PLoS ONE: Blærekræft Diagnose og Identifikation af klinisk signifikant sygdom ved kombineret Urinary Påvisning af MCM5 og nuklear Matrix Protein 22

Abstrakt

Baggrund

Urinary biomarkører til detektering blærekræft er begrænset af utilstrækkelig sensitivitet eller specificitet. Her vurderer vi den diagnostiske nøjagtighed MCM5, en roman cellecyklus biomarkør for afvigende vækst, alene og i kombination med NMP22.

Metoder

1677 konsekutive patienter, der undersøges for urinvejene malignitet blev rekrutteret til en prospektiv blindet observationsstudie. Alle patienter gennemgik ultralyd, intravenøs urografi, cystoskopi, urin kultur og cytologisk analyse. En immunofluorometric assay blev anvendt til måling MCM5 niveauer i urin celle sedimenter. NMP22 urin niveauer blev bestemt med FDA-godkendte NMP22® Test Kit.

Resultater

tarmkanalen kræft urogenitale blev identificeret i 210/1564 (13%) patienter med en MCM5 resultat og i 195/1396 (14%) patienter med en NMP22 resultat. Ved analysen cut-punkt, hvor følsomhed og specificitet var lige, MCM5 testen opdaget primære og tilbagevendende blære kræft med 69% sensitivitet (95% konfidensinterval = 62-75%), og 93% negativ prædiktiv værdi (95% CI = 92- 95%). Arealet under modtageren opererer karakteristisk kurve for MCM5 var 0,75 (95% CI = 0,71-0,79) og 0,72 (95% CI = 0,67-0,77) for NMP22. Vigtigere, MCM5 kombineret med NMP22 identificeret 95% (79/83; 95% CI = 88-99%) af potentielt livstruende diagnoser (dvs. grad 3 eller carcinoma in situ eller stadiet ≥pT1) med høj specificitet (72%, 95% CI = 69-74%).

konklusioner

MCM5 immunoassay er en non-invasiv test til identifikation af patienter med urothelial kræftformer med lignende nøjagtighed til FDA-godkendte NMP22 ELISA test Kit. Kombinationen af ​​MCM5 plus NMP22 forbedrer påvisning af UCC og identificerer 95% af klinisk signifikant sygdom. Forsøg med en kommercielt udviklet MCM5 assay egnet til en slutbruger laboratorium sammen NMP22 er forpligtet til at vurdere deres potentielle kliniske anvendelighed i at forbedre diagnostik og pleje overvågning veje

Henvisning:. Kelly JD, Dudderidge TJ, Wollenschlaeger A, Okoturo O, Burling K, Tulloch F, et al. (2012) Blærekræft Diagnose og Identifikation af klinisk signifikant sygdom ved kombineret Urinary Påvisning af MCM5 og nuklear Matrix Protein 22. PLoS ONE 7 (7): e40305. doi: 10,1371 /journal.pone.0040305

Redaktør: Clive Shiff, Johns Hopkins University, USA

Modtaget: Februar 23, 2012; Accepteret: 4 Jun 2012; Udgivet: 9 juli 2012

Copyright: © 2012 Kelly et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Research UK (tilskud nummer C428 /A3441 til KS og GHW). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

urotelial celle carcinom (UCC) af urinblæren er den 4. mest almindelige kræftform i USA, med en anslået 73510 nye tilfælde og 14880 dødsfald som følge blærekræft i 2012 [1]. Cystoskopi er standardmetoden blære tumor afsløring, men det er en invasiv, ubehagelige og bekostelig procedure, som resulterer i urinvejsinfektion hos op til 5% af tilfældene [2]. Påvisning af blærecancer med en ikke-invasiv tumor markør test kan potentielt forbedre forvaltningen af ​​sygdommen ved at øge nøjagtigheden og mindske sygelighed i forbindelse med de nuværende diagnostiske og overvågning veje. Gennem mindre hyppig cystoscopies, kan forbedringer i patientens livskvalitet og omkostningseffektivitet ses.

Urinary biomarkører til detektering af blærekræft lover godt, og mens mange markører har myndighedsgodkendelse ingen er blevet accepteret som en standard diagnostisk procedure [3]. Urinary cytologi stadig den mest anvendte på grund af høj specificitet, selv ringe følsomhed. Nye teknologier og biomarkører, men har potentiale til at forbedre diagnostisk nøjagtighed, med de mest effektive diagnostiske og overvågning strategier til dato udnytte fotodynamisk cystoskopi og biomarkører [4]. Nuklear matrix protein 22 (NMP22), for eksempel, er et nukleart mitotiske apparat-protein der regulerer kromatid og datter celleseparation [5], [6] og har vist sig som en af ​​de lovende urinveje biomarkører for UCC [3]. FDA-godkendte, laboratorie-baserede kvantitativ NMP22® Test Kit immunoassay (Matritech, Freiburg, Tyskland) og en kvalitativ point-of-care test, NMP22® BladderChek® (Matritech; ® symbol udeladt nedenfor), er nu tilgængelige for klinisk brug . Men selv om urin NMP22 niveauer er forhøjede i blærekræft, døde og døende urothelial celler i mange ikke-maligne og inflammatoriske tilstande kan også frigive NMP22 og dermed reducere specificitet. Desuden har en bred markeret område i analysepræcisionen blevet rapporteret mellem forskellige undersøgelser med anvendelse NMP22, med følsomhed varierer fra 33% til 100% og specificitet fra 40% til 93% [4].

begrænset nøjagtighed tilgængelige biomarkører, sammen med deres bekostning, har derfor begrænset indførelse af urin biomarkører i rutinemæssig klinisk praksis. der stadig Derfor et presserende behov for at identificere nye biomarkører, der kan forbedre diagnostisk nøjagtighed, enten når de anvendes alene eller i kombination med eksisterende biomarkør tests [7].

DNA-replikation indledning maskiner repræsenterer en endelig og afgørende skridt i vækstkontrol nedstrøms for komplekse redundante onkogene signalveje og er derfor en potentielt attraktiv diagnostisk og terapeutisk mål [8]. Proteiner ifølge minikromosom vedligeholdelse (Mcm) familie (Mcm2-7, samlet benævnt MCM), samles til hexamere komplekser, som har DNA helicase-aktivitet, hvilket er vigtigt for initiering af DNA-syntese [9], [10]. I epitel-foret organsystemer MCM-proteiner bliver fejlreguleret og overudtrykt i hyperproliferativ dysplastiske (preinvasive) og maligne tilstande, [8], [11] – [13]. Faktisk har vist graden af ​​ekspression af MCM2 og MCM5 at forudsige tilbagefald og død hos patienter med blærecancer [14] – [16]. Mcm2-7 proteinekspression i normal epitel er begrænset til de basale stængel /transit rum og er fraværende fra overfladelag som celler vedtage en fuldt differentieret fænotype. I præmaligne /dysplastiske epitellæsioner der er en udvidelse af den proliferative rum koblet til standset differentiering, hvilket resulterer i fremkomsten af ​​cykling MCM-positive celler i overfladiske lag. Påvisningen af ​​eksfolierede MCM-positive celler i kliniske prøver tilvejebringer derfor en potentielt følsom metode til påvisning preinvasive og invasive cancere [8], [17], [18]. I en proof-of-principle studie tidligere viste vi, at forhøjede MCM5-niveauer i celler i urin sedimenter forudsiger tilstedeværelsen af ​​blærecancer [19].

Formålet med denne undersøgelse var at evaluere MCM5 som biomarkør til påvisning af blærecancer alene, i sammenligning og i kombination med NMP22. Den prospektiv blindet observationelle forsøg udnyttet en immunofluorometric assay til måling MCM5 og FDA-godkendte NMP22 Test Kit.

Metoder

Undersøgelse Emner

Single annulleret urinprøver blev indhentet fra 1677 patienter der deltager i et one-stop diagnostisk klinik for undersøgelse af hæmaturi. Diagnosen blev etableret efter vurdering ved cystoskopi, øvre urinveje billedbehandling, urin cytologi og kultur. Histologisk bekræftelse af blærekræft ved efterfølgende trans-urethral resektion var reference standard og alle patienter blev fulgt i en periode på seks måneder fra tidspunktet for første undersøgelser. Patienter med en historie af nyere urogenitale instrumentering eller operation inden for de sidste to uger blev udelukket. Patienter med tidligere af samtidig malignitet eller anden malignitet inden for fem år forud for undersøgelsen, blev også udelukket. Med disse undtagelser alle konsekutive patienter deltog til undersøgelse i undersøgelsesperioden blev kontaktet for rekruttering til forsøget

Urinprøver blev delt ligeligt til:. (I) urinanalyse og mikrobiologisk kultur, (ii) cytologiske analyse, (iii ) MCM5 måling og (iv) NMP22 måling. Patienter gennemgik øvre billeddannelse urinveje, herunder ultralyd og intravenøs urografi. Mandlige patienter blev undersøgt af digital rektal undersøgelse for forekomst af klinisk påviselig prostata sygdom. Prostata-specifikt antigen (PSA) test blev ikke mandat og PSA niveauer blev kontrolleret i en del af tilfældene hos hvem kræft blev mistænkt eller som anmodet testen. Hvis PSA niveauer var forhøjede patienter fik tilbudt trans-rektal ultralyd guidet centrale biopsier af prostata. Typisk alle hæmaturi tests blev afsluttet inden for 24 timer og inden for to uger for alle patienter. Kliniske data blev indtastet i en database fremadrettet før MCM5 og NMP22 analyse. Referencen standard til påvisning af blærekræft var patologisk bekræftelse efter trans-urethral resektion.

Urinprøver blev analyseret i et blindet mode for MCM5 afsløring, NMP22 test, og cytologisk analyser. Ved afslutningen af ​​undersøgelsen, afkodede vi patientdataene og sammenlignet immunofluorometric MCM5 signaler og NMP22 resultater med kliniske diagnoser baseret på cystoskopi, biopsi histologi, billedbehandling og urin cytologi. Iscenesættelse og planering af maligne tumorer blev udført af en specialist uro-patolog ved hjælp af TNM (tumor-node-metastaser) klassifikationssystem [20] og 1973 World Health Organization (WHO) klassificering systemet henholdsvis [21].

Etik Statement

Etisk godkendelse blev opnået fra de fælles UCL /UCLH udvalg om den etiske for human Research (04 /Q0502 /1), Addenbrooke Hospital etiske komité (00/236) og Newcastle og Nord Tyneside Research etiske komité (2002/161). Skriftligt informeret samtykke blev modtaget fra alle deltagere.

Urin Cytologi

Urinprøver (50 ml) blev centrifugeret ved 1500 g i 5 min. Cytospinpræparater blev udarbejdet på poly-L-lysin coatede slides bruger Shandon cytospin rør og en cytocentrifuge i overensstemmelse med producentens anvisninger (Thermo Shandon, Runcorn, UK). Prøver blev fikseret i industrielt methyleret sprit og farvet under anvendelse af Papanicolaou teknik til smears [20]. Prøver blev evalueret ved en konsulent cytologist oplevet i uro-patologi. Cytologi blev scoret som positiv, hvis der konstateres atypiske eller maligne celler.

NMP22 Assay

NMP22 blev målt ved enzymbundet immunsorbentassay (ELISA) under anvendelse af FDA-godkendte NMP22 Test Kit produceret af Matritech (Freiburg, Tyskland). Analysen køres på en Dade Behring BEP 2000 automatiseret ELISA processor (nu Siemens Healthcare). Alle reagenser, kalibratorer og kontroller var forberedt som anbefalet af producenten. Alle standarder blev kvalitetskontrol og prøver analyseret dobbelt. Resultater blev beregnet under anvendelse af databehandlingssoftware følger med BEP 2000. Den nedre detektionsgrænse assayet viste sig at være 2 U /ml. Prøver med koncentrationer over den øverste standard blev gentaget efter fortynding i analysebuffer. Den mellem-batch variationskoefficient var 13,3% ved en koncentration på 11,3 U /ml, 8,8% ved 34 U /ml og 9,5% ved 65 U /ml. Et resultat NMP22 test var til rådighed i 1396 patienter, herunder 195 patienter (14%) med et urotelial tumor.

Immunofluorometric Assay til måling MCM5 Niveauer i urin Sedimenter

MCM5 blev målt ved to -site tidsopløst fluorescens immunoassay på AutoDELFIA analysator (Perkin Elmer). Alle standarder, kvalitetskontrol og urinprøver blev fremstillet og behandlet som beskrevet [19]. Nunc Maxisorp mikrotiterplader (Perkin Elmer) blev overtrukket med 12A7 muse-anti-humant MCM5 monoklonalt antistof [19] i en koncentration på 8 mg /L af Dako UK Ltd (Ely, UK). En stor batch (ca. 200) af plader blev fremstillet ved Dako og anvendt gennem hele undersøgelsen. Plader blev modtaget præblokeret og klar til brug. En anden muse-anti-humant MCM5 monoklonalt antistof (4B4) [19] blev konjugeret med europium af Dako. Det europium-mærkede antistof var i en koncentration på 1,75 mg /ml. HeLa S3-celler blev købt kommercielt (Health Protection Agency kultur Samlinger, Porton Down, UK) og analysen blev kalibreret med forarbejdede HeLa celle standarder i en koncentration på 150000 celler /brønd. En række standarder, der spænder over koncentrationsområdet 150000 til 1500 celler /brønd blev fremstillet ved fortynding af standardstamopløsning i phosphatbufret saltvand indeholdende 0,04% SDS og 0,02% natriumazid. Kvalitet kontrolprøver med fire forskellige koncentrationer af HeLa-celler blev analyseret ved begyndelsen og slutningen af ​​hver batch. Protokollen for AutoDELFIA analysen var som følger. 50 pi standard, prøve eller kvalitetskontrol blev tilsat (in duplo) til antistofcoatede mikrotiterplade sammen med 100 pi DELFIA multibuffer (Perkin Elmer produktkode 1380-3614). Pladen blev inkuberet i 2,5 timer under stadig omrystning. Pladen blev derefter vasket fire gange med DELFIA-vaskebuffer (Perkin Elmer produktkode B117-100). Europium-mærket detektionsantistof 4B4 blev fortyndet 1:1,800 i DELFIA multibuffer. 100 pi fortyndet antistof blev tilsat til hver brønd, og pladen inkuberes i yderligere 4 timer under stadig omrystning. Pladen blev derefter vasket seks gange med DELFIA-vaskebuffer og 200 pi DELFIA enhancement-opløsning (Perkin Elmer produktkode B118-100) blev tilsat til hver brønd. Pladen blev inkuberet på en ryster i yderligere 10 min. Mængden af ​​europium i hver brønd blev målt på AutoDELFIA pladelæseren. Data blev automatisk overført til en Multicalc softwarepakke (Perkin Elmer), som blev anvendt til at generere en kalibreringskurve og beregning af koncentrationen af ​​de ubekendte. Den nedre grænse for påvisning af assayet blev fundet at være 1000 celler /brønd. Prøver med koncentrationer over den øverste standard blev gentaget efter fortynding i standard fortynding buffer. Den mellem-batch variationskoefficient var 11,5% ved en koncentration på 2648 celler /brønd og 11,0% på 26382 celler /brønd. Et resultat for immunofluorometric MCM5 testen var til rådighed i 1564 patienter, herunder 210 patienter (13%) med et urotelial tumor.

Statistisk analyse

Sensitivitet og specificitet karakteristika MCM5 og NMP22 til påvisning af UCC af blæren præsenteres som modtager driftskarakteristik (ROC) kurver. Arealet under parametriske ROC-kurve blev anvendt til at vurdere den samlede diagnostiske resultater for hver test. Tre cut-punkter blev anvendt til at påvise test ydelse under forskellige omstændigheder for MCM5 som følger: (i) den nedre detektionsgrænse for assayet hvor testens følsomhed var maksimal (1000 celler /brønd) (ii) følsomhed lig med specificitet (2150 celler /brønd) og (iii) 95% specificitet (8500 celler /brønd). Negativ prædiktiv værdi (NPV) og positiv prædiktiv værdi (PPV) blev også estimeret. En nøjagtig 95% konfidensinterval (CI) for hver andel, herunder sensitivitet, specificitet og prædiktive værdier for MCM5 og NMP22, blev udledt under antagelse af en binomialfordeling. Producentens anbefalede cut-point for NMP22 blev 10 U /ml anvendes til alle analyser medmindre andet er angivet.

Falsk positive satser (FPR) til MCM5 og NMP22 test i patienter med benign diagnose blev sammenlignet med klare normale patienter, der bruger en Chi-squared test. Den MCM5 og NMP22 værdier blev samlet under anvendelse medianer og interkvartile intervaller (IQR) og sammenlignet med de klare normale patienter ved anvendelse af Mann-Whitney U-test. For hver biomarkør blev ROC-analyse gentages for mænd og kvinder separat og arealet af de ROC kurver blev sammenlignet ved hjælp af en Chi-squared test med en frihedsgrad. ROC-analyse blev også forpligtet sig til at undersøge følsomheden af ​​de vigtigste resultater med udelukkelse af dem med godartet sygdom. Værdierne af de urin biomarkører for patienter med forskellige tumor kvaliteter og stadier og normale patienter blev sammenlignet ved hjælp af Mann-Whitney U-test mellem tilstødende kategorier, og ved hjælp af Jonckheere-Terpstra test for trend tværs kvaliteter og stadier. Chi-squared test for lineær ved lineær Foreningen blev anvendt til at vurdere beviserne for en tendens i de falsk positive satser ved at øge tumor kvalitet og scene. Følsomheden bestemmes for urin cytologi blev sammenlignet med den for immunofluorometric MCM5 test med McNemars test for parrede proportioner. Nøjagtigheden af ​​en biomarkør blev defineret som værdien af ​​sensitivitet og specificitet hvor skæringspunktet billede disse lig. Nøjagtigheden af ​​de to biomarkør tests blev sammenlignet ved hjælp McNemar test. McNemars test blev også anvendt til at sammenligne følsomheden af ​​cytologi med den for hver biomarkør ved cut-point leverer den samme specificitet som observeret for cytologi. Spearman korrelation blev anvendt til at vurdere, i hvilken grad de biomarkører var karakteristisk i UCC tilfælde og i normale kontrolgrupper. Alle statistiske tests var to-halede, og en 5% niveau blev anvendt til at indikere statistisk signifikans.

En multi-ROC-analyse [22] blev udført for at bestemme den ekstra ydeevne som følge anvende begge biomarkører sammen. I denne analyse blev NMP22 holdt fast i den anbefalede cut-point på 10 U /ml og MCM5 indgik med en varierende cut-point. Hævede værdier af enten markør kunne forudsige positive for UCC. Den yderligere resultater MCM5 over det opnået fra NMP22 (10 U /ml cut-point) blev vurderet ved anvendelse af parametriske areal under multi-ROC-kurve, og vurderet for statistisk signifikans ved anvendelse af en chi i anden-test med en frihedsgrad. For at demonstrere test ydeevne, blev MCM5 derefter fastsat til cut-punkt, der leveres lige så stor følsomhed og specificitet på multi-ROC-kurve fra at bruge de kombinerede markører. Denne kombination test nøjagtighed blev sammenlignet med testen nøjagtighed, som brug af NMP22 alene ved hjælp McNemar test.

Resultater

Demografi og Clinical Investigation

De demografiske karakteristika, form for præsentation , endelige diagnose, og tumorklassificering og fase for de 1677 patienter inkluderet i denne undersøgelse er opsummeret i tabel 1. undersøgelsen var overvejende mænd (62%) og havde en gennemsnitsalder på 60,7 år (standardafvigelse 16,3 år). Af dem med en optaget præsentation, 54% havde synlige hæmaturi og 46% havde ikke-synlige hæmaturi. Disse patienter var nyligt præsentere sager, selv om fire patienter rekrutteret, senere afslørede en tidligere historie UCC. Der blev udeladt i en del af tilfældene som følger: cystoskopi blev ikke udført i 20 patienter, ultralydsskanning i 186 patienter og intravenøs urografi i 223 patienter. Urin cytologi var utilgængelig for 109 patienter på grund af utilstrækkelig prøvetagning eller alternativt fordi testen ikke blev foretaget. Hverken ultralyd scanning eller intravenøs urografi blev udført i 77 patienter. Alle patienter havde en klinisk diagnose tillagt dem deres læge. Data blev ikke formelt indsamlet på de negative virkninger af standard klinisk afprøvning og ingen skadelige virkninger af urin test for MCM5 eller NMP22 blev registreret.

Efter klinisk undersøgelse, urinvejsinfektioner tumorer blev identificeret i 222/1677 patienter (13%). Næsten alle tumorer var UCCS, men, efterforskning identificerede også et tilfælde af adenocarcinom og to tilfælde af pladecellekræft i blæren. De UCCS var overvejende blæretumorer, med kun syv patienter med øvre tarmkanalen tumorer. De øverste UCCS tarmkanalen er inkluderet sammen med blæretumorer til analyse rapporteres nedenfor. De diagnoser i de resterende patienter omfattede andre maligniteter, godartede læsioner eller cyster i nyrerne, godartede inflammatoriske og medfødte tilstande, urolithiasis, benign prostatahyperplasi og nefrologiske sygdomme. De diagnoser er anført i tabel S1. Som en del af den diagnostiske vej, urin cytologi havde en følsomhed på 9% (95% CI, 5-14%, herunder atypisk cytologi som positiv), specificitet på 88% (95% CI, 86-89%) og PPV af 10% (95% CI, 7-15%).

MCM5 og NMP22 test Resultat

MCM5 test diskrimineret, med høj specificitet og følsomhed, mellem patienter med og uden blærekræft, som hvilket det store areal under ROC-kurven (AUC) (0,75 [95% CI = 0,71-0,79]) (figur 1), statistisk signifikant større end det område antaget af nulhypotesen (0,5; P 0,001) og baseret på 210 og 1354 patienter henholdsvis med og uden UCC.

følsomhed, specificitet og positive og negative prædiktive værdier (PPV og NPV) for MCM5 er vist i tabel 2. cut-point analyse (cut -point svarer til (i) nedre detektionsgrænse for assayet, (ii) hvis følsomhed er lig med specificitet, og (iii) specificitet på 95% for alle testede patienter), demonstrerede en lang række test ydelsesniveauer (tabel 2) . Ved den nedre detektionsgrænse assayet testen havde 80% (167/210) (95% CI = 73-85%) følsomhed og 20% ​​(167/846) (95% CI = 17-23%) PPV. Når følsomheden er lig med specificitet, testen havde 69% (145/210) (95% CI = 62-75%) følsomhed og 26% (145/565) (95% CI = 22-30%) PPV. Ved 95% specificitet (1286/1354), testen havde 42% (89/210) (95% CI = 36-49%) følsomhed og 57% (89/157) (95% CI = 49-65%) PPV .

NMP22 test diskrimineret med høj specificitet og følsomhed som det fremgår af den store AUC (0,72 [95% CI = 0,67-0,77]; nulhypotesen [0,5; P 0,001] (figur 1) ) og baseret på 195 og 1201 patienter henholdsvis med og uden UCC. Følsomhed, specificitet og positive og negative prædiktive værdier for NMP22 ved den anbefalede 10 U /ml cut-point er vist i tabel 2. Følsomhed var 53% (104/195) (95% CI = 46-60%) og PPV 36% (104/291) (95% CI = 30-42%).

for at vurdere resultaterne af testen i patienter med forskellige stadier og kvaliteter af sygdom True Positive Rate (TPR) var beregnet for MCM5 (på de forskellige cut-point), NMP22 og cytologi for muskel invasiv versus non-muscle invasive (tabel S2) og på tværs af karakterer (tabel S3). Test ydeevne forbedres for alle prøver i højere kategorier scenen og lønklasse

Hvor specificitet NMP22 (cut-punkt 12.1) var den samme som for positiv cytologi (88%, 989/1128)., Følsomheden af NMP22 var signifikant højere (P 0,001) (51%; 91/177 versus 8%, 14/177). Hvor specificiteten af ​​MCM5 (5150-celle cut-point) var den samme som den for cytologi (87%; 1109/1271) følsomheden af ​​MCM5 var signifikant højere (P 0,001) (52%; 100/193 versus 9% ; 17/193)

Biomarkør False Positive Analyse

Falske positiver blev fundet i 400/1301 (31%) af klare normale og godartede diagnose patienter med MCM5 test i 2150-celle. cut-point. Der var en signifikant højere Andelen af ​​falsk positive resultater i kvindelige patienter, 38% (200/520) sammenlignet med mænd 26% (200/781) (P 0,001). Urinary MCM5 niveauer var også signifikant højere i normale /godartede kvinder sammenlignet med mænd (median 1560 celler /brønd [IQR = 1000-3675 celler /brønd] vs median 1000 celler /brønd [IQR = 1000-2180 celler /brønd], P 0,001). Endvidere sammenlignet med normale patienter, dem med, urinvejssten havde en signifikant højere falske positiver (44% [47/106] vs 30% [201/661], P = 0,004) og højere urin niveauer af MCM5 protein (median 1840 celler /brønd [ 1000-3963 celler /brønd] vs 1040 celler /brønd [ 1000-2645 celler /brønd], P 0,001; tabel 3). Der var ingen tegn på en sammenhæng mellem den falske positive sats og nogen af ​​de andre godartede grupper, herunder inflammatoriske tilstande og benign prostatahyperplasi. I de klare normale og godartede patientgrupper var der ingen signifikante forskelle (P = 0,99) i NMP22 niveauer mellem mænd og kvinder. En hævet NMP22 signal og øget falsk positiv rate blev observeret for patienter med urinvejsinfektioner (FPR: 22% vs 11%, P = 0,001; median NMP22 resultat: 3,35 U /ml vs 2,2 U /ml, P 0,001) og urinvejssten (FPR: 23% vs. 11%, P = 0,001; NMP22:2.55 U /ml vs 2,2 U /ml, P = 0,047) (tabel 3)

ROC analyse for MCM5. og NMP22 blev gentaget observere resultater i alle mænd og kvinder (tabel S4 og figur S1). Der var ingen signifikante forskelle i AUC-værdierne for MCM5 mellem mænd og kvinder (p = 0,76), men der var en signifikant forskel i NMP22 AUC værdi mellem mænd og kvinder (AUC 0,69 for mænd vs 0,80 for kvinder, P = 0,025), tilsyneladende relateret til større NMP22 følsomhed hos kvinder.

Biomarkør False negative Analyse

tabel 4 og tabel S5 viser de falsk negative af urin MCM5 og NMP22 grupperet efter tumor kvalitet og scene. Der var tegn på en faldende tendens i falsk-negative sats med stigende tumor kvalitet og scene for både urin biomarkører. For grad 1, 2 og 3 henholdsvis de falske negative priser til urin MCM5 på 2150-celle cut-point var 52% (95% CI = 31-73%), 37% (95% CI = 28-46%) og 11% (95% CI = 4-22%; trend P 0,001). For NMP22 på 10 U /ml cut-point, de tilsvarende falsk negative var 80% (95% CI = 59-93%), 49% (95% CI = 40-59%) og 25% (95% CI = 14-40%; trend P 0,001). Lignende tendenser blev observeret for tumor fase. Et signifikant fald i amplituden af ​​MCM5 og NMP22 signal med lavere tumor kvalitet og scene blev observeret, i overensstemmelse med de stigende falsk negative observeret for disse grupper (tabel 4 og tabel S5).

Kombineret Biomarkør Multi -ROC Analyse

Der var 183 blære UCCS og 1100 normale patienter med assay data tilgængelige for begge urinmarkørerne. For disse patienter en MCM5 cut-punkt på 2180 celler /brønd billede lige så stor følsomhed og specificitet på 71% (130/183 og 777/1100), og for NMP22 en cut-punkt på 4,6 U /ml billede lige så stor følsomhed og specificitet 67% (123/183 og 742/1100). Selv om der var beskedent større ydeevne MCM5 sammenlignet med NMP22 med hensyn til nøjagtighed (71% mod 67%, forskel på 3,3%, 95% CI = -0.2-6.7%), denne forskel var ikke statistisk signifikant (McNemar test: P = 0,067).

Spearman korrelationskoefficienter mellem MCM5 og NMP22 var moderat høj (rho = 0,54) for UCC tilfælde og ubetydelig (rho = 0,08) for den normale gruppe, hvilket indikerer potentiale for de biomarkører til at give forskellige roller i en kombination. På grundlag af multi-ROC analyse immunofluorometric MCM5 test i kombination med NMP22 ved den anbefalede 10 U /ml cut-point, tilbyder en statistisk signifikant stigning i ydeevne (P 0,001) sammenlignet med NMP22 alene ved den anbefalede cut- punkt (areal under multi-ROC-kurve = 0,65, 95% CI = 0,58-0,71). Som en demonstration, hvis enten NMP22 overstiger 10 U /ml eller MCM5 overstiger 4200-celle cut-punkt, denne kombination giver følsomhed (131/183) og specificitet (789/1100) begge er lig med 72%, hvilket indikerer forbedring i forhold til brug af NMP22 alene hvor følsomhed (123/183) og specificitet (742/1100) begge lige 67% (72% mod 67%, forskel = 4,3% [95% CI = 1,5-7,0%], McNemar test P = 0,002) . I kombination med NMP22 ved 10 U /mL af MCM5 testen fjerner falske negativer fra NMP22 test, der tilbyder en forbedring fra 54% følsomhed NMP22 alene til 75% følsomhed med 65% specificitet (2800-celle cut-point), eller at 80% følsomhed med 58% specificitet (1900-celle cut-point), eller til maksimal følsomhed på 85% med 45% specificitet (1000-celle cut-point).

i kombination analyse med NMP22 ( 10 U /ml cut-point) og MCM5 (4200-celle cut-punkt, hvor sensitivitet og specificitet er ens), 100% (31/31) af muskel invasive cancere (dvs. trin ≥ T2), 93% (40/43 ) af pT1 tumorer og 53% (54/102) af pTA tumorer blev opdaget. Det samlede antal patienter med carcinom in situ var lav og 86% (6/7) blev påvist. Grad 1 sygdommen blev identificeret i 46% (10/22), grad 2 sygdom i 64% (68/106) og grad 3 sygdom i 96% (53/55) af tilfældene (herunder 6/7 tilfælde af carcinoma in situ) . Vigtigere er det, MCM5 kombineret med NMP22 identificeret 95% (79/83, 95% CI = 88-99%) af potentielt livstruende diagnoser (dvs. grad 3 eller SNG eller iscenesætte ≥pT1) med høj specificitet (72%, 95% CI = 69-74%).

diskussion

i en tidligere proof-of-concept studie viste vi, at forhøjede MCM5 niveauer i urin celle sedimenter er yderst prædiktive for blærekræft [19]. Den prospektiv blindet observationelle forsøg rapporteret her, der involverer et stort patient kohorte, bekræfter vores indledende observationer, at MCM5 er en følsom og specifik biomarkør til påvisning af UCC. Vigtigere er det, gennem multi-ROC-analyse, viser vi her, at MCM5 test i kombination med NMP22 på den etablerede cut-punkt 10 U /ml, øger diagnostisk nøjagtighed over NMP22 i isolation og identificerer næsten alle potentielt livstruende sygdom.

på trods af talrige undersøgelser i det sidste årti, den rapporterede nøjagtighed NMP22 test er meget varierende. Mange af de tidligere undersøgelser rekrutteret små til moderate antal forsøgspersoner og rapporteret høje følsomheder og særlige, over 80% [23] – [26]. Imidlertid har en lang række i analysepræcisionen observeret i nyere undersøgelser med følsomhed i området fra 33% til 100% og specificitet fra 40% til 93% [4]. En samlet analyse, herunder nyere forsøg antyder en følsomhed på omkring 68% og en specificitet på 79% [4]. En nylig store multi-institutionelle international retssag afslørede en markant variation i udførelsen af ​​den NMP22 test tværs deltagende institutioner med sensitivitet og specificitet spænder fra 36% til 86% og 50% til 94% [27]. Variabilitet er blevet tilskrevet mange forstyrrende faktorer, herunder biologiske, analytisk og epidemiologisk variable og metodisk bias.

Vores undersøgelse udgør den største prospektive observationelle forsøg nogensinde foretaget ved hjælp af den NMP22 urin biomarkør. Især ydeevnen ved 10 U /ml cut-point, med en følsomhed på 53% og specificitet på 84%, er noget under det rapporteret i den samlede analyse, men næsten identisk med den diagnostiske ydeevne rapporteret i Matritech støttede store patient kohorte forsøg med den NMP22 point-of-care proteomisk assay [4], [28]. Interessant vi observerede signifikant større diagnostisk nøjagtighed NMP22 hos kvinder end hos mænd.