PLoS ONE: Karakterisering af desmoglein Expression i Normal Prostata Gland. Desmoglein 2 er en uafhængig Prognostisk faktor for Aggressive Prostata Cancer

Abstrakt

Formål

udtryk for desmogleins (DSG gearkasser), som er kendt for at være afgørende for oprettelse og vedligeholdelse af celle-celle adhæsion kræves for vævs integritet, er blevet godt karakteriseret i epidermis og hårsækken; imidlertid deres ekspression i andre epitelvæv såsom prostata dårligt forstået. Selv nedregulering af klassiske cadheriner, såsom E-cadherin, er blevet beskrevet i prostatakræft vævsprøver, ekspressionen af ​​desmogleins er kun blevet rapporteret tidligere i prostata cancercellelinier. I denne undersøgelse kendetegnet vi desmoglein ekspression i normale prostatavæv, og videre, om desmoglein 2 (DSG2) ekspression specifikt kan tjene som en potentiel klinisk prognostisk faktor for patienter diagnosticeret med primær prostatacancer.

Eksperimentel udformning

Vi udnyttet immunofluorescens at undersøge DSG2 udtryk i normal prostata (

n

= 50) og i et klinisk velkarakteriseret kohorte af patienter med prostatacancer (

n

= 414). Korrelation af DSG2 udtryk med klinisk-patologiske egenskaber og biokemiske gentagelse blev analyseret for at vurdere dens kliniske betydning.

Resultater

Disse undersøgelser viste, at DSG2 og DSG4 specifikt blev udtrykt i prostata luminale celler, mens basal celler mangler deres ekspression. I modsætning hertil blev DSG1 og DSG3 ikke udtrykkes i normal prostata epitel. Yderligere analyser af DSG2 udtryk i prostatakræft afslørede, at reducerede niveauer af denne biomarkør var en signifikant uafhængig markør for dårlig klinisk resultat.

Konklusion

Her rapporterer vi for første gang, at en lav DSG2 udtryk fænotype er en nyttig prognostisk biomarkør for tumor aggressivitet og kan tjene som en hjælp til at identificere patienter med klinisk signifikant prostatacancer

Henvisning:. Barber AG, Castillo-Martin M, Bonal DM, Rybicki BA, Christiano AM, Cordon -Cardo C (2014) Karakterisering af desmoglein Expression i Normal Prostata Gland. Desmoglein 2 er en uafhængig Prognostisk faktor for Aggressive prostatakræft. PLoS ONE 9 (6): e98786. doi: 10,1371 /journal.pone.0098786

Redaktør: Craig N. Robson, Northern Institute for Cancer Research, England

Modtaget: Februar 17, 2014 Accepteret: 7 maj 2014; Udgivet: 4 Jun 2014

Copyright: © 2014 Barber et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde er delvist støttet af National Institutes of Health giver P01-CA087497 (CCC og MCM) og R01-ES11126 (BAR). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

desmosomes er en type celle-celle forankring junction findes i væv med en høj grad af mekanisk belastning, og tab af desmosomer adhæsion er associeret med sygdomme, der påvirker huden, håret, og hjerte [1] – [ ,,,0],13]. I desmosom er cadherin-familien af ​​proteiner repræsenteret ved de såkaldte “ikke-klassiske” cadheriner, som omfatter desmogleins (DSG 1-4) og desmocollins (DSC 1-3) [14]. Desmogleins og desmocollins spiller en dobbelt rolle i dannelsen af ​​desmosomer. I det ekstracellulære rum, desmogleins og desmocollins om modsatrettede celler interagerer i en heterofil calcium-afhængig måde via deres cadherin gentagne domæner. Intracellulært de cadheriner binder til plakoglobin og plakophilin, som igen binder til desmoplakin. Desmoplakin binder derefter til intermediære filamenter, dermed sikre hele strukturen til cytoskelettet [15], [16]. Mens helt klart vigtigt at opretholde integriteten af ​​voksent væv, er den rolle, desmosom cadheriner i kræft progression mindre godt forstået. Tab af heterozygositet nær det kromosomale region, der indeholder desmosom cadherin-genklyngen er blevet rapporteret i esophageal cancer samt hoved og hals pladecellecarcinom [17], [18]. Ændringer i ekspressionen af ​​desmogleins er blevet rapporteret for en række forskellige cancere. Reduceret ekspression af DSG2 er blevet rapporteret i gastriske og pancreatiske carcinomer [19] – [21]. Omvendt overekspression af DSG2 og DSG3 er blevet rapporteret i planocellulært karcinom i huden samt hoved- og halscancer, henholdsvis [22], [23].

udtryk for desmosom cadheriner er blevet grundigt kendetegnet ved epidermis, hårsækken, og arachnoidal væv. Mens ekspressionen af ​​DSG2 vides at være allestedsnærværende i alle desmosom-dannende væv er ekspressionen af ​​de resterende desmosom cadheriner uden for epidermis og hårsækken dårligt forstået [24]. En undersøgelse foretaget af Whittock og Bower i 2003 udnyttet RT-PCR til at analysere ekspressionen af ​​

DSG4

i et panel af væv og oplevede, at

DSG4

kunne påvises i flere væv, herunder prostata, hvilket tyder at desmoglein ekspressionsprofilen af ​​prostata kan strække sig ud over den allestedsnærværende ekspression af DSG2 [25]. Nedreguleringen eller tab af celle-celleadhæsion-proteiner – såsom den klassiske cadherin, E-cadherin – er et fælles træk ved en række forskellige cancere, herunder prostatacancer, og kan være forårsaget af en række forskellige mekanismer [26], [ ,,,0],27]. Omvendt, selvom den afvigende ekspression af desmogleins er blevet rapporteret i flere typer af cancer, ekspressionen af ​​disse cadheriner i prostatacancer er kun blevet rapporteret i cellelinier til dato [28] – [30]. I denne undersøgelse har vi karakterisere for første gang ekspressionen af ​​desmogleins i normale humane prostata vævsprøver og bestemme den specifikke celletype, i hvilken prostataspecifikt desmogleins udtrykkes. Vi derefter analysere udtryk for DSG2 i et godt karakteriseret prostatacancer patient kohorte, og undersøge sammenhængen mellem DSG2 udtryk og patienternes kliniske resultat. Vores resultater viser, at DSG2 og DSG4 specifikt udtrykkes i de luminale celler af normal human prostata, hvorimod DSG1 og DSG3 ikke udtrykkes i prostata epitel. Endvidere blev fundet reduceret ekspression af DSG2 at være uafhængigt forbundet med en kortere biokemisk recidiv, hvori den potentielle nytte af DSG2 udtryk som en prognostisk biomarkør for prostatakræft aggressivitet.

Materialer og metoder

Etik erklæring

Frosne normale menneskelige prostata væv slides svarende til prostata overgangszone med histologisk bekræftet områder af normale kirtler fra patienter, som gennemgik en radikal prostatektomi blev opnået anonymt fra Columbia tumor Bank service i overensstemmelse med Institutional Review Board of Columbia University protokol # AAAB2447. Den TMA’er brugt i denne undersøgelse blev bygget i Cordon-Cardo laboratorium, og blev genereret fra 414 radikal prostatektomi sager, der oprindeligt er indsamlet fra september 2000 og januar 2005 på Henry Ford Health System i Detroit, efter en Institutional Review Board godkendte protokol # 1018 [31]. Hver deltager afsluttet en kort telefonisk interview (demografi og sygehistorie), en fødevare frekvens spørgeskema, og et ansigt-til-ansigt interview på jobrelaterede engagementer. Derudover har alle deltagere tilvejebragt en blodprøve for genetiske analyser og til PSA-test. Tilmelding lukket i foråret 2005, og IRB forbliver åben for PSA opfølgning (ikke-patient kontakt) for at studere emner.

Cell Culture og RNA Isolation

benign prostata epitelial BPH- 1-cellelinien (en generøs gave fra Dr. Ralph Buttyan, og kommercielt tilgængelige gennem det tyske samling af mikroorganismer og cellekulturer; DSMZ, Braunschweig, Tyskland) blev dyrket i RPMI med 10% føtalt bovint serum (FBS) (Invitrogen, Carlsbad, CA). Tre humane metastaserende prostatacancer cellelinier blev anvendt i denne undersøgelse: DU145, PC3 og LNCaP. Den DU145 cellelinje (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i MEM med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). PC3 cellelinje (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i F12K med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). LNCaP-cellelinje (ATCC, Manassas, VA) blev dyrket i RPMI med 10% FBS (Invitrogen, Carlsbad, CA). For at isolere RNA, blev cellerne vasket i 1X PBS, trypsinbehandlet, og pelleteret via centrifugering. Celler blev dyrket fire dage tidligere konfluens forud for RNA-isolering, som det tidligere er blevet rapporteret, at deres fulde desmoglein ekspressionsprofil nås på dette tidspunkt [32]. Cellepellets blev resuspenderet i 1X PBS og derefter pelleteret via centrifugering for at vaske. Dette vasketrin blev gentaget to gange for at fjerne alle spor af medier forud for høst RNA. RNA blev derefter høstet under anvendelse af RNeasy Mini Kit og QIAshredder efter fabrikantens protokol med titlen “Oprensning af totalt RNA fra dyreceller Brug Spin Technology” (Qiagen, Valencia, CA).

Antistoffer Salg

Anti -DSG3 (klon 5H10) og DSG1 (klon 27B2) monoklonale antistoffer fra mus er tidligere blevet beskrevet og blev givet til os som en generøs gave fra Dr. James Wahl; begge blev anvendt i en fortynding på 1:10 [33]. Anti-DSG2 monoklonalt muse-antistof (klon 10G11) blev indkøbt fra ARP, Inc (Belmont, MA) og anvendt i en fortynding på 1:50 til immunofluorescensanalyse af normale prostatavæv og cellelinier; anti-DSG1 /2-mus monoklonalt antistof (klon DG3.10) blev indkøbt fra Fitzgerald (Acton, MA) og anvendt i en fortynding på 1:20 for TMAs. Anti-DSG4 marsvin polyklonale antistof blev genereret af Dr. Lutz Langbein og givet os som en generøs gave, blev dette antistof anvendt ved fortynding af 1:2000. Anti-cytokeratin 14 (CK14) kanin-polyklonalt antistof blev indkøbt fra Covance (Princeton, NJ) og anvendt i en fortynding på 1:1000. Anti-PSA monoklonalt museantistof blev indkøbt fra Dako (Carpinteria, CA) og anvendt i en fortynding på 1:20. Anti-PSA kanin-monoklonalt antistof blev købt fra Abcam (Cambridge, MA) og anvendt i en fortynding på 1:200. Anti-cytokeratiner 8/18 (Ck8 /18) marsvine polyklonalt antistof blev købt hos Progen (Heidelberg, Tyskland) og anvendt i en fortynding 1:100. Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 sekundære antistoffer blev købt hos Invitrogen (Carlsbad, CA) og blev anvendt ved en fortynding på 1:600.

RT-PCR

Totalt RNA fra human normal hud og normal prostata (begge stammer fra en enkelt donor) blev købt kommercielt (Agilent Technologies Inc., Santa Clara, CA). Første streng cDNA blev fremstillet under anvendelse af oligo dT og SuperScript II First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. PCR blev udført under anvendelse Platinum PCR Supermix (Invitrogen, Carlsbad, CA) og primere til transkripterne af interesse (opsummeret i tabel S1). Den følgende PCR protokol blev anvendt: trin 1: 94 ° C i 3 min; trin 2: 94 ° C i 30 sek, 56 ° C i 45 sek, 72 ° C i 2 min; trin 3: 72 ° C i 10 min; gentag trin 2 for 34 cykler. PCR-produkter blev underkastet elektroforese på en 1% agarose /1X TBE-gel indeholdende ethidiumbromid og visualiseret ved hjælp af Kodak Elektroforese Dokumentation og analysesystem 120 kamera (Kodak, Rochester, NY).

QRT-PCR

RNA blev høstet fra cellelinier af interesse som beskrevet. Første streng cDNA blev fremstillet under anvendelse af oligo dT og SuperScript III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Carlsbad, CA) ifølge producentens instruktioner. QRT-PCR blev udført på en Stratagene Mx3005P maskine og analyseret under anvendelse Stratagene MxPro QPCR software (Stratagene, Santa Clara, CA). Alle reaktioner blev udført under anvendelse QuantiTect SYBR Green PCR Master Mix (Qiagen, Valencia, CA), 200 nM af primere (opsummeret i tabel S1), og 10 ng cDNA i en 20 pi reaktionsvolumen. Følgende PCR-reaktionen blev anvendt: trin 1: 95 ° C i 10 minutter; trin 2: 95 ° C i 15 sek, 60 ° C i 1 min; gentag trin 2 for 40 cykler. Alle prøver blev kørt i fire eksemplarer, og prøver blev normaliseret mod en endogen intern kontrol, β-actin.

Immunofluorescens-Frosne væv og cellelinier

Frosne normale menneskelige prostata væv slides svarende til prostata overgangsperiode zone med histologisk bekræftet områder af normale kirtler fra patienter blev anvendt til at karakterisere antistofferne til påvisning desmoglein ekspression. Cellelinier blev dyrket på dækglas (Fisher, Pittsburgh, PA) i 6-brønds vævskulturplader (BD Falcon, Bedford, MA). Slides /dækglas blev fikseret i kold 100% methanol i 15 min ved -20 ° C efterfulgt af kold 100% acetone fiksering i 2 min ved -20 ° C. Slides /dækglas blev vasket i 1X phosphatpufret saltopløsning (PBS) med omrøring, permeabiliseret med 1% Triton-X100 i 1X PBS ved stuetemperatur i 5 min, og igen vasket i 1X PBS under omrøring. Slides /dækglas blev inkuberet i 0,1% Triton X-100/1% bovint serumalbumin (BSA) /1 x PBS blok ved stuetemperatur i 1 time, efterfulgt af primære antistof inkubering natten over ved 4 ° C. Den følgende dag dias /dækglas blev vasket i 1X PBS med omrøring, derefter en 1:600 ​​fortynding af sekundært antistof, enten Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), blev tilsat, og diapositiver /dækglas blev inkuberet ved stuetemperatur i 45 minutter. Slides /dækglas blev derefter vasket i 1X PBS med agitation, nedsænket kortvarigt i vand og monteret ved hjælp Vectashield montering medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Immunofluorescens Analyse af Tissue Microarray (TMA) Sektioner

TMA’er blev bygget som følger: Hematoxylin Eosin farvede snit fra formalin-fikserede paraffin-indstøbt (FFPE) prostatektomi prøver blev revideret for at identificere levedygtige, morfologisk repræsentative områder af normale prostata kirtler og acinar adenocarcinom fra, som kan tages nål kerneprøver. Fra hver prøve, tredobbelte tilstødende væv kerner med diametre på 0,6 mm blev udstanset og grupperet på en modtager paraffinblok anvendelse af et præcisions instrument (Beecher Instruments, MD). Alle slag blev opnået fra et fokus med den højeste Gleason score, og størstedelen af ​​slag blev taget fra den dominerende tumor knude – defineret som den største knude med den højeste Gleason score og scene i en bestemt prostatektomi prøve. Opfølgende data for alle de sager om dokumentation for biologisk tilbagefald var til rådighed for denne undersøgelse. Hinanden følgende fem mikrometer sektioner af disse TMA blokke blev anvendt til immunofluorescensanalyse, og det første afsnit blev farvet med Hematoxylin Eosin for at tjene som en skabelon for morfologi. Objektglassene blev afparaffiniseret og rehydreret, og antigen-genvinding blev udført ved opvarmning glider i en damper i citratpuffer, pH 6,0 i 15 minutter. Objektglas blev derefter vasket en gang i 1 x PBS. Slides blev inkuberet i 0,1% Triton X-100/1% BSA /1 x PBS blokerende serum ved stuetemperatur i 1 time efterfulgt af primære antistof inkubering natten over ved 4 ° C. Den følgende dag blev objektglassene vasket i 1X PBS med omrøring, derefter en 1:600 ​​fortynding af sekundært antistof, enten Alexa Fluor 594 eller Alexa Fluor 488 (Invitrogen, Carlsbad, CA), blev tilsat, og objektglassene blev inkuberet ved stuetemperatur i 45 min . Objektglas blev derefter vasket tre gange i 1X PBS + 0,1% Triton X under omrøring, vasket tre gange i 1X PBS, nedsænket kortvarigt i vand og monteres ved hjælp af Vectashield Mounting Medium med DAPI (Vector Laboratories, Burlingame, CA). Ck8 /18 udtryk blev brugt til at identificere alle epiteliale områder (både tumor og normale kirtler) i kerner og ekspression af proteiner af interesse blev scoret ved at bestemme den procentdel af tumorceller med immunoreaktivitet pr væv kerne (fra 0% til 100% ), uden at overveje intensitet signal. Evalueringen blev udført af en uropathologist (MCM) efter tidligere anvendte metode: tumor områder i kernen blev først identificeret af DAPI, bekræftes af tilstedeværelsen af ​​Ck8 /18 og derefter scoret ved at etablere en procentdel af tumorer celler med membran udtryk for DSG2 [ ,,,0],34] .De gennemsnitsværdierne for de repræsentative kerner fra hver patientprøve blev derefter anvendt til statistiske analyser. En positiv cut-off på 60% blev anvendt til at udføre statistiske analyser af korrelation med klinisk-patologiske træk og overlevelse som dette var den omtrentlige median udtryk værdi observeret for DSG2 i denne prostatacancer kohorte, som tidligere rapporteret i litteraturen [35].

prostatakræft kohorte og klinisk-patologiske egenskaber

i denne undersøgelse analyserede vi en kohorte af 414 patienter diagnosticeret med primær prostatacancer. Klinisk-patologiske træk af disse patienter er opsummeret i tabel 1. Mean alder ved diagnose var 61 år (spændvidde: 41-74.7 år). De fleste patienter var hvide (56%) eller afroamerikanske (43%). Mean opfølgning var 56,8 måneder (interval: 1.4-123.6 måneder). Kun 98 (24%) af patienterne viste en biokemisk tilbagefald, defineret som at have to på hinanden følgende påviselige stigende PSA niveauer ( 0,2 ng /ml) fire uger eller mere efter operationen. Biokemisk gentagelse gratis overlevelseskurver svarende til kendte klinisk-patologisk risikofaktorer som Pre-kirurgisk PSA, Patologisk Stage, Gleason score, Angiolymphatic invasion og perineurale invasion, er vist i figur S1.

Statistisk analyse

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS v18.0 (IBM, Armonk, NY). Den t-test blev anvendt til at sammenligne ekspressionen af ​​proteinet af interesse i primær prostatacancer og normal prostata væv. Spearman rang korrelation blev brugt til at analysere sammenhængen mellem proteiner af interesse og klinisk-patologiske træk. Biokemisk tilbagefald overlevelse blev analyseret under anvendelse Kaplan-Meier-overlevelseskurver, og kurverne blev sammenlignet under anvendelse af log-rank test. Multivariat analyse herunder DSG2 udtryk og klinisk-patologiske parametre blev udført ved hjælp af Cox proportional hazard model. En

P

-værdi ≤0.05 blev betragtet som statistisk signifikant.

Resultater

Desmogleins er specielt Udtrykt i luminale Celler af Human Normal prostata

Da ekspression af desmogleins i prostatakirtlen var ikke blevet karakteriseret til dato, begyndte vi denne undersøgelse ved at undersøge den fulde desmoglein ekspressionsprofil i normalt humant prostatavæv, anvendelse af RT-PCR og immunfluorescens analyser. RT-PCR-analyse viste, at de fleste desmogleins kunne let påvises i normalt humant prostata på RNA-niveau, med undtagelse af

DSG1

som viste kun svag mRNA-ekspression (figur 1A). Immunofluorescensanalyse viste, at kun ekspressionen af ​​DSG2 og DSG4 kunne være let og konsekvent påvist i prostata epitel på proteinniveauet (Figur 1B-C), mens DSG1 og DSG3 ikke var påviselig i den normale prostata epitel (fig S2).

(A) klart udtryk for mRNA for de fleste desmogleins, med undtagelse af

DSG1

som viser kun svag udtryk. (B-C) repræsentant immunofluorescens-analyser af DSG2 (B) og DSG4 (C) ved cellekanten normalt humant prostata kirtelepitel. Original forstørrelse: 200X. Scale barer svarer til 100 um.

Efter at have konstateret udtryk for desmogleins i normal menneskelig prostata, vi havde til formål at bestemme den celletype specifikke udtryk for DSG2 og DSG4. Kirtelvævet af prostata består af kanaler og acini, der er foret med simpelt kubisk epithel overfor lumen af ​​kirtlerne. Ud over denne sekretorisk komponent, to andre specialiserede celler er en integreret del af prostata kirtelstrukturer, nemlig de basale celler og neuroendokrine celler [36], [37]. Luminale celler udskiller, blandt andre molekyler, prostataspecifikt antigen (PSA) og repræsenterer den vigtigste funktionelle enhed af organet. Disse celler danner et sammenhængende lag, der ligger oven på de basale celler. De basale celler er kendetegnet ved ekspressionen af ​​højmolekylære cytokeratiner (CKS) – såsom CK14 – og P63. Spredt over hele acini er den tredje celle population, de neuroendokrine celler, oprindelsen og funktion som i den normale prostata er endnu ikke veldefinerede.

Co-immunfluorescens analyse blev udført for at undersøge lokalisering af DSG2 og DSG4 med CK14 specifikt basal cellemarkør samt den luminale specifikke protein, PSA. Co-immunofluorescensanalyse af DSG2 og CK14 viser, at DSG2 håndfast udtrykkes i de luminale celler i prostata, og at dette udtryk sjældent co-lokaliseres med den for basal CK14 ekspression (figur 2A-C). Analyse af DSG2 og PSA-ekspression afslørede co-lokalisering af begge biomarkører i de luminale celler (Figur 2D-F). Ekspressionen af ​​DSG4 var meget svarende til den i DSG2, der viser stærk ekspression i de luminale celler, sjældent co-lokalisere med basal CK14 ekspression (figur 2G-I), men co-lokalisere med luminal PSA-ekspression (figur 2J-L). Endvidere ekspressionen af ​​DSG2 viste næsten fuldstændig co-lokalisering med den for DSG4, med de fleste luminale celler viser en endnu ekspressionsniveau for begge desmogleins og nogle celler, der viser en lidt højere ekspressionsniveau for én i forhold til den anden (fig 2M- O). Tilsammen illustrerer disse resultater, at ekspressionen af ​​DSG2 og DSG4 hovedsagelig er begrænset til de luminale celler af humane prostata epitelceller kirtler.

(A-C) DSG2 udtrykkes i de luminale celler i prostata kirtler og dette ekspression sjældent co-lokaliseres med basalcelle CK14 ekspression. (D-F) DSG2 co-lokaliseres med PSA ekspression i den luminale rum af kirtlen. (G-I) DSG4 kommer også til udtryk i de luminale celler og sjældent co-lokaliserer med basal celle CK14 udtryk. (J-L) DSG4 ekspression co-lokaliseres med luminal celle PSA ekspression. (M-O) Ekspressionen af ​​DSG4 viser også næsten fuldstændig co-lokalisering med den for DSG2 i luminale celler. Original forstørrelse: 200X. Scale barer svarer til 100 um.

DSG2 udtrykkes i Human Prostata Cancer Cell Lines

Efter at have karakteriseret udtryk for desmogleins i normalt humant prostata væv, vi har ønsket at fokusere på DSG2 for den resterende del af undersøgelsen, da dette er den mest udtrykte desmoglein isoform – viser allestedsnærværende ekspression i alle desmosom danner væv. Efter vores tidligere opdagelse, at DSG2 udtrykkes i normal human prostata epitel, spurgte vi, om dette protein også udtrykkes i human prostatacancer-cellelinier. For at undersøge dette spørgsmål, blev QRT-PCR udført på RNA udvundet fra tre kommercielt tilgængelige og godt karakteriserede metastatiske humane prostatakræft-cellelinier (figur 3A). De cancercellelinier anvendt til denne del af undersøgelsen omfatter LNCaP-cellelinien, som var afledt af en prostatacancer, metastaseret til lymfeknuderne; PC3 cellelinjen, der blev afledt af en prostatacancer, metastaseret til benet; og DU145 cellelinien, som var afledt af en prostatacancer, metastaseret til hjernen [38] – [40]. Det BPH-1-cellelinien tjente som en kontrol for denne undersøgelse, da det er en immortaliseret, ikke-tumorigen prostataepitelcellelinie cellelinie afledt fra en patient med benign prostatahyperplasi, ikke en betingelse relateret til malign prostata transformation [41]. Resultaterne af denne QRT-PCR-analyse viste, at

DSG2

udtrykkes på forskellige niveauer i alle undersøgte cellelinjer. Interessant ekspressionen af ​​

DSG2

er større i alle de metastatiske prostatacancercellelinjer undersøgte, end det er i den ikke-tumorgene BPH-1 kontrol linjer.

(A) DSG2 ekspression detekteres i alle cellelinier undersøges, herunder normale immortaliseret prostata cellelinie BPH-1. Data er repræsenteret som middelværdi ± SD. ** P 0,01; *** P 0,001. (B-E) DSG2 udtrykkes ved celle grænsen til LNCaP og DU145 celler; dog cellekanten udtryk ikke påvist i PC3 celler med kun nogle celler, der viser svag, punktformet, og diffus farvning (indsæt forstørrelse; vist på 2,5X). Original forstørrelse: 200X. Skalapanelerne svarer til 100 um.

Dernæst immunofluorescensanalyse blev anvendt til at undersøge ekspressionen af ​​DSG2 i disse metastatiske humane prostatacancer-cellelinier på proteinniveauet (figur 3B-E). Cellekanten ekspression af DSG2 blev detekteret i BPH-1, LNCaP, og DU145 celler. Imidlertid manglede PC3-celler, ekspression af DSG2 ved cellekanten, mens en lille population af celler viste kun en diffus granulær farvning for DSG2 i cytoplasmaet (se indsæt forstørrelse i figur 3D). Disse resultater er i overensstemmelse med og yderligere at forfine resultaterne af en tidligere undersøgelse af Lang

et al.

Hvor et antistof specifikt for både DSG1 og DSG2 blev anvendt til at undersøge desmoglein udtryk i LNCaP, PC3, og DU145 celler [ ,,,0],29], [42]. Resultaterne af QRT-PCR og immunofluorescensanalyse viser, at ekspressionen af ​​

DSG2

er til stede i alle prostatacancercellelinjer og at der i to af de undersøgte tre prostatacancercellelinjer, DSG2 lokaliseres til cellen grænsen tyder på, at desmosomer dannelse bevares i de fleste metastatisk prostatacancer cellelinjer undersøgte

in vitro

.

En lav DSG2 Fænotype er forbundet med tumorprogression hos patienter med primær prostatacancer

som tidligere nævnt, mens tabet af klassisk cadherin ekspression er blevet beskrevet i prostatacancer, til dato ekspressionen af ​​desmosom cadheriner i prostatacarcinom vævsprøver er ikke blevet rapporteret. For at vurdere procentdelen af ​​celler positive for DSG2 ekspression i prostatacarcinom sammenlignet med normale prostatavæv blev immunofluorescensanalyse af DSG2 ekspression udført på prostatacarcinom TMAs (

n

= 414) samt normal prostata TMAs (

n

= 50). Foruden et antistof for proteinet af interesse, et antistof for Ck8 /18 – cytokeratiner fundet i både normal prostata luminale epitelceller og adenocarcinomceller -. Der blev også indbefattet på hver TMA som et middel til at identificere de epiteliale celler i hver prøve

Et signifikant fald i procentdelen af ​​celler positive for DSG2 ekspression blev fundet i prostatacarcinomer sammenlignet med normal prostata (tabel 2 og figur S3). Normal prostata epitel var præget af en høj procentdel af celler positive for DSG2 udtryk (gennemsnitlig udtryk for 81,1%, median på 84,5%), mens prostata tumor prøver viste en signifikant lavere procentdel af DSG2 positive celler (gennemsnitlig udtryk for 57,5%, median af 66,7%;

P

= 0,0002). En cut-off værdi på 60% DSG2 positive celleekspression blev anvendt, da dette var den omtrentlige median udtryk værdi observeret for DSG2 i prostatacancer kohorte, og medianen er tidligere og bredt blevet anvendt til at udføre overlevelse analyser [35]. Brug af denne afskæringsværdi, observerede vi, at 96% af normale prostata vævsprøver blev betragtet som positive for DSG2, sammenlignet med kun 46% af prostata carcinoma prøver undersøgt. Især er mængden af ​​celler, der var positive for cellekanten ekspression af DSG2 var generelt højere i godt differentierede områder af tumoren, mens mængden af ​​celler, der viser dette udtryk var ofte meget lavere i dårligt differentierede områder af tumoren (Figur 4A-L ), en konstatering, der blev yderligere valideret af Spearman rang korrelation (tabel 3).

(a-L) repræsentant immunofluorescens analyse af DSG2 og Ck8 /18 i prostatakræft. (D, E-H) TMAs viser høj DSG2 ekspression i cellen grænse godt differentierede områder af tumoren (panel D, indvendig gul stiplet linie). (D, I-L) TMAs viser lav DSG2 ekspression i ringe differentierede områder af tumoren (felt D, der er vist i den resterende del af tumoren uden af ​​den gule stiplet linie). Original forstørrelse: 200X. Skalapanelerne svarer til 100 um. (M) Patienter, der udtrykker højere niveauer af DSG2 havde en signifikant længere gentagelse overlevelse end dem udtrykke lavere niveauer af DSG2 (

P

= 0,01). Vejviser

korrelationen mellem ekspressionen af ​​DSG2 og klinisk-patologiske karakteristika oftest forbundet med en aggressiv prostatakræft fænotype, herunder serum præoperativ PSA koncentration, Gleason score og patologisk Stage blev derefter undersøgt ved anvendelse af Spearman rang korrelation (tabel 3). Interessant, var der en signifikant negativ korrelation mellem DSG2 udtryk og Pre-kirurgisk PSA koncentration samt Gleason Score. Disse resultater viste, at en lav-til-negative DSG2 udtryk fænotype var forbundet med øget serum Pre-kirurgiske PSA koncentrationsniveauer, samt med høj Gleason Scores.

Nedsat DSG2 Expression er en uafhængig faktor i forbindelse med en dårlig Klinisk Outcome hos patienter med primær prostatacancer

Efter at have undersøgt sammenhængen mellem DSG2 fænotype og klinisk-patologisk risikofaktorer for prostata karcinom, vi næste afgøres, om DSG2 udtryk er forbundet med biokemisk recidiv overlevelse. Interessant, patienter, hvis tumorer udtrykte ≥ 60% DSG2 havde en længere tilbagefald overlevelse end dem udtrykke 60%, og forskellen mellem disse to grupper var statistisk signifikant (figur 4 M,

P

= 0,01). blev observeret for patienter med 60% DSG2 udtryk fænotype, mens dem med ≥60% DSG2 udtryk fænotype ikke nåede median tid til biokemisk: En median tid til biokemisk gentagelse af 103.7 måneder (87.7-119.8 måneder CI 95% interval) tilbagefald efter en follow-up tid på 123,6 måneder. Endnu vigtigere, når vi udførte en multivariat analyse, observerede vi, at DSG2 ekspression var en uafhængig faktor for biokemisk tilbagefald (HR = 1,579,

P

= 0,050), såvel som de klassiske klinisk-patologiske træk: Gleason score og Patologisk Stage (tabel 4). Taget sammen viser disse resultater, at nedsat DSG2 ekspression er en uafhængig biomarkør forbundet med en kortere biokemisk tilbagefald i prostatacancer, hvilket afslører den potentielle kliniske anvendelighed af DSG2 som prognostisk biomarkør for tumor aggressivitet for patienter ramt med dette hyppigt forekommende sygdom.

diskussion

de resultater, der præsenteres i denne undersøgelse giver den første molekylær karakterisering af desmoglein udtryk i normalt humant prostata, karakterisering af DSG2 i metastatisk prostatacancer cellelinjer, og den første analyse af DSG2 udtryk i vævsprøver fra primære prostatacarcinom. Resultaterne her rapporterede viser, at mens de fleste desmogleins er tydeligt til udtryk i den humane prostata på RNA-niveau, er kun DSG2 og DSG4 konsekvent identificeret på et højt niveau i normalt humant prostata på proteinniveauet.