PLoS ONE: Forskelle i Egenskaber og Mirna Expression Profiler mellem Side populationer fra Nedsat Cancer Cells og Normal Lever Cells

Abstrakt

Mål

Fordi hepatisk cancer stamceller (HCSCs) menes at stammer fra konvertering af hepatiske normale stamceller (HNSCs), identifikation af de forskelle, der adskiller HCSCs fra HNSCs er vigtig.

Metoder

HCC modellen blev etableret i F344 rotter ved dEN induktion . Anvendelse af FACS-analyse, side population celler fra HCC (SP-HCCs) blev isoleret fra de epiteliale-lignende celler af HCC væv, og den side population af celler fra normal lever (SP-NLCS) blev isoleret fra syngene normale leverceller. Udtrykket af stamceller markører blev påvist i både frisk isolerede og forstærkede subpopulationer. Efter induktion med HGF blev differentieringen af ​​hver delpopulation analyseret ved påvisning af tidlige og sene lever markører. In vivo blev de biologiske karakteristika af SP-HCCs og SP-NLCS analyseret ved at reparere skadede lever eller danner tumorer i nøgne mus. Derudover blev ekspression af miRNA undersøgt i begge populationer af miRNA array og QRT-PCR.

Resultater

SP-NLCS og SP-HCCs var 4,30 ± 0,011% og 2,100 ± 0,010% af hele befolkningen, henholdsvis. Både SP-NLCS og SP-HCCs viste større udtryk for stamcelle markører (CD133 og EpCAM) end NSP-NLCS og NSP-HCCs henholdsvis (

P

0,01), begge efter frisk isolation og forstærkning. Ved HGF induktion, SP-NLCS genereret mange ALB positive celler og få CK-7 positive celler, men NSP-NLCS kunne generere kun ALB positive celler. I modsætning hertil SP-HCCs gav anledning til kun AFP positive celler. Så få som 5 x 10

5 SP-nlcs var i stand til at reparere leverskade, mens det samme antal NSP-NLCS ikke kunne reparere leveren. Endvidere kun 1 × 10

4 SP-HCCs var nødvendigt at iværksætte en tumor, mens NSP-HCCs ikke kunne danne en tumor. I forhold til SP-NLCS, 68 opreguleret og 10 ned-regulerede miRNA var til stede i SP-HCCs (

P

0,01).

Konklusion

Baseret på de afgørende roller nogle miRNA i tilblivelsen af ​​HCSCs kan miRNA bidrage til de forskellige karakteristika, der kendetegner SP-HCCs fra SP-NLCS

Henvisning:. Liu Wh, Tao Ks, Du N, Liu Zc, Zhang Ht, Dou Kf (2011) Forskelle i Egenskaber og Mirna Expression Profiler mellem Side populationer fra Nedsat cancerceller og normale leverceller. PLoS ONE 6 (8): e23311. doi: 10,1371 /journal.pone.0023311

Redaktør: Xin Wei Wang, National Cancer Institute, USA

Modtaget: September 2, 2010; Accepteret: 15 Juli 2011; Udgivet: 3 August, 2011

Copyright: © 2011 Liu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af National Natural Science Foundation of China (nr 30.772.102) og Nature Science Foundation i Shaanxi-provinsen (nr 2007K09-05 (7)). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Stigende beviser har vist, at kræft indeholder en lille delmængde af deres egne stamceller-lignende celler, der kaldes “cancer stamceller” (CSCS) [1], [2], [3], som er mest berørt af både tumorundertrykkere og kræft inducere [4], [5], [6]. HCC indeholder også hepatiske CSCS (HCSCs), som har det største potentiale til at formere sig og invadere omgivende væv [7]. Nylige publikationer har vist, at HCSCs kan stamme fra hepatiske normale stamceller (HNSCs) [8]. Selv den første begivenhed, der forvandler HNSCs til HCSCs foreslås at være en form for deregulering af HNSCs selvfornyelse [9]. Således sammenligne egenskaber af HNSCs og HCSCs er vigtig. Normal lever er rig på HNSCs [10], og forslaget om, at disse HNSCs kan tjene som en optimal kontrol til undersøgelse af karakteristika af HCSCs er rimelig. Men molekylære markører, der definerer både HCSCs og HNSCs forbliver kontroversiel; derfor isolering af side population (SP) celler har været meget anvendt til at berige begge typer stamceller [11]. SP-celler har vist sig at være umodne og udifferentierede celler og til at udtrykke høje niveauer af visse specifikke stamcellemarkører [12]. Derfor isoleringen af ​​SP-celler er en alternativ kilde til stamceller, som er særlig anvendelig i situationer, hvor stamcellemarkører er ukendt [12]. Hos mus og rotter, vises SP fænotype at være et fælles træk af stamceller, herunder normale og cancer stamceller [13], [14], [15]. I leveren, er disse SP-celler blevet vist at tjene en central rolle i leverregenerering og leverkræft [16]. Derfor kan SP celler anses passende alternativer til at studere HNSCs og HCSCs.

miRNA dukker som vigtige regulatorer af post-transkriptionel genregulering. Betydningen af ​​miRNA understreges af det faktum, at de ofte er dereguleret under carcinogenese [17], [18], [19], [20]. Nogle miRNA kan fremme tumorvækst via fælles mekanismer, der bidrager til miRNA-reguleret cellecykluskontrol [21]. Desuden har miRNA vist sig at være en integreret del af stamceller regulering, herunder normale stamceller (NSC) og CSCS [22]. En forstyrrelse af vigtige miRNA-mRNA netværk i NSC er blevet foreslået at være et adelsmærke for CSCS [23]. Faktisk har en enkelt onkogen (miRNA-145) blevet påvist at omprogrammere primære celler at vise en CSCS fænotype [24]. Således, identifikation af fælles og unikke udtryk mønstre af miRNA mellem HCSCs og HNSCs er afgørende.

I denne undersøgelse har vi anvendt SP analyse til to forskellige populationer af primære dyrkede epitelceller. En celletype blev isoleret fra rotte HCC væv induceret af diethylinitrosamine (DEN) og den anden celletype blev isoleret fra syngene rotte levervæv. Side populationer fra normale leverceller (SP-NLCS) og fra HCCs (SP-HCCs) overudtrykt stamcelle markører.

In vitro

begge SP celler havde høje kapacitet til at formere og kunne differentiere til modne celler efter induktion med hepatocytvækstfaktor (HGF).

In vivo

, SP-NLCS kunne i høj grad hjælpe med at reparere en skadet rottelever. I modsætning hertil kunne SP-HCCs indlede tumorer både i subkutane og lever væv af ikke-overvægtige diabetiske /svær kombineret immundefekt (NOD /SCID) mus. Antages det, at disse forskelle var relateret til de vidt forskellige udtryk mønstre af miRNA mellem disse to cellepopulationer, vi undersøgte miRNA profiler af SP-NLCS og SP-HCCs. Fordi HCSCs foreslås at blive HCC initierende celler, identificere forskellene mellem SP-HCCs og SP-NLCS, herunder deregulerede miRNA, kan i høj grad hjælpe med at forstå tilblivelsen af ​​HCSCs og tumorgenese af HCC.

Materialer og metoder

1. Prøvetagning

Tredive mandlige Fisher 344 rotter (fra National Rodent Laboratory Animal Resource, Shanghai, Kina) blev tilfældigt inddelt i kontrol- og forsøgsgrupper. Rotter i forsøgsgruppen blev behandlet med 0,05% DEN (Sigma Co., USA) i deres drikkevand i 6 uger og blev derefter ændret til normal drikkevand [25], hvorimod rotter i kontrolgruppen fik en normal diæt. Tre rotter fra hver gruppe blev aflivet under bedøvelse ved 2, 6, 10, 14 og 18 uger efter DEN induktion. Begge HCC knuder fra forsøgsgruppen og normale lever fra kontrolgruppen blev indsamlet. Dele af disse væv blev fikseret i 10% phosphatbufret neutralt formalin og behandles rutinemæssigt og farvet med Hematoxylin og Eosin (H Sigma) i 15 min. Fluorescensen blev observeret gennem et passende filter ved hjælp af et fluorescensmikroskop (FV1000MPE, Olympus Co., Tokyo, Japan).

8. Påvisning af leveren markører ved western blotting

Efter induktion af HGF, western blotting blev udført for kvantitativt påvise specifikke lever markører i de inducerede celler. ALB og CK-7 blev undersøgt i SP-NLCS, NSP-NLCS og SSP-NLCS; AFP og CK-19 blev analyseret i SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs. Celler blev lyseret i hel-celle ekstraktionsbuffer (RIPA-buffer) indeholdende en proteasehæmmer cocktail tablet (Complete-Mini, Roche Diagnostics, Mannheim, Tyskland). Homogenaterne blev centrifugeret ved 3000 x g i 20 minutter ved 4 ° C, og supernatanterne blev opsamlet. Proteiner blev separeret på 12% SDS-polyacrylamidgel og overført til en Immobilon-P PVDF (polyvinylidenfluorid) membran (Millipore, Billerica, MA, USA). Blottene blev mættet med blokeringsbuffer (5% skummetmælk i TBS-T) i 1 time ved stuetemperatur og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med kanin-anti-human /rotte /mus monoklonale antistoffer (1:600; Santa Cruz Biotechnology , Inc., Santa Cruz, CA) og et glyceraldehyd-3-phosphat-dehydrogenase (GAPDH) antistof (1:600, Sigma, Saint Louis, MO). Efter vasket i TBS-T, blev membranerne inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med HRP-gede-anti-kanin IgG (1:2000; Perkin Elmer, Inc., Waltham, MA). Påvisning af proteinerne blev udført ved anvendelse af en ECL-systemet (Cell Signaling Technology, Beverly, MA, USA). De gråtoner værdier for hvert bånd på blots blev målt ved hjælp BandScan4.3.

9. Leverskade model og celletransplantation

SP-NLCS og NSP-nlcs blev uafhængigt vasket med PBS i mørke og resuspenderet i 2 ml farvningsopløsning at mærke cellemembranen med rød fluorescens ved 37 ° C, i henhold til protokol følger med PKH26 rødt fluorescerende celle linker kit (Sigma Corp., USA). Serumholdigt medium blev tilsat til farvning opløsningen til afslutning af farvningen 5 min senere. Farvede celler blev vasket tre gange med PBS og suspenderet i 0,5 ml PBS til transplantation. For at inducere leverbeskadigelse, 20 normale F344-rotter (10 for SP-NLCS transplantation, 10 for NSP-NLCS injektion) blev indgivet CCl

4 intraperitonealt i en dosis på 1,2 ml /kg legemsvægt og modtog en to tredjedele partiel hepatektomi (2/3 PH) tre dage senere. Umiddelbart efter PH, de forberedte celler (5 x 10

5 celler pr rotte) blev hver injiceret i disse rotter gennem portalen vene.

For hver lever, vi skære tilfældigt fire frosne snit. For at vurdere kolonisering virkninger af SP-NLCS og NSP-NLCS blev de restaurerede leversnit ses under et omvendt mikroskop. Hvornår blev observeret røde områder i sektionerne var resultatet identificeret som positivt. Under hver synsfelt blev de positive områder talt og procentdelen af ​​den positive område i forhold til hele området blev beregnet. En procent af røde område af 5% blev defineret som negativ (-), 5-25% som positiv (+), 25-50% som moderat positiv (++) og 50%, som stærkt positiv (++ +).

10. NOD /SCID xenograft transplantation eksperimenter

Forskellige tal (1 × 10

7, 1 × 10

6, 1 × 10

5 og 1 x 10

4) af SP- HCCs eller NSP-HCCs blev injiceret i NOD /SCID-mus ved subkutan injektion. Hver gruppe indeholdt 4 mus; således blev 32 mus brugt til xenotransplantation. Hver mouce blev udført med 4 injektioner, symmetrisk 2 injektioner i venstre back og 2 injektioner i højre back. Tumorvækst blev overvåget hver 2 dage efter den anden uge af podning. Alle mus blev aflivet på dag 60. Alle de tumorvæv blev opsamlet, fikseret i 4% formaldehyd og indlejres i paraffin for H grad 2 (+), diameteren af ​​tumoren 0,2 cm; grad 3 (++), 0,2-0,5 cm; grad 4 (+++), . 0,5 cm

11. Ekspressionen af ​​miRNA i SP-celler

Totale RNA’er blev opnået fra både SP-NLCS og SP-HCCs af det totalt RNA-isolering kit (Ambion, Austin, TX). Kvaliteten og kvantiteten af ​​totale RNA’er blev kontrolleret ved 1,5% agarosegelelektroforese og ultraviolet kvantificering. Ekspressionsprodukterne profiler af miRNA blev derefter detekteret af miRCURY LNA ™ (Locked Nucleic Acid) microRNA Arrays Kit (Exiqon Co, Danmark), der omfatter alle menneske, mus og rotte miRNA antisense-sekvenser. Derudover kittet også indarbejdet 144 miRPlus ™ prober, som blev leveret af Exiqon Corporation for hidtil ukendte miRNA detektion. Et mikrogram af RNA fra SP-HCCs, SP-NLCS og referencestoffer puljer blev co-hybridiseret på Exiqon miRNA Array i 16 timer ved 56 ° C. Efter inkubation med Cy3-mærkede dendrimerer (Genisphere Inc, Hatfield, PA) [29], blev mikroarrays vasket konsekutivt med vaskebuffere A, B og C. De fluorescerende signaler på den hybridiserede arrayet blev erobret af en GenePix 4000B scanner og kvantificeres ved hjælp af GenePix Pro4.0 (Axon Instruments, Burlingame, CA). Data manipulation blev lettet med Normalisering Suite v1.63 (Ontario Cancer Institute, Toronto, Canada) [30]. Testen til referenceandelen for hver miRNA blev beregnet som gennemsnit af tredobbelte pletter og mellem replikate eksperimenter. Nøgletal større eller mindre end to gange blev anset for at være opreguleret eller nedreguleret, hhv.

To meget up-regulerede miRNA, tre lidt up-regulerede miRNA, en høj grad nedreguleret miRNA og et moderat nedreguleret miRNA blev udvalgt som repræsentative miRNA som skal bekræftes af kvantitativ real time polymerasekædereaktion (QRT-PCR). Totale RNA’er blev revers-transskriberet af MultiScribe (Applied Biosystems) i reaktionsblandinger indeholdende MIR-specifikke hårnåle-revers-transkription (RT) -primere (tabel 1). PCR-primerne er anført i tabel 1, og cyklusparametre for PCR-reaktionen var 95 ° C i 15 minutter efterfulgt af 40 cykler af et denatureringstrin ved 95 ° C i 15 sek og en annealing /forlængelsestrin ved 60 ° C i 60 sek. Alle reaktioner blev kørt tredobbelt. Den relative mængde af hver miRNA til U6 RNA blev beskrevet ved ligningen ΔC

T = (C

TmiRNA-C

TU6) [31]. Den fold ændring i miRNA fra SP-HCCs sammenlignet med SP-NLCS vises ved hjælp af ligning 2

-ΔΔCT, hvor ΔΔC

T = (ΔC

T SP-HCCs-ΔC

T SP- NLCS).

12. Mål af deregulerede miRNA

12.1. . Forudsigelse af potentielle mål for deregulerede miRNA

De potentielle mål for de deregulerede miRNA fundet af de ovennævnte metoder blev forudsagt af to offentligt tilgængelige algoritmer, herunder miRBase Mål-version 5 (findes på: http: //microrna.sanger .ac.uk /) og Targetscan version 4.2 (https://www.targetscan.org/).

12.2 Identifikation af mål ved semikvantitativ realtid polymerasekædereaktion (sQRT-PCR).

Vi sammenfattet dokumenterede mål for syv validerede liberaliserede miRNA. Blandt disse mål blev miR-200a * målgener ZEB1 og ZEB2 [32], [33] analyseret i både SP-HCCs og SP-NLCS af sqrt-PCR. Totalt RNA blev ekstraheret fra celler under anvendelse af Trizol-reagens (Molecular Research Center, Cincinnati, OH), og revers transkriberet til cDNA ved SuperScript II revers transkriptase ifølge producentens anvisninger (Invitrogen, Carlsbad, CA). Lige store mængder af cDNA fra disse to prøver blev forstærket med følgende specifikke primere: ZEB1 (Sense 5’AAGAAAGTGTTACAGATGCAGCTG-3 ‘, Antisense 5’CCCTGGTAACACTGTCTGGTC-3′); og ZEB2 (Sense 5’-ATACCAGCGGAAACAAGGATTTCA-3 ‘, antisense 5′-CAGGAATCGGAGTCTGTCAAGTCA-3’). Antallet af PCR-cykler var 35. Hver cyklus bestod af denatureringstrin ved 95 ° C i 30 s, primerannealing trin ved 65 ° C i 30 s og forlængelse ved 72 ° C i 45 s. PCR-produkterne blev analyseret ved 1,5% agarosegelelektroforese farvet med ethidiumbromid.

13. Statistiske analyser

Data udtrykkes som middelværdien ± standardfejl fra mindst tre separate forsøg udført tredobbelt. Forskelle mellem grupper blev analyseret med SAM-software version 3.0 ved hjælp af en dobbeltsidet Students

t

-test når kun to grupper var til stede, og nulhypotesen blev afvist på 0,05-niveau.

Resultater

1. Væv forberedelse og cellekultur

NL væv fra kontrolgruppen var lyse rød og vises glatte overflader (figur 1A-i). Når disse levere blev skåret i tynde sektioner blev fuldstændigt normalt levervæv afsløret (figur 1A-ii). Upon H Primære dyrkede HCC-celler for (B-iv) 4 dage, (B-v) 15 dage og (B-vi) 30 dage. Nederste panel: isolering af forskellige subpopulationer. (C-i) Uden verapamil: SP-celler blev vist som procent af NLCS; (C-II) med verapamil: profilen af ​​SP celler faldt kraftigt. (C-III) Uden verapamil: SP-celler blev vist med lav fluorescens i HCCs; (C-IV) med verapamil: fluorescens af fraktion SP-celler skiftet til et højere niveau. (C-v) De procentdele af SP-celler i forskellige grupper er afspejlet i et søjlediagram. Oprindelig forstørrelse, 200 × (A, B-iii), 100 × (A, B-iv, v, vi).

små tumorer blev først fundet i rotter aflivet 8 uger efter DEN induktion. Efter yderligere 10 uger, to tredjedele af leverne indeholdt tumorvæv med ru overflader (Figur 1B-i). Vi fandt også talrige metastatisk cancer knuder i lungerne (Figur 1B-II). Tre forskellige patologer vurderede H 0,05). (Figur 1C-v)

3. Self-fornyelse af SP celler

To standard funktioner er kendetegn for stamceller: selvfornyelse og multipotency. For selvfornyelse, SP-HCCs spredt den hurtigste i løbet af syv dage kultur, efterfulgt af SP-NLCS, SSP-HCCs, SSP-NLCS og NSP-HCCs (som spredt på samme måde), og endelig, NSP-NLCS (figur 2A ). Generelt SP celler prolifererede meget hurtigere end både NSP celler og SSP-celler (

P

0,01), og HCCs spredt lidt hurtigere end NLCS. Fordi det oprindelige antal af hver cellepopulation var de samme, helt forskellige celletal var til stede i hver gruppe ved afslutningen af ​​dyrkningsperioden (figur 2B). SP-celler (figur 2B-I, IV) viste sig at være mere homogene og meget mindre i størrelse end begge NSP-celler (figur 2B-II, V) og SSP-celler (figur 2B-III, VI) (

P

0,01). Der blev imidlertid ikke observeret nogen signifikante morfologiske forskelle mellem SP-NLCS (Figur 2B-i) og SP-HCCs (Figur 2B-iv). Således kan disse to populationer ikke skelnes fra hinanden under et inverteret mikroskop. Kurve

(A) Væksten celle under 7 dage kultur. (B) Efter amplifikation blev distinkte celledensiteter observeret i de forskellige subpopulationer. (C) Udtrykket af stamcelle markører (CD133 og EpCAM) var forskellig i hver frisk isoleret og forstærket subpopulation ved FACS. (D) De nøjagtige data blev reflekteret af et søjlediagram. CD133 /EpCAM-Fresh indikerer ekspressionen af ​​CD133 /EpCAM i frisk isolerede subpopulationer, og CD133 /EpCAM-Amplified betyder ekspression af CD133 /EpCAM i forstærkede subpopulationer. Original forstørrelse, 100 × (B).

I begyndelsen af ​​kultur, både SP-NLCS og SP-HCCs udtrykte flere af stamcelle markører end NSP-NLCS og NSP-HCCs henholdsvis (

P

0,01) (Figur 2C). Følgende procentdele af positive celler i hver delpopulation blev observeret: CD133 procenter i SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs var 81,2 ± 7,08, 11,4 ± 1,31, 30,3 ± 3,21 , 86,7 ± 8,32, 12,7 ± 1,39 og 31,6 ± 3,42, henholdsvis; EpCAM procenter i disse subpopulationer var 80,1 ± 8,10, 10,6 ± 1,21, 31,2 ± 3,18, 86,5 ± 3,28, 12,4 ± 1,31 og 32,6 ± 3,67 hhv. Ved afslutningen af ​​den kultur periode, stadig udtrykte SP-NLCS og SP-HCCs flere af stamcelle markører end NSP-NLCS og NSP-HCCs henholdsvis (

P

0,01) (Figur 2D). Desuden udtryk for stamceller markører faldt meget langsommere i SP celler end i både SSP celler og NSP-celler (

P

0,01). De følgende procenter blev observeret: CD133 procenter i SP-NLCS, NSP-NLCS, SSP-NLCS, SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs var 78,6 ± 6,98, 3,4 ± 0,33, 20,2 ± 2,03, 80,5 ± 7,86, 3,6 ± 0,30 og 20,7 ± 2,38, henholdsvis; EpCAM procenter i disse subpopulationer var 78,1 ± 7,53, 3,5 ± 0,28, 21,5 ± 2,17, 80,3 ± 8,12, 2,3 ± 0,27 og 20,2 ± 2,28 hhv. Under proliferation periode, både SP-NLCS og SP-HCCs opretholdt den høje ekspression af stamcellemarkører; derimod både NSP-NLCS og NSP-HCCs mistede efterhånden udtryk for stamcelle markører. Disse data antyder, at SP-celler ligner stamceller i deres selvfornyelse kapacitet.

4. Differentiering af SP celler induceret af HGF in vitro

Under induktion betingelser, hver delpopulation genereret forskellige udvækster. Fordi NLCS bør differentiere til hepatocytter eller biliære epithelceller, valgte vi en moden hepatisk markør (ALB) og en galde markør (CK-7) for at identificere modne celler. De fleste SP-NLCS udvidet til plader af tætpakkede celler, der viste typiske hepatocyt morfologi og blev identificeret som ALB positive celler (66,9 ± 5,34%). En portion af SP-nlcs differentieret i CK-7-positive celler (24,6 ± 2,41%) (figur 3A). Selv om både NSP-NLCS og SSP-NLCS også kunne generere ALB-positive celler, kun flere CK-7-positive celler kunne findes i induceret SSP-NLCS, og ingen CK-7-positive celler blev fundet i inducerede NSP-NLCS (figur 3A) . Disse data viser, at kun SP-NLCS havde et stort potentiale til at differentiere til forskellige typer af modne celler. Western blotting viste, at selv om cellerne genereret af NSP-NLCS udtrykte højere ALB end cellerne fra SP-NLCS og SSP-NLCS, døtre af SP-NLCS udtrykte meget højere niveauer af CK-7 end Døtre SSP-NLCS og NSP NLCS (figur 3C). Især CK-7 vises næsten ingen udtryk i døtre NSP-NLCS (figur 3C). Disse data var overensstemmende med IF observationer.

(A) gennem IF, ALB positive celler (grøn, kerner i blåt) og CK-7 positive celler (grøn, kerner i blåt) blev forskelligt produceret af SP- NLCS, NSP-NLCS og SSP-NLCS. De procentdele af ALB eller CK-7 positive celler er vist i et søjlediagram. (B) I modsætning hertil kunne AFP positive celler findes efter SP-HCCs, NSP-HCCs og SSP-HCCs induktion. Dataene er opsummeret i et søjlediagram.