PLoS ONE: Hæmning på Proteasome β1 Subunit kunne bidrage til anti-kræft Effekter af Fangchinoline i human prostatakræft Cells

Abstrakt

Fangchinoline er en bisbenzylisoquinoline alkaloid isoleret fra Radix

Stephaniae tetrandrae

S . Moore. Fangchinoline og dens struktur analog, tetrandrine, udstillet direkte binding affinitet med rekombinant humant proteasom β1 subunit og også hæmmede dens aktivitet

in vitro

. I dyrkede prostata PC-3-celler og LNCaP-celler, kunne fangchinoline dosisafhængigt inhiberer celleproliferation og caspase-lignende aktivitet af cellulær proteasom som blev medieret af proteasom β1 subunit. Den inhiberende effekt af fangchinoline på caspase-lignende aktivitet af proteasom blev også observeret i oprenset humant erythrocyt 20S proteasom. I PC-3-celler, fangchinoline induceret cellecyklusstop ved G0 /G1-fasen og apoptose. Behandling af PC-3 tumor-bærende nøgne mus med fangchinoline inhiberede tumorvækst, apoptose og også forårsaget fald i proteasom aktiviteter i tumorxenotransplantater. Dosisafhængig og tidsafhængig akkumulering af ubiquitinerede proteiner og vigtige proteasom substrater såsom p27, Bax og IkB-α blev observeret i fangchinoline-behandlede celler. Over-ekspression af proteasom β1 subunit af plasmid transfektion forøget følsomhed af celler til cytotoksiciteten af ​​fangchinoline mens knockdown af proteasom β1 subunit lindres cytotoksicitet af fangchinoline i PC-3-celler. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse foreslået, at proteasomhæmning var involveret i anti-cancer effekter af fangchinoline. Fangchinoline og dets struktur analoger kan være nye naturlige proteasominhibitorer rettet β1 subunit

Henvisning:. Li D, Lu Y, Sun P, Feng L-X, Liu M, Hu L-H, et al. (2015) Hæmning på Proteasome β1 Subunit kunne bidrage til anti-kræft Effekter af Fangchinoline i human prostata cancer celler. PLoS ONE 10 (10): e0141681. doi: 10,1371 /journal.pone.0141681

Redaktør: Chih-Pin Chuu, National Health Research Institutes, TAIWAN

Modtaget: Marts 20, 2015; Accepteret: 11 oktober 2015; Udgivet: 29 oktober 2015

Copyright: © 2015 Li et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet delvist af Shanghai Science Teknologi Support Program (13431900401), National Nature Science Foundation of China (81373964), Shanghai Science Teknologi Action innovationsprogrammet (15140904800), National Science Teknologi Major Project Kina (2014ZX09301-306-03), og den tolvte femårsplan National Science Teknologi Support Program (2012BAI29B06). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd, ydet støtte i form af lønninger til forfattere YL, men havde ikke nogen ekstra rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet. De specifikke roller disse forfattere er formuleret i »forfatter bidrag« sektion

Konkurrerende interesser:. Yu Lu er ansat af Nanjing Tianyi Bioscience Co Ltd Der er ingen patenter, produkter i udvikling, eller markedsførte produkter til erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

Proteasome er opstået som et vigtigt og effektivt target for anti-cancer terapi [1]. I vores screening af naturlige proteasominhibitorer, fangchinoline og tetrandrine, to bisbenzylisoquinoline alkaloider isoleret fra tørrede rod af

Stephaniae tetrandrine

S. Moore (familie, Menispermaceae), kendt som Fangji i Kina, viste sig at have direkte binding affinitet med rekombinant humant proteasom β1 subunit og også hæmmede dens aktivitet

in vitro

. Fangji er en traditionel kinesisk medicin (TCM), som var blevet anvendt i klinikken som et analgetikum, antireumatisk, og antihypertensive lægemiddel i lang tid i Kina [2, 3]. Rapporterede aktiviteter Fangji inkluderet anti-cancer effekter [2, 4], anti-inflammatoriske effekter [5], kardiovaskulære virkninger [6, 7], og etc. De vigtigste aktive komponenter i Fangji havde vist sig at være fangchinoline og tetrandrine [2 ]. De kemiske strukturer af fangchinoline og tetrandrine blev vist i fig 1A og fig 1B. Renset tetrandrine var blevet indrømmet af Kina Food and Drug Administration, der skal bruges i klinik til behandling af inflammatoriske sygdomme, såsom silikose [8] og blev også brugt i behandling af kræft [9]. Så vidt vi ved, hverken nogen oprensede forbindelse isoleret fra Fangji heller rå ekstrakt af Fangji var blevet indberettet før at have proteasom-hæmmende effekt. Proteasomet vides at spille roller i udviklingen af ​​cancer, inflammatoriske sygdomme og kardiovaskulære sygdomme [10]. Derfor kunne det være interessant at undersøge, om proteasomhæmning er involveret i virkningerne af fangchinoline, tetrandrine samt Fangji.

(A) Kemisk struktur fangchinoline. (B) Kemisk struktur tetrandrine. (C) Real time bindingsaffinitet målinger af fangchinoline til det rekombinante proteasom β1 subunit protein. (D) Real time bindingsaffinitet målinger af tetrandrine til det rekombinante proteasom β1 subunit protein. (E) enzymaktiviteterne fra rekombinant proteasom β1 subunit med eller uden tilstedeværelse af fangchinoline ved forskellige koncentrationer. (F) enzymaktiviteterne fra rekombinant proteasom β1 subunit med eller uden tilstedeværelse af tetrandrine ved forskellige koncentrationer. Data, var statistiske resultater af tre uafhængige forsøg.

Begge fangchinoline [2, 11-14], og tetrandrine [4, 15-26] var blevet rapporteret at have anti-cancer effekter

in vitro

in vivo

. I nærværende undersøgelse har vi fokuseret på at studere de anti-cancer effekter af fangchinoline. Tidligere rapporter har vist, at, fangchinoline kunne inducere cellecyklusstandsning [11, 13, 14, 27] og apoptose [2, 14, 27] i dyrkede cancerceller. Der var også en rapport om anti-cancer aktiviteter fangchinoline

in vivo

[13]. I den foreliggende undersøgelse blev de anti-cancer effekter af fangchinoline evalueret i dyrkede PC-3-celler, dyrkede LNCaP-celler og PC-3-tumorbærende nøgne mus. Både de hæmmende virkninger af fangchinoline på aktiviteter af cellulær proteasom i kræftceller og om aktiviteter af renset menneskelige 20S proteasom blev kontrolleret. Effektiviteten af ​​proteasom som mål for cancerterapi var baseret på den kendsgerning, at den ubiquitin proteasom systemet var ansvarlig for nedbrydningen af ​​mange vigtige intracellulære proteiner involveret i kritiske cellulære processer, såsom cellecyklus, proliferation og apoptose [28-30]. Derfor blev virkningerne af fangchinoline behandling på nedbrydningen af ​​vigtige proteasom substrater såsom p27 som spillede rolle i cellecyklusprogression, Bax som var involveret i apoptose, og IKB som vedrørte NF-KB-vejen [31] yderligere kontrolleres i den foreliggende studere. Endvidere har vi også observeret påvirkning af overekspression af proteasom β1 subunit eller knockdown af proteasom β1 subunit af følsomheden af ​​celler til cytotoksicitet fangchinoline.

Kollektivt, vores resultater foreslog inddragelse af proteasomhæmning i anti -cancer effekter af fangchinoline

in vitro

in vivo

. Resultaterne af den foreliggende undersøgelse bidrager til forståelsen af ​​anti-tumor mekanisme fangchinoline samt Fangji.

Materialer og metoder

Kemi

Fangchinoline med en renhed på over 98% og tetrandrine med en renhed på over 98% blev begge købt fra Shanghai Source Leaf Technology Co Ltd (Shanghai, Kina). Fangchinoline eller tetrandrine blev opløst i DMSO til en koncentration på 0,1 M som stamopløsning og opbevaret ved -20 ° C. Fluorogene peptidsubstrater Z-LLE-AMC til kontrol proteasom caspase-lignende (C-L) aktivitet og Z-ARR-AMC til kontrol proteasom trypsin-lignende (T-L) aktivitet var fra Calbiochem, Merck. Fluorogent peptidsubstrat Suc-LLVY-AMC til kontrol proteasom chymotrypsin-lignende (CT-L) aktivitet var fra Sigma-Aldrich. Andre kemiske reagenser, undtagen hvor specielt bemærket, blev købt fra Sigma-Aldrich.

Cell kultur

Humane PC-3 prostatacancerceller og humane LNCaP prostatacancerceller blev købt fra Cell Resource Center for Shanghai Institutes for Biologisk Institut, Chinese Academy of Sciences. PC-3-celler og LNCaP-celler blev dyrket i RPMI 1640 medium suppleret med 10% føtalt bovint serum, 100 enheder /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin og holdt ved 37 ° C og 5% CO

2. Føtalt bovint serum, RPMI 1640, penicillin og streptomycin var alle fra Hyclone.

overfladeplasmonresonans biosensor analyse

Det rekombinante humane proteasom β1 subunit, produkt fra PSMB6 genet, blev udtrykt som His-Tag proteiner der anvender Escherichia coli, og derefter oprenset ved affinitetschromatografi som rapporteret i vores tidligere undersøgelse [32]. De bindingsaffiniteter fangchinoline eller tetrandrine til rekombinant proteasom katalytisk β1 subunit, blev analyseret

in vitro

ved hjælp af et Biacore 3000 instrument (Biacore AB, Rapsgatan 7, S-754 50 Uppsala, Sverige) som rapporteret før [33] . Kort fortalt blev rekombinant proteasom β1 subunit protein immobiliseret på en CM5 sensorchip som ligand i 11624,5 RU med N-ethyl-N ‘- (3-dimethylaminopropyl) carbodiimid og N-hydroxysuccinimid i henhold til standard primær amin-koblingsmetoder, og HBS- EP (10 mM HEPES, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% (vol /vol) overfladeaktivt P20, pH 7,4) blev anvendt som løbebufferen. Ligevægt af basislinjen blev udført af en kontinuerlig strøm af HBS-EP gennem chipoverfladen i 1 til 2 timer. BIAcore data blev indsamlet ved 25 ° C med HBS-EP som løbebufferen ved en konstant strøm på 20 pi /min. Fangchinoline eller tetradrine blev serielt fortyndet i løbebufferen til 0, 2,4, 3,43, 4,90, 7,0, 10 og 20 uM. Prøverne blev injiceret i kanalerne på en gennemstrømningshastighed på 20 pl /min, efterfulgt af vask med løbebufferen. De bindende reaktioner blev registreret kontinuerligt i responsenheder (RU) ved en frekvens på 1 Hz som sensorgrams og præsenteret som en funktion af tiden. Foreningen (

k

a) og dissociation (

k

d) hastighedskonstanter blev ligevægtsdissociationskonstanten () bestemmes ved analyse af sensorgrammet-kurver opnået ved forskellige koncentrationer af forbindelsen ved anvendelse af BIA evaluering software version 3.1 (Biacore) og 1:. 1 Langmuir binding fitting model

Assay af enzymaktivitet af rekombinant proteasom katalytisk β1 subunit

Kort fortalt katalytiske aktivitet af det rekombinante humane proteasom β1 subunit blev analyseret ved tilsætning af rekombinant β1 subunit-protein (30 ug) til 100 pi proteasomaktivitet assaybuffer (10 mM Tris-HCI, pH 7,8, 5 mM adenosintriphosphat, 0,5 mM dithiothreitol og 5 mM MgCl

2 • 6H

2O) indeholdende 50 pM Z-LLE-AMC i nærvær af fangchinoline eller tetrandrine ved forskellige koncentrationer eller ej. Hydrolasen aktivitet af proteasomet katalytiske β1 subunit kan frigøres det fluorogene AMC komponent fra substrat Z-LLE-AMC og AMC frigivelse blev målt efter 2 h inkubation under anvendelse af en mikropladelæser Bio-Rad 550 med excitations- og emissions- bølgelængder på 360 og 465 nm henholdsvis.

MTT assay af effekter af fangchinoline på spredning af PC-3 celler og LNCaP celler

De inhibitive effekter af fangchinoline på spredning af PC-3 celler eller LNCaP celler blev observeret ved at kontrollere cellelevedygtighed af celler under anvendelse af MTT-assay som beskrevet før [33]. Kort beskrevet blev celler podet i 96-brønds plader ved en densitet på 5 x 10

4 celler /ml til PC-3 celle og 4 × 10

4 celler /ml i LNCaP-celler. Efter dyrkning natten over blev mediet ændret til frisk medium indeholdende forskellige koncentrationer af fangchinoline eller 0,1% DMSO (kontrol opløsningsmiddel) i 24, 48 timer eller 72 timer. Cellelevedygtighed blev evalueret ved måling af mitokondrie-afhængige omdannelse af det gule tetrazoliumsalt MTT til lilla formazankrystaller ved metaboliske aktive celler. Den optiske densitet (proportional med antallet af levende celler) blev vurderet med en mikropladelæser Bio-Rad 550 ved 570 nm. IC

50 værdi (halvmaksimal inhiberende koncentration) blev beregnet ved Logit metode.

Assay af cellulære proteasom aktiviteter af PC-3-celler og LNCaP-celler

Celler blev behandlet med enten kontrol opløsningsmiddel (0,1% DMSO), fangchinoline i forskellige koncentrationer, eller 1 uM carfilzomib (positiv kontrol) i 24 timer ved 37 ° C. De enzymatiske aktiviteter af cellulær proteasom i cellelysat blev målt som beskrevet i vores tidligere papir [32]. Kort fortalt blev cellerne høstet, vasket med PBS og derefter lyseret i proteasomaktivitet assaybuffer i 30 minutter ved 4 ° C. Homogenatet blev derefter centrifugeret ved 12.000 x g i 30 minutter ved 4 ° C. Supernatanten blev opsamlet som helcelleekstrakt og proteinindholdet i supernatanten blev målt med Bradford reagenset. Katalytiske aktiviteter af cellulær proteasomet blev analyseret ved tilsætning helcelleekstrakt (indeholdende 30 ug protein) til 100 pi proteasomaktivitet assaybuffer indeholdende 50 uM fluorogene peptidsubstrater såsom Z-LLE-AMC til påvisning CL-aktivitet, Z-ARR-AMC for påvisning TL aktivitet eller Suc-LLVY-AMC til påvisning CT-L-aktivitet hhv. Frigivelsen af ​​fluorogene AMC fra peptidsubstraterne blev derefter målt som beskrevet ovenfor.

Analyse af CL-aktivitet af oprensede humane 20S proteasom

20S proteasom assay kit blev købt fra Enzo Life Sciences, Inc . (Farmingdale, NY 11735, USA). K

m, V

max værdier af oprensede humane erythrocyt 20S proteasom for fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC måles i henhold til instruktionerne fra producenten. Inaktivering af renset humant erythrocyt 20S proteasom ved fangchinoline blev bestemt ved at overvåge hydrolysen af ​​substratet i nærværelse af forskellige koncentrationer af fangcinoline. Assays blev udført ved 37 ° C i en reaktionsbuffer (50 pi) indeholdende 50 mM Tris /HCl, pH 7,5, 25 mM KCI, 10 mM NaCI, 1 mM MgCl

2, 0,1 ug 20S proteasom og Z-LLE- AMC. Reaktioner fik lov at forløbe i 120 min, og fluorescens blev indsamlet hver 1 min, og derefter afbildet som en funktion af tid. Den tilsyneladende dissociationskonstant, K

i

app, blev bestemt ved ikke-lineær mindste pasning af fraktioneret hastighed, v

i /v

0, som funktion af [I], hvor v

i er den steady state tilbageværende aktivitet af enzymet i nærvær af inhibitor (i) og v

0 er starthastigheden i fravær af inhibitor (). Dissociationskonstanten, Ki, blev beregnet ud fra den tilsyneladende dissociationskonstant, K

i

app, ved hjælp af følgende udtryk, hvor [S] er substratkoncentrationen og K

m er substratet bindingskonstant () .

induktion af cellecyklusstop og apoptose ved fangchinoline i PC-3 celler

induktion af cellecyklusstop og apoptose ved fangchinoline i PC-3 celler blev observeret ved hjælp af flowcytometrisk analyse som beskrevet i vores tidligere rapporter [32-34]. Kort fortalt, for flowcytometrianalyse af cellecyklus, celler blev opsamlet efter behandling, vasket med PBS og derefter fikseret med 70% ethanol ved 4 ° C natten over. Efter gange vask med PBS blev cellerne resuspenderet i farvning buffer (10 mg /ml RNase A og 5 mg /ml propidiumiodid i koldt PBS) i 30 minutter i mørke ved stuetemperatur og derefter analyseret ved anvendelse FACSCalibur flowcytometer. Til flowcytometrisk analyse af apoptose, Alexa Fluor 488 Annexin V PI /Dead-apoptose Kit (Invitrogen) anvendt. Celler blev opsamlet efter behandling, vasket med PBS og derefter resuspenderet i bindingsbuffer og dernæst inkuberet med Annexin V-FITC og propidiumiodid i 15 minutter i mørke ved stuetemperatur. Derefter blev flowcytometrisk analyse udført og dataanalyse blev udført med CellQuest software.

PC-3 tumor xenograft eksperimenter

Mand nøgen immundefekte mus Balb /c-nu-nu, i alderen 4 uger, blev købt fra Shanghai Experimental Animal center. Alle procedurer, der involverer dyr blev godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences. På dag 0 PC-3-celler (8 x 10

6 celler) suspenderet i 0,2 ml serumfrit RPMI 1640 blev inokuleret s.c. i den højre flanke af hver mus (seks mus pr gruppe). 14 dage efter inokulering blev musene tilfældigt inddelt i 3 grupper og begyndte injektion med enten vehikel kontrol eller fangchinoline ved 25 mg /kg (ip., QD) eller 50 mg /kg (ip., QD). Tumor størrelser blev målt hver 4 dage ved hjælp af skydelære og deres mængder blev beregnet ved hjælp af en standard formel: bredde

2 × længde /2. Den relative tumorvolumen (RTV) blev defineret som forholdet af tumor volumen ved en angivet tid og tumor volumen ved begyndelsen af ​​lægemiddelbehandling. Legemsvægt blev målt dagligt. På dag 30 efter inokulering blev mus aflivet ved CO

2 indånding og tumorxenotransplantater blev dissekeret. At visualisere apoptose i tumorxenoplantater blev TUNEL mærkning udført for at opdage apoptotiske kerner bruger In Situ Død Detection Kit (Roche Molecular Biochemicals). Kort fortalt blev tumorxenotransplantater fikseret med 10% formalin opløsning ved stuetemperatur i 24 timer og derefter indlejret i paraffin. Prøver blev opvarmet i 1 time ved vandbad-Slide Tørretumbler (LEICA H1 1220, tysk), inkuberet med dimethylbenzen til to gange (8 min hver) og derefter inkuberet med 100%, 95%, 90% og 85% ethanol i to gange ( 3 min hver). Prøver blev derefter inkuberet med 0,1 M citratbuffer (pH 6,0) for mikrobølgebestråling. Efter vask med PBS i to gange (3 min hver), blev skiver inkuberet med reaktionsbuffer (fra In Situ Død Detection Kit) i en fugtig atmosfære ved 37 ° C i 1 time. Skiver blev derefter vasket med PBS tre gange (3 min hver) for at fjerne ikke-inkorporeret fluorescein-deoxyuridin-triphosphat. Kerner blev modfarvet med 4,6-diamidino-2-phenylindol (DAPI) 1 pg /ml i 3 minutter og derefter vasket med PBS i tre gange (3 min hver). Billeder blev taget med et 20X objektiv (Olympus BX51, Japan) på en epifluorescensmikroskop. Endvidere blev proteasom aktiviteter af tumorxenotransplantater analyseres. Kort fortalt blev tumorxenoplantater homogenerized i proteasomaktivitet assaybuffer hjælp af FastPrep System (MP FastPrep-24, U.S.A), derefter centrifugering ved 4 ° C i 30 minutter. Supernatanterne blev derefter anvendt til analyse af proteasom aktiviteter, der benytter fremgangsmåde som beskrevet ovenfor til analyse af cellulære proteasom aktiviteter.

Western blotting-analyse

Western blotting assay blev udført som beskrevet før [33, 34] . Kort fortalt blev en alikvot af protein (100 ug) prøve blev sat på en 12% SDS-gel, separeret elektroforetisk og overført til en nitrocellulosemembran (Bio-Rad). Efter membranen blev inkuberet med 10 mM TBS med 20% Tween 20 og 5% dehydreret skummetmælk for at blokere ikke-specifik proteinbinding blev membranen inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C. De primære antistoffer (alle fra Cell Signaling Technology) blev anvendt, var kanin polyklonale antistof mod human IKB-α (# 4812, 1: 400), Bax (# 2772, 1: 400), proteasom β1 subunit (PSMB6) (# 13267, 1 : 500), β-actin (# 4967, 1: 400) og muse-monoklonalt antistof mod humant p27 Kip1 (# 3688, 1: 400) eller ubiquitin (# 3936, 1: 1000). Efter TBS vaske blev blots derefter inkuberet med sekundært antistof i 2 timer ved stuetemperatur i en 1: 1000 fortynding og derefter visualiseret under anvendelse af kemiluminescens (Pierce Biotechnology, Rockford, IL, USA). De sekundære antistoffer blev anvendt, var HRP-koblet gede-anti-kanin IgG (# 7074) og HRP-koblet heste-anti-muse-IgG (# 7076), begge fra Cell Signaling Technology.

Over-ekspression af proteasom β1 subunit i PC-3-celler ved plasmidtransfektion Salg

celler med overekspression af proteasom β1 subunit blev opnået ved transfektion med pcDNA3.1 plasmid, der koder fuld-længde humant PSMB6 cDNA som beskrevet før [34]. For plasmid transfektion, 5 × 10

5-celler blev podet i hver brønd på en seks-brønds plade, indtil cellerne nåede ca. 80% sammenflydning efter dyrket i 24 timer. 2,5 ug pcDNA3.1 plasmid DNA kodende PSMB6 eller pcDNA3.1 plasmid DNA uden PSMB6 (som negativ kontrol) blev fortyndet i 250 pi serumfrit medium og derefter inkuberet i 20 minutter ved stuetemperatur med en blanding af 10 pi Lipofectamine 2000 (Invitrogen ) og 400 pi serum-frit medium. Den resulterende kompleks blanding blev derefter tilsat til hver brønd i celledyrkningspladen. Efter 6 timers inkubation blev komplekst medium erstattet med frisk minimum essentielt medium suppleret med 10% (vol /vol) FBS og lad at vokse natten over. Derefter, G418 (Merck) blev tilsat til mediet for at opnå en slutkoncentration lig med den mindste dødelige dosis (400 ug /ml). Cellerne fik lov til at vokse og passage i nærværelse af G418 i over 2 uger. Ekspression af proteasom β1 subunit i de transficerede celler blev kontrolleret under anvendelse af Western blotting assay og sammenlignet med den af ​​vildtype celler og negativ-kontrolceller. Cytotoksiciteten af ​​fangchinoline på celler med overekspression af proteasom β1 subunit blev derefter kontrolleres ved hjælp MTT-assay som beskrevet ovenfor og sammenlignet med den af ​​vildtype celler og negativ-kontrolceller.

Knockdown af proteasom β1 subunit i PC-3-celler ved siRNA transfektion

Valideret siRNAs for PSMB6 (Sigma-Aldrich) blev transficeret ind i PC-3-celler ved anvendelse af lipofectamin RNAiMAX (Invitrogen) ifølge producentens protokol. Kodede negative kontrolprøver siRNA’er (Sigma-Aldrich) blev anvendt som negativ kontrol. Ekspressionsniveauer af PSMB6 (proteasom β1 subunit) i brede type celler, PSMB6 knockdown celler (celler behandlet med siRNA’er for PSMB6), negative kontrolprøver celler (celler transficeret med scrambled negativ kontrol siRNA’er) blev kontrolleret under anvendelse af Western blotting assay. For at kontrollere indflydelse proteasom β1 subunit knockdown på cytotoksicitet fangchinoline blev celler transficeret med siRNA’er for PSMB6 eller kodede negative kontrol siRNA’er for 24 timer. Derefter blev celler udsået i plader med 96 brønde i en densitet på 5 x 103 celler /brønd og virkningerne af fangcinoline på celleproliferation blev kontrolleret under anvendelse af MTT-assay som beskrevet ovenfor. Endvidere blev virkningerne af fangchinoline på markører for apoptose og autofagi i celler med normal eller knockdown af β1 subunit kontrolleres med Western blotting assay som beskrevet ovenfor. Kort fortalt, efter transficeret med siRNA’er for PSMB6 eller krypteret negative kontrolprøver siRNA’er i 24 timer blev celler behandlet med fangchinoline ved 40 uM i 24 timer. Derefter blev cellerne høstet til Western blotting assay. De primære anvendte antistoffer var kanin-anti-caspase 3-antistof (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9662), kanin-anti-PARP-antistof (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 9542) og kanin-anti-LC3B antistof ( 1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 2775). Det sekundære antistof anvendte var HRP-koblet gede anti-kanin IgG (1: 1000, Cell Signaling Technology, Cat # 7074).

Statistisk analyse

Studerendes

t

– test blev anvendt til at vurdere forskellene mellem behandlingsgrupper og kontrolgrupper. Data blev udtrykt som middelværdi ± SEM og resultater fra mindst 3 uafhængige forsøg blev anvendt til statistisk analyse. Stjerner angiver en signifikant forskel (P 0,05) sammenlignet med ubehandlet kontrol

Resultater

Bindende tilhørsforhold og direkte hæmmende effekter af fangchinoline /tetrandrine på rekombinant proteasom p1 subunit

Både fangchinoline (fig 1C) og tetrandrine (fig 1D) udviste direkte binding affinitet med rekombinant humant proteasom β1 subunit. Som vist i fig 1C, RU steg med stigende fangchinoline koncentration, som viste, at fangchinoline var i stand til at binde til proteasom β1 subunit på en dosis-afhængig måde. Lignende resultater blev observeret for tetrandrine (Fig 1D). Foreningen (

k

a), dissociation (

k

d) og ligevægt dissociation (

K

D) konstanter fangchinoline eller tetrandrine binding til proteasomet β1 subunit blev vist i tabel 1. resultaterne antydede, at fangchinoline og tetrandrine udviste lignende bindingsaffinitet til proteasom β1 subunit. Endvidere kunne både fangchinoline og tetrandrine direkte hæmme enzymaktiviteten af ​​rekombinant proteasom β1 subunit

in vitro

. Som vist i fig 1E, fangchinoline dosisafhængigt inhiberede aktiviteten af ​​rekombinant proteasom β1 subunit. Lignende resultater blev observeret for tetrandrine (Fig 1F).

inhibitive virkninger af fangchinoline på proliferation og cellulær proteasom aktiviteter af cancerceller

Som vist i fig 2A, kunne fangchinoline dosisafhængigt og tidsafhængigt nedsætte levedygtigheden af ​​PC-3-celler. IC

50 værdier af fangchinoline til inhibering af celleproliferation af PC-3-celler var 27.53 ± 3,346 uM i 24 timer, 13,13 ± 1,579 uM i 48 timer, og 7,247 ± 0,3122 uM i 72 timer behandling hhv. Som vist i figur 2B, kunne fangchinoline dosisafhængigt inhiberer C-L aktiviteten af ​​cellulær proteasomet, som blev medieret af proteasom β1 subunit. Hæmningen på C-L-aktivitet var signifikant ved doser på 1 og 10 uM fangchinoline. Aktiviteterne i proteasom trypsin-lignende (TL) og chymotrypsin-lignende (CT-L) aktiviteter, medieret af proteasom β2 og β5 underenhed, blev ikke signifikant påvirket af fangchinoline behandling.

(A) Cell levedygtighed (MTT analyseresultat) af PC-3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af fangchinoline til 24, 48 eller 72 timer. Data, var statistiske resultater af tre uafhængige forsøg. (B) Cellular proteasom aktiviteter af PC-3-celler behandlet med 0,1% DMSO eller fangchinoline ved forskellige koncentrationer i 24 timer. (C) Cellelevedygtighed (MTT-assay resultat) af LNCaP-celler behandlet med forskellige koncentrationer af fangchinoline til 24, 48 eller 72 timer. (D) Cellular proteasom aktiviteter af kontrol PC-3-celler behandlet med 0,1% DMSO (kontrol opløsningsmiddel) eller fangchinoline ved forskellige koncentrationer i 24 timer. Data, var statistiske resultater af tre uafhængige forsøg. *

s

0,05 versus kontrol opløsningsmiddel. Carfilzomib blev anvendt som positiv kontrol.

Lignende resultater blev observeret i en anden cancer cellelinie, LNCaP-celler. Fangchinoline dosisafhængigt og tidsafhængigt nedsætte levedygtigheden af ​​LNCaP-celler (figur 2C). IC

50 værdier af fangchinoline i inhibering af celleproliferation af LNCaP-celler var 36,18 ± 6,33 uM i 24 timer, 11,59 ± 0,22 uM i 48 timer, og 12,73 ± 0,59 uM i 72 timer behandling hhv. Og, fangchinoline også kunne signifikant at hæmme CL aktivitet af cellulære proteasom men påvirkede ikke aktiviteter proteasom TL og CT-L aktiviteter i LNCaP celler (Fig 2D).

inhibitive effekter af fangchinoline på CL-aktivitet af renset humane 20S proteasom

hydrolysen kurve af β1-specifik fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC ved forskellige koncentrationer af oprenset humane 20S proteasom blev vist i fig 3A. K

m og V

max af det oprensede proteasomet blev beregnet til 244,2 um og 9.749X10

-4 nmol /min. De repræsentative tidsafhængige hydrolysebetingelser kurver for Z-LLE-AMC (75 pM) af proteasom med eller uden tilstedeværelse af 500 uM fangchinoline blev vist i fig 3B. Resultaterne viste, at hydrolysen af ​​substratet ved proteasom var delvist inhiberet i nærvær af fangchinoline. De hæmmende virkninger af fangchinoline ved forskellige doser blev vist i fig 3C. K

i af fangchinoline blev beregnet til at være 356,58 ± 30,63 uM.

(A) Hydrolyse af β1-specifikke fluorigenic peptidsubstrat Z-LLE-AMC ved forskellige koncentrationer af oprenset human 20S proteasom. (B) Time-afhængig hydrolyse af 75 pM substrat Z-LLE-AMC ved 20S proteasom med eller uden tilstedeværelse af 500 uM fangchinoline. (C) inhibitive virkninger af fangchinoline ved forskellige koncentrationer på hydrolyseaktivitet af 20S proteasom. Data, var statistiske resultater af tre uafhængige forsøg.

Fangchinoline induceret cellecyklusstop og apoptose i PC-3 celler

Repræsentative resultater af cellecyklus-analyse blev vist i figur 4A og statistisk analyse resultaterne er vist i tabel 1. Fangchinoline-behandlede PC-3-celler syntes at akkumuleres ved G0 /G1-fasen med et samtidigt fald i procentdelen af ​​celler i S-fasen. Og, fangchinoline også dosisafhængigt induceret apoptose i PC-3-celler. Repræsentative resultater af apoptose analyse blev vist i fig 4B og analyseresultater statistiske blev vist i tabel 2.

(A) repræsentant flowcytometri Analyseresultaterne for DNA histogrammer af PC-3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af fangchinoline til 24 h. Standsning af cellecyklus ved G0 /G1-fasen blev observeret. (B) Repræsentative flowcytometrisk analyse resultater af apoptose i PC-3-celler behandlet med forskellige koncentrationer af fangchinoline i 24 timer. Viste var repræsentative resultater af tre uafhængige forsøg.

Fangchinoline behandling hæmmede væksten af ​​PC-3 prostatakræft implanteret og induceret apoptose

Som vist i figur 5A, fangchinoline behandling ved 25 og 50 mg /kg kunne dosisafhængigt inhibere væksten af ​​PC-3 xenotransplantater. Data viste i fig 5A var relativ tumorvolumen (RTV), der blev defineret som forholdet af tumor volumen ved en angivet tid og tumor volumen ved begyndelsen af ​​lægemiddelbehandling. Dataene i tumorvolumen (mm

3) i hver gruppe var viste i S1 tabel. Og resultaterne af TUNEL mærkning (Fig 5B) viste, at apoptose blev induceret i PC-3 xenotransplantater fra dyr behandlet med fangchinoline. Salg

(A) Tumorvækst kurve i nøgne mus behandlet med vehikelkontrol, 25 mg /kg fangchinoline eller 50 mg /kg fangchinoline. (B) Apoptose (viste ved TUNEL mærkning) induceret af fangchinoline i tumorxenotransplantater af dyr behandlet med fangchinoline. Scale bar = 10 um. (C) proteasom aktiviteter af tumorxenografter af dyr behandlet med vehikel kontrollen eller fangchinoline. *

P

. 0,05 vs. kontrolgruppen

proteasomhæmning i xenografter af dyr behandlet med fangchinoline

Som vist i figur 5C, resultater af proteasom aktivitet assay af tumorxenografter viste, at proteasom aktiviteter af xenografter af fangchinoline-behandlede grupper blev reduceret sammenlignet med det for vehikelkontrol. Faldet i proteasom aktivitet var signifikant i 50 mg /kg fangchinoline-behandlede gruppe.

Fangchinoline induceret akkumulering af ubiquitinerede proteiner samt Ub-kBa, Ub-p27 og Ub-Bax

Proteasome inhibering ville forårsage akkumulering af ubiquitinerede proteiner. Som vist i fig 6A og fig 6B, fangchinoline induceret dosisafhængig og tidsafhængig akkumulering af ubiquitinerede proteiner i celler.