fra fibroblast konfrontation linje. Efter 48 timer og 72 timer, signifikante fald i alle Cl-værdier og udseendet af huller mellem arrays afspejles tydeligt den intensive kombinerede apoptotiske virkning af både anticancerlægemiddel aktivitet og vækstinhibering via fibroblast interaktioner. Vi udførte også en migration assay under de konfronteres co-dyrkningsbetingelser at undersøge migration evne fibroblaster i feltet tumorceller og dermed være i stand til at skelne den direkte celle-til-celle interaktion virkning fra den samlede inhiberende virkning (Fig 5C). Efter 72 timer viste det resterende fluorescensintensitet effektiv apoptotiske virkning af curcumin på MRC-5-celler, men blev ikke observeret nogen signifikant vandring. Disse resultater stemte godt med andre undersøgelser om virkningerne af curcumin behandling på migrationen kinematik dyrkede fibroblaster.

(A) Celleresistens reaktioner (ved 10mV, 10kHz) af A549 tumorceller som en funktion af tiden og afstand fra fibroblaster end 84 timers co-kultur i curcumin behandling tilstand. De rå data blev tilpasset og konverteret til Cl-værdier med hensyn til de cellefrie elektrodeoverflader responser (2,6 KOHM). (B) Cl-værdier af tumorcellerne ved 5 forskellige afstande væk fra de dyrkede fibroblaster. Den inhiberende virkning af fibroblaster på tumorceller blev mere klart observeret i det giftige miljø efter 24 timer (* p 0,04). (C) vandringshastigheden af ​​fibroblaster i tumoren celleområdet blev vurderet under anvendelse af en celle tracker farvning assay. I behandlingen tilstand, blev ingen signifikant migrering observeret. De grå prikker angiver placeringen af ​​elektroderne arrays. Skalaen søjle repræsenterer 500 um.

Diskussion

Impedimetric cellebaserede biosensorer er blevet anerkendt som en alsidig og pålidelig karakterisering platform for bio-analytiske undersøgelser på grund af deres fremtrædende fordele, sådanne som høj følsomhed, high throughput og real-time optagelse evne. Ved hjælp af forskellige geometriske elektrodeudformninger har ECIS platforme blevet grundigt anvendt i undersøgelserne af cellebinding og spredning [21,22], cellemotilitet [23], cellelag barrierefunktioner [24], samt til

in vitro

toksikologiske undersøgelser og narkotika screening [25,26]; disse platforme også blevet integreret med andre bio-analytiske systemer [27]. Den udestående elektrode design er mikroelektrode array, som består af mange ensartede enkelt mikroelektroder på en fælles platform. Fordi de er af størrelsesordenen mikron, enlige mikroelektroder kan løse de heterogene egenskaber celler, der er skjult i gennemsnitlige celler populationer, i stedet for at tilvejebringe en kollektiv cellulær reaktion på en given fysiologisk tilstand. brugen af ​​enkelte mikroelektroder i cellulær måling skal imidlertid behandle den ekstraordinære følsomhed celle adfærd, såsom mikro-bevægelser, vedhæftet fil, spreder og spredning. Dette signal udsving er en udfordring for fastlæggelsen af ​​den endelige celle adfærd på en elektrode overflade. Oplysningerne i denne undersøgelse løsning var ved hjælp af arrays til måling gentagelse, og derefter anvende korrekte montering metoder til de opnåede gennemsnitlige data. Ved hjælp af denne metode, kan de relative ændringer i cellernes levedygtighed blive vist via CI nummer og kan nemt omdannes til procenter i forhold til de oprindelige CI værdier.

Denne undersøgelse havde til formål at foreslå en enkel, men effektiv metode til at undersøge interaktioner af tumorceller og fibroblaster i en co-kultur model, med særlig fokus på afstanden effekt mellem disse 2 cellelinjer. De overordnede inhibitoriske og toksiske virkninger på A549 cancerceller er vist i fig 6. Det skal bemærkes, at andre tidligere undersøgelser har undersøgt inhibering af tumorcelleproliferation og motilitet af fibroblaster [28-31]; den fælles konklusion var, at hæmning effekten var både kontakt- og opløselig faktor-afhængig. Men den effektive afstand mellem tumorceller og fibroblaster var endnu ikke fastlagt,. Ved at integrere en MEA platform i en co-kultur model, vi med succes bestemmes forskellene i A549 tumor celle adfærd på forskellige afstande væk fra MRC-5 fibroblaster i både normale spredning og behandling betingelser. Vores resultater viste, at påvirkningerne af tumorcellerne kunne kategoriseres i 3 forskellige zoner baseret på levedygtigheden af ​​tumorcellerne. Den første zone var placeret op til 0,25 mm væk fra fibroblast konfrontation linje, hvor cancerceller blev stærkt inhiberet i både normale og toksiske betingelser. Dette resultat kan forklares ved inddragelse af overflademolekyler af fibroblaster samt de opløselige faktorer, der udskilles på grund af sammenstød mellem fibroblaster og tumorceller [31]. Den anden zone var placeret op til 3 mm væk fra den første zone, hvor effekten i normale vækstbetingelser var utydeligt, men blev klart demonstreret i behandlingen tilstand. Dette resultat kan også forklares ved de opløselige faktorer secerneres fra fibroblaster fra en begrænset afstand. Den tredje zone omfattede det resterende område. I de normale co-kulturer, de A549 tumorceller i denne zone holdes Cl-værdier på 6,6 og 6,5, hvilket indikerede en normal proliferationshastighed trods af krydstale af fjerne celler. I behandlingen tilstand, blev levedygtighed A549 celle bestemt til at være 75,6%, hvilket var næsten det samme værdi bestemt ved mitokondrie baseret MTS-assay (72,1%). Denne ækvivalens naturligvis viste, at konditionerede medier ikke medførte nogen hæmmende virkning, når kræftcellerne var mere end 3 mm væk fra fibroblaster.

Svaret af maligne humane celler til stromale microenvironment og terapeutiske regimer er en grundlæggende emne i kræftforskning, men en fuld forståelse ikke er opnået på grund af en overdrevne afhængighed ende-point analyser [32-34]. I denne undersøgelse indførte vi et veletableret assay en hidtil ukendt sensing platform for første gang for at lette den løbende overvågning og placeringen-afhængige vurdering af cellulære inhiberingsvirkninger. Vores resultater understreges, at faktor tumorstørrelse kunne påvirke effektiviteten af ​​cancerkemoterapi og bør betragtes som en indflydelsesrig parameter i co-kultursystemer. Yderligere undersøgelser, der karakteriserer de molekylære elementer, der udskilles af celler samt signalveje ved hjælp af vores platform og lignende 3D co-kultur systemer for hver kræft type vil være bemærkelsesværdigt gavn for kræftforskning samfund.

Konklusion

Så vidt vi ved, er dette studie er det første forsøg på at løse faktor afstand i den differentielle inhibering af tumorcelleproliferation af humane fibroblaster. Vores impedimetric cellebaserede resultater viste, at nabo undertrykkende virkning af normale fibroblaster afhænger ikke kun celletype og måde af interaktion, men også afstanden mellem de 2 cellelinier. A549 tumorceller blev intensivt inhiberet inden 0,25 mm fra MRC-5-fibroblaster, mens ingen inhibering blev observeret ved 3 mm og længere. Med evne til automatiske målinger, kan vores high-throughput assay lette foreløbigt evaluering af ønskede celle-celle-vekselvirkninger i forskellige vækst- eller behandlingsbetingelser før udnyttelsen af ​​andre biologiske assays.