PLoS ONE: Design af High-specificitet Nanocarriers ved Udnyttelse Ikke-Equilibrium effekter i Cancer Cell Målretning

Abstrakt

Selvom målretning af kræftceller ved hjælp af narkotikarelaterede levere nanocarriers lover til forbedring af terapeutisk middel specificitet, strategien om at maksimere ligand affinitet til receptorer overudtrykkes på kræftceller er suboptimal. For at bestemme design principper som maksimerer Nanobærer specificitet for cancerceller, studerede vi en generaliseret kinetik-baserede teoretisk model for nanocarriers med en eller flere ligander, der specifikt binder disse overudtrykte receptorer. Vi viser, at kinetikken iboende i systemet spiller en vigtig rolle i bestemmelsen specificitet og kan faktisk udnyttes til at opnå størrelsesordener forbedring specificitet. I modsætning til den nuværende tendens til terapeutisk design, viser vi, at disse specificitet forøges almindeligvis kan opnås ved en kombination af lave endocytose og nanocarriers med flere lav-affinitetsligander. Disse resultater er stort set robust tværs endocytose mekanismer og drug-levering protokoller, hvilket tyder på behovet for et paradigmeskift i receptor-målrettet lægemiddel-levering design

Henvisning:. Tsekouras K, Goncharenko I, Colvin ME, Huang KC, Gopinathan A (2013) design af High-specificitet Nanocarriers ved Udnyttelse ikke-Equilibrium effekter i Cancer Cell Målretning. PLoS ONE 8 (6): e65623. doi: 10,1371 /journal.pone.0065623

Redaktør: Bing Xu, Brandeis University, USA

Modtaget: 8. januar 2013; Accepteret dateret 25. april 2013; Udgivet: 26 juni 2013

Copyright: © 2013 Tsekouras et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne anerkende støtte fra National Science Foundation tilskud EF-1.038.697. AG anerkender også støtte fra en James S. McDonnell Foundation Award, en University of California Institute for Mexico og USA (UC MEXUS) tilskud, og en George E. Brown, Jr. Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Collateral skader på sundt væv forårsaget af terapeutisk middel handling er fortsat et stort problem for kræftbehandling, begrænser behandling effektivitet og anvendelighed, og i sidste ende gå på kompromis med patientens overlevelse. Specificitet kan forbedres via terapeutiske nanocarriers stof-indeholdende udstyret med ligander, der binder receptorer selektivt overudtrykt i cancerceller [1] – [3]. Selv om denne fremgangsmåde lover, med en række lægemidler på markedet [4] og igangværende forskning med fokus på Nanobærer-ligand-konjugater og på at identificere levedygtige receptorer [5] – [8], forekomsten af ​​bivirkninger i Nanobærer-behandlede patienter rester en begrænsende faktor. Den rationelle design af multivalente nanocarriers for optimal specificitet udgør derfor en spændende og vigtig udfordring

Adskillige nyere teoretiske og eksperimentelle undersøgelser [9] – [15]. Har været motiveret af relevansen af ​​multivalente ligand-receptor-binding til både Nanobærer design og biologiske processer, såsom immunsystemets funktion. I forbindelse med høj specificitet cancercelle målretning, er det blevet vist, at multivalente nanocarriers udstyret med lav-affinitetsligander kan opnå meget højere dækning på celler med svagt øgede receptor densiteter under ligevægtsbetingelser [3], [16]. Det er imidlertid det antal nanocarriers internaliserede der er af terapeutisk konsekvens og ikke blot antallet i kontakt med celleoverfladen under idealiserede betingelser for ligevægt. Vi forventer da, at specificitet vil være omfattet af de forskellige tidsfrister, der er forbundet med endocytose, ligand-receptor binding /uforpligtende, og metoden til drug delivery. Selv når man tænker på simpel lineær respons nær ligevægt, har det vist sig, at størrelsen af ​​den endocytosis sats indstiller den maksimale specificitet [3], der peger på vigtigheden af ​​kinetik. Faktisk finder vi, at både størrelsen af ​​endocytose sats og dets funktionelle afhængighed af antallet af bundne ligander, som er omfattet af den molekylære mekanisme for endocytose, få væsentlige virkninger for specificiteten.

Desuden ligevægt -baserede undersøgelser kan ikke løse forskellige lægemiddel-levering protokoller, som disse skaber tidsafhængige Nanobærer disponible og dermed udelukker eksistensen af ​​en stabil tilstand. Under alle omstændigheder, en steady state er næsten umuligt at opnå

in vivo

, hvor naturlige biologiske kredsløb, homeostase mekanismer og de praktiske lægemiddel-administration regler alle konspirerer imod det. Vi undersøger disse spørgsmål med en tilgang, der undersøger de

kinetik

af Nanobærer-ligand komplekser binder til sunde og kræftceller henblik på at identificere drug design strategier, der maksimerer målretning specificitet. Vi viser, at der eksisterer toppe i specificitet som en funktion af både affinitet og antal ligander, hvilket indebærer eksistensen af ​​optimale Nanobærer motiver med et stort antal meget svagt bindende individuelle ligander med ligand-receptor-dissociationskonstanter i mM rækkevidde. Vi demonstrerer endvidere, at specificiteten kan forøges ved størrelsesordener ved at udnytte kinetikken for systemet via målretning receptorer, som langsomt endocytoseret kun i grupper og /eller af en fornuftig afstemning af tidsafhængigheden af ​​lægemiddeladministration. Bemærkelsesværdigt, det optimale design region parameter rummet viser lidt variation selv blandt meget forskellige lægemiddel-levering protokoller og endocytose mekanismer, der peger på eksistensen af ​​robuste design principper.

Metoder

Vi konstruere en minimal kinetisk model for endocytose af nanocarriers udstyret med

N

ligander (fig. 1). Ligander selvstændigt binde til og ophæve bindingen fra individuelle receptorer med satser, for sunde celler og for kræftceller, hvor er den faktor, som kræftceller overekspression receptorer. Værdierne af disse satser afhænger af en række faktorer, såsom Nanobærer størrelse og ligand /receptor-typen, og kan være relateret til standard kemisk kinetik konstanter ved at bemærke, at og, hvor er den effektive koncentration receptoren i nærheden af ​​en enkelt ligand (Fil S1) og det antages, at der er et stort overskud af mobile receptorer. Derfor, hvor er dissociationskonstanten og er ligand-receptor affinitetskonstant. Uafhængighed ligandbinding, mens antaget for enkelhed, er en god tilnærmelse for mange multivalente supramolekylære interaktioner [17]. Nanocarriers ind i systemet med et input rate, som bestemt ved

drug-delivery protokol

, som er den metode, hvorved behandlingen administreres og kinetikken for første binding af nanocarriers til celleoverfladen. Vi undersøgte tre tilfælde: (i) den steady state følge af en konstant forsyning af nanocarriers, (ii) resultatet af en enkelt, høj koncentration dosis, og (iii) pretargeted levering, hvor en ligand-kompleks indføres først (at) og derefter fulgte senere af den aktive terapeutiske (at), som dokker med nanocarriers tilbage i systemet. Til denne sidste protokol, målte vi specificitet for en given

indsamling tidsvindue

, hvor indstilles ved fysiologiske tidsskalaer og svarer til den tid, efter hvilken endocytose af aktiverede terapeutisk-Nanobærer komplekser er ubetydelig. Efter montering til en celle, er nanocarriers fjernes fra systemet, hvis alle ligander Adskil (vi mener ikke Nanobærer “genanvendelse”), eller hvis de er endocytose. Endocytose sker med en hastighed, hvis afhængighed af antallet af bundne ligander vi kalder den

endocytose profil

.

(A) Nanobærer (guld) med to af fire ligander bundet på receptorer (grøn) . (B) Kortlægning til en 1D random walk med konstante, sigmoidale, og lineære profiler diktere satser for endocytose i hver ligand binding stat.

Hver Nanobærer kan så repræsenteres ved en 1D tilfældig walker på diskrete intervallet mellem en absorberende barriere på 0 og et reflekterende barriere på

N

, med en hastighed på partikel tab på hvert sted (fig. 1B). På tidspunktet, en rollator ved position

n

repræsenterer en Nanobærer med

n

ligander bundet. Angiver sandsynligheden for, at en Nanobærer har

n

ligander bundet til tiden

t

som, vi afledt master-ligninger for en Nanobærer knyttet til en sund celle:

for, (1 ) for, (2) til (3) for en Nanobærer fastgjort til en cancercelle, i ligning. 1-3 er simpelthen erstattet af.

Dette system master ligninger kan omarbejdes som vektoren ligning (4), hvor den del af er, og elementerne i matricen er dikteret af de relevante koefficienter i master ligninger . Eq. 4 kan så løses numerisk, med oprindelige betingelser, at bestemme egenvektorer og egenværdier for forskellige kombinationer af endocytose profiler, narkotika-levering protokoller, og værdier,,, og (for pretargeted drug delivery) samling tidsvinduer. For hver kombination af narkotika levering protokol og endocytose profil bestemmes vi specificiteten,, hvor og er antallet af nanocarriers endocytoseret af kræft og sunde celler. og kan beregnes som integralet over relevante tidspunkt vindue i netto rente af narkotika internalisering,. Faktoren i ligningen for normaliserer for det øgede antal receptorer på cancercellen. Ud over at bestemme den fulde numeriske løsninger for alle kombinationer, vi valideret alle resultater med Monte Carlo-simuleringer ved hjælp af Gillespie-algoritmen. Desuden har vi udledt en analytisk løsning for kombinationen af ​​en konstant endocytose profil ved steady state i den grænse, der er enig i vores numeriske resultater (File S1).

Resultater

Specificitet toppe for høje tal løst bundne ligander

for at undersøge betydningen af ​​kinetiske virkninger på specificitet, vi først undersøgt virkningerne af varierende endocytose profiler til en fast steady state lægemiddel-levering protokol. Vi er interesseret i, hvordan specificiteten afhænger af følgende delmængde af Nanobærer designparametre: liganden nummer og ligand-receptor affinitet konstant. Fig. 2A viser specificitet for en konstant endocytose profil, hvor. Der er et veldefineret interval af optimale designparametre hvor specificiteten er væsentligt højere end omgivelserne. Lokalt optimale løsninger vises i en kontinuerlig kurve lige fra små toppe på for store () til store toppe ved store til.

(A-C) Surface kort over specificitet under steady-state lægemiddel-levering protokol med konstant (A), lineær (B), og sigmoidal endocytose med (C). (D) Maksimal specificitet under steady-state drug delivery og S-formet endocytose af forskellige tærskelværdier. I alle tilfælde, det samlede antal ligander er, og.

Generelt for rimelige værdier af og (tabel 1), finder vi, at specificitet toppe globalt for høje antal ligander og en dissociation sats på rækkefølgen af ​​mM (fig. 2A). Dette kan forstås i forhold til de relative værdier af den enkelte ligand på og uden priser. Hvis vil nanocarriers binde til både raske og cancerceller, mens hvis nanocarriers vil binde til hverken celletype; begge effekter reducerer specificitet. Hvis nanocarriers på raske celler forbliver mere tilbøjelige til at ophæve bindingen end at binde en ligand; men hvis er tæt på, således at, så nanocarriers på cancerceller vil være mere tilbøjelige til at binde end at ophæve bindingen af ​​en ligand. Således i denne ordning, ligandbindende selekterer for nanocarriers bundet til cancerceller, og de ønskede skævhed stiger som denne forud valgt population føres ind i næste ligand-bindingsreaktion. Derfor i gennemsnit nanocarriers bruge mere tid bundet til kræftceller sammenlignet med raske celler og dermed har en højere sandsynlighed for at blive endocytose. For meget store, nanocarriers foretrækker kraftigt at binde stedet Adskil en ligand, uanset om de er bundet til raske eller cancerceller, hvilket giver en meget stor sandsynlighed for at en Nanobærer ikke-specifikt endocytoseres. Denne sandsynlighed stiger med antallet af ligander, der fører til særlige faldende, og tendens til 1 (den nedre grænse) i det store grænse. Specificiteten ved er identisk enhed, så stiger den maksimale tendens til tilgang, med diskrethed for at fastsætte den optimale på som går mod uendelig, et resultat, der bekræftes af vores analytics (File S1).

Vi overvejede virkningerne af ændring af den funktionelle form af endocytose profil. Fig. 2B og C viser de særlige for den lineære endocytose profil (5) og S-formet endocytose profilen (6) hvor er heaviside trinfunktion og er den grænseværdi på henholdsvis. Placeringen af ​​den globale optimum er ikke væsentligt påvirket af ændringerne i endocytose profil. Ved steady state specificitetsværdier er ens for konstant og lineær endocytose, hvor sidstnævnte modeller det scenarie, hvor hver ligand-receptor binding hændelsestriggere en uafhængig signalering kaskade, der har en endelig sandsynlighed for resulterer i endocytose. Derimod for sigmoidal endocytose, størrelsen af ​​det optimale specificitet væsentligt forbedret. Til denne kooperativ endocytose kræver flere bindende begivenheder [18], er specificitet så styrket, fordi endocytose forekommer kun med nanocarriers i ligandbindende stater, hvis relative forekomster vise de kumulative virkninger af selektion ved hvert skridt. For en fast samlet antal ligander, fig. 2D viser, at specificitet skarpt stiger med størrelsesordener som værdien af ​​tærsklen, forpligtet til at udløse endocytose stiger. Denne effekt er en direkte følge af specificiteten afhængigt kinetikken af ​​bindingen, uforpligtende, og endocytose. Disse resultater indikerer, at målretning receptorer, der er endocytoseret i et kooperativ måde kan give betydelige forbedringer i specificitet.

Vi næste undersøgt virkningerne af varierende drug-levering protokoller til en fast konstant endocytose profil, igen fokus på, hvordan specificiteten afhænger af Nanobærer designparametre. Fig. 3A, B og C viser specificiteten som funktion af og til steady state, enkeltdosis, og pretargeted afgivelse af lægemiddel protokoller hhv. Bemærkelsesværdigt, lige som i fig. 2, observerede vi en robust sæt af lokalt optimale løsninger der findes i en kontinuerlig kurve spænder fra for til stor til. Det faktum, at denne optimale regime synes at være konserveret på tværs af forskellige protokoller antyder, at generisk optimale drug design, uafhængigt af administration protokol, er mulige. For pretargeted lægemiddel-levering protokol for de samme betingelser, kan man også opnå meget store særlige blot ved et passende valg af indsamlingen tid vindue: ændringer i med en faktor på kan resultere i størrelsesordener forbedringer i specificitet (figur 3D.). Det skal også bemærkes, at specificitet er meget mere følsomme over for og kun svagt afhængige af.

(A-C) Specificitet for en konstant endocytosis profil under steady-state (A), enkeltdoser (B), og pretargeted lægemiddel-levering protokoller (C). For pretargeted lægemiddel-levering-protokol, indsamlingen vinduet er fra 200 til 300 sekunder. (D) Maksimal specificitet under pretargeted lægemiddel-levering-protokol og konstant endocytose for forskellige værdier af. I alle tilfælde og.

Multiplicative forbedring i specificitet med optimal kombination af narkotika levering protokol og endocytose profil

Vores resultater viser, at specificitet kan forbedres væsentligt ved uafhængigt tuning narkotikarelaterede levering protokollen og endocytose profil via valg af target-receptor type. Dette antyder, at velovervejede kombinationer af narkotika levering protokol og endocytose profil kombineret med passende design parametre kunne give yderligere stigninger i specificitet. I fig. 4A udviser vi denne forøgelse i tilfælde af pretargeted lægemiddelafgivelse og sigmoidal endocytose, som vi fandt en maksimal specificitet op til gange værdien af ​​selektiviteten forventes fra overekspressionen faktor alene og over 300 gange Specificiteten for kombinationen af ​​steady state levering og konstant endocytose, som er den nærmeste mimic til ligevægt betingelser. Effekten synes at være multiplikativ, med kun beskeden () øger forventet som følge af kooperativ endocytose (fig. 2D) eller pretargeted levering (fig. 3D) alene.

(A) Kombinationen af ​​pretargeted lægemiddel-levering-protokol og S-formet endocytose udviser den højeste specificitet af alle kombinationer undersøges. ,, Tærskel. (B) Maksimal specificitet på tværs af alle kombinationer. , For sigmoidal endocytose, og fra 200 til 300 sekunder for pretargeted drug-delivery-protokol. Solid linjer svarer til og. (C) Virkningerne af overekspression faktor specificitet tværs narkotika-levering protokoller for konstant endocytose profil på,. Specificiteten stiger kraftigt på. (D) Virkningerne af endocytose rate (normaliseret ved) på tværs lægemiddel-levering protokoller for konstant endocytose profil på,,.

Mens den optimale regionen var stort set i overensstemmelse tværs protokoller eller endocytose profiler, når en eller anden var fastsat, vi ønskede at undersøge, om dette forblevet tro for vilkårlige kombinationer. Fig. 4B viser de maksimale specificiteter for alle kombinationer af lægemiddel-afgivelse protokol og endocytose profil. Der er en klar gruppering af de optimale løsninger til alle kombinationer langs en region der spænder fra for store til store for lav. Mens vi forklarede optimum ved store, det globale optimum for lav, er af stor interesse. Som beskrevet ovenfor bør denne ordning svarer stort set til den situation, hvor en Nanobærer bundet med én ligand til en kræftcelle er marginalt mere tilbøjelige til at binde en anden ligand. Det betyder eller. Med asymptote ved store væsen, man ankommer til heuristisk regel, hvor er en konstant, der afhænger af, og. Fig. 4B viser to sådanne kurver med forskellige værdier af til sammenligning.

Da de optimale designløsninger og de tilsvarende særlige afhænge af og, vi viser disse afhængigheder i fig. 4C og D tværs lægemiddel-levering protokoller for en fast konstant endocytose profil. Specificiteten stiger kraftigt til en værdi af det er nogenlunde konstant på tværs af protokoller. Da denne værdi er fastsat af konstruktionsparametre og valg af receptor (se File S1 for detaljer), en anden strategi for en høj specificitet er at vælge en receptor for hvilken dens typiske overekspression faktor er lige over denne værdi. Dette sikrer, at enhver kræftceller med målrettes med høj specificitet. Faktisk var dette også identificeret som en mekanisme til super-selektivitet ligevægt undersøgelser [16]. De kinetiske virkninger af lægemidlet levering protokol påvirker væsentligt selve selektivitet nær, med pretargeted protokol der har den største specificitet ekstraudstyr. Endelig observerede vi, at specificiteten generelt falder med stigende endocytose rate (Fig. 4D), hvilket indikerer, at receptorer, der bliver genanvendt langsommere er potentielt bedre mål. Denne særlige afhængighed kan også opstå i en meget anden sammenhæng: fremskyndet etablering af morfogen gradienter i overværelse af nedbrydning, som kan beskrives ved tilsvarende ligninger [19]

Diskussion

Som konklusion. har vi vist, at specificitet toppe forekommer som en funktion af både affinitet og antal ligander, hvilket indebærer eksistensen af ​​optimale Nanobærer designs. Samlet set komplekser med individuel ligand i mM område () og et stort antal ligander pr luftfartsselskab har designfunktioner, der giver høj specificitet i vores simuleringer. Denne optimale område af designparameter rummet er robust tværs afgivelse af lægemiddel protokoller og endocytose mekanismer. Den præcise specificitet spidsværdien og skarphed kan tilpasses gennem omhyggelig udvælgelse af parametre eller administrator strategier. Mulige strategier for at øge specificitet omfatter receptorer, målretning, der udløser endocytose, hvis bundet i grupper og /eller har en lav samlet endocytose sats, og udnytte pretargeted lægemiddeladministration med lange ventetider.

Det skal bemærkes, at øget specificitet kommer på bekostning af at have en lavere samlet antal endocytoserede nanocarriers. Mens vi antaget, at dosis kan øges efter behov, i klinisk praksis kan der være andre faktorer, såsom nyrerne evne til at fjerne medicinen fra kroppen, der kan begrænse evnen til at maksimere specificiteten. For at imødegå generelle design principper og strategier, valgte vi også at ignorere en række andre specifikke systemkarakteristika, herunder muligheden for, at er tidsafhængig, interaktioner mellem ligander, og oplysninger om den Nanobærer kompleks geometri (se Fil S1 for detaljer).

Samlet set vores arbejde supplerer ligevægt undersøgelser såsom [16], ved at vise, at det er muligt at designe meget høj specificitet komplekser for ikke-ligevægtsbetingelser. En specifik fordel ved vores tilgang for at anvende lav-affinitet multivalente nanocarriers er, at det reducerer behovet for høj specificitet ligander, som sædvanligvis høj molekylvægt (såsom antistoffragmenter) og kan føre til lægemidler, der har ringe biotilgængelighed [20] . Det skal bemærkes, at vores arbejde ikke er fokuseret på en enkelt biologisk system, men snarere løser en hel klasse af biologiske, kemiske, and Bioengineering problemer. Ved at fokusere på kun fysiske mængder og ikke den specifikke kemiske, biologiske og kliniske træk ved hver mulig system har vi udledt brede, generelle og overordnede design principper. Vores resultater kan derfor potentielt anvendes på processer, der handler fra et par meget specifikke genkendelsessites versus et større antal mindre specifikke steder; for eksempel til at designe en kolonne til optimalt særskilte kemikalier eller konstruere DNA-sekvenser med en overrepræsenteret antal visse motiver. Det er også interessant at bemærke, at successiv ligand-receptor bindingsreaktioner oprettet en multipel reaktionstrin proces svarende til kinetisk korrekturlæsning [21], som kraftigt forøger den relativt lave tilbøjelighed til at binde på cancerceller. Således, som antallet af trin stiger, kan specificiteten blive meget høj. Men i modsætning til i kinetisk korrekturlæsning, energi ikke brugt til skævhed hver reaktion skridt, med den deraf følgende omkostninger er den samlede reduktion af Nanobærer endocytose sandsynlighed. Endelig får allestedsnærværende multivalente lav affinitet interaktioner og den principielt ikke-ligevægt miljø i biologi, er det muligt, at naturen allerede udnytter den mekanisme, vi har diskuteret at vinde betydelige forbedringer i specificitet over grænser dikteret af ligevægt.

Støtte Information

File S1.

Indeholder supplerende oplysninger på antagelser i vores model med hensyn til receptor tilgængelighed og ligand indbyrdes afhængighed, sats afhængigheder, definitioner af og og en analytisk løsning af master ligninger og bestemmelse af specificitet for tilfælde af steady state med konstant endocytose profil. Figur S1, Surface plot af specificitet som funktion af og viser en højderyg strækker sig mod store værdier af (ud af siden). Til fast og store, specificitet som en funktion af har en top ved. Her, og. Figur S2, Crossover værdi overekspression som en funktion af affinitet, og antallet af ligander, (indsat). for begge grunde, for de vigtigste plot og til nedfældning. Generelt har en tendens til kvalitativt at følge opførslen af ​​specificitet for de samme parameterværdier

doi:. 10,1371 /journal.pone.0065623.s001

(PDF)