PLoS ONE: En komparativ analyse af kliniske og Molekylær faktorer med fase af livmoderhalskræft i en brasiliansk Cohort

Abstrakt

Cell cyklus proteinekspression spiller en vigtig rolle i patofysiologien af ​​livmoderhalskræft. Imidlertid har kun få undersøgelser forsøgt at korrelere brugen af ​​disse biomarkører med den kliniske progression af tumoren.

Mål Salg

1) For at analysere ekspressionen af ​​Ki-67, p53 og p16

INK4a i livmoderhalskræft, 2) at korrelere den relative ekspression af disse proteiner samt kliniske parametre med den fase af sygdommen, og 3) at bestemme HPV-DNA-prævalens og undertype distribution.

Metoder

Tissue Micro-Arrays (TMA) fra patienter med invasiv livmoderhalskræft (ICC) og kontroller blev analyseret. HPV-DNA-detektion blev udført ved PCR og in situ hybridisering. Ki-67, p53 og p16

INK4a blev analyseret ved immunhistokemi; kliniske data stammer fra diagrammet review

Resultater

Avanceret tumor stadie (III og IV) blev stærkt forbundet (p 0,005). med fremskreden alder ( 55 år), med mere end fire graviditeter og med mangel på formel uddannelse. HPV-DNA blev fundet i 94,3% af tilfældene med de mest fremherskende typer er HPV16 (67,5%), efterfulgt af HPV33 (12,0%) og HPV35 (3,6%). Høj ekspression af Ki-67 og p16 var mere almindelig i de avancerede figo stadier (p = 0,023). Kvinder med HPV16 tendens til at være yngre (50,9 år SE 1.9) i forhold til kvinder med andre typer (59,9 år SE 2.8).

Konklusion

Vi fandt, at Ki-67 og p16-ekspression blev uafhængigt associeret med tumoren fase. Vi bemærkede også, at omkring 1/3 af de livmoderhalskræft i denne brasilianske kohorte ikke var forbundet med HPV-typer direkte målrettet mod de nuværende HPV-vacciner

Henvisning:. Amaro-Filho SM, Golub JE, Nuovo GJ, Cunha CB, Levi JE, Villa LL, et al. (2013) En komparativ analyse af kliniske og Molekylær Faktorer med fase af livmoderhalskræft i en brasiliansk Kohorte. PLoS ONE 8 (3): e57810. doi: 10,1371 /journal.pone.0057810

Redaktør: Valli De Re, Centro di riferimento Oncologico, IRCCS National Cancer Institute, Italien

Modtaget: September 7, 2012; Accepteret: 26 januar 2013; Udgivet: 7 mar 2013

Copyright: © 2013 Amaro-Filho et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: Grant Support : Mormoner og SAF var lærde i den internationale aIDS-forskning og uddannelse Program, støttet af Fogarty International center, National Institutes of Health (NIH) Research Grant 2 D 43 TW000010-23-AITRP. Dette arbejde blev støttet delvist af tilskud fra LIPMED-IOCFiocruz, RJ, Brasilien, og Lewis Foundation (fra Dr. Gerard J Nuovo Laboratory). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

på trods af de lovende resultater i de sidste årtier med screening af asymptomatiske kvinder ved celleprøve og senest med fremkomsten af ​​vacciner mod HPV, livmoderhalskræft er stadig en almindelig sygdom med omkring 530.000 nye tilfælde og 275.000 dødsfald per år [1]. Den klassiske behandling af invasive livmoderhalskræft (ICC) involverer evaluering tumorudbredelse som omfatter tumorstørrelse, dybde af invasion, mikrovaskulær plads tumorinvasion, spredt sig til regionale lymfeknuder, og grad af differentiering. Behandlingen af ​​livmoderhalskræft er baseret på en evaluering af det kliniske fase af tumor i henhold til klassificeringen af ​​International Federation of Gynækologi og obstetrik (FIGO). For tidlige stadier (FIGO I-IIA) enten kirurgi eller strålebehandling (RT) er ansat, mens der for sene stadier (FIGO IIB-IV) kemoterapi er angivet [2]. Men klinisk iscenesættelse har visse begrænsninger på grund af variabler som inter-observatør variation. Uoverensstemmelser er blevet rapporteret hos op til 25% af tilfældene i tidligt stadium sygdom og 65-90% i avanceret (≥IIB) sygdom [3], [4].

Imaging teknologier, såsom computertomografi og ultralydsscanning , er blevet vedtaget for at forbedre den kliniske iscenesættelse nøjagtigheden af ​​livmoderhalskræft. Imidlertid har nogle undersøgelser rapporteret lav følsomhed og høj falsk-negative resultater med disse metoder [2]. Således er der behov for nye prædiktive markører til at identificere patienter med høj risiko for tilbagefald, dårligere prognose, og at optimere sygdom ledelse, især i begyndelsen af ​​invasiv livmoderhalskræft (ICC).

Vedvarende infektion med visse humane papillomavirus typer (især type 16 og 18) er blevet godt dokumenteret som en nødvendig cofaktor for cervikal cancerudvikling. HPV-typerne højrisiko kan aktivere de komplekse veje, der i sidste ende fører til en invasiv cancer, delvis på grund af evnen hos E6 og E7 virale oncoproteiner at drive celler i S-fase [5]. E7 associerer med retinoblastoma protein (pRb), som er en tumor suppressor protein relateret til flere store kræftformer. pRb forhindrer cellen i at replikere beskadiget DNA ved at forhindre dens progression langs cellecyklussen gennem G1 (første mellemrum fase) til S (syntese fase) [6] – [9] og er involveret i at forhindre overdreven cellevækst ved at hæmme cellecyklusprogression indtil cellen er klar til at opdele når pRb binder og inhiberer E2F transkriptionsfaktorer [10], [11]. Efter E7 og pRb association, E2F proteiner er i stand til efterfølgende transaktiverer cellulære cyclinafhængige dependet kinaser (CDK’er) proteiner, der er nødvendige for viral DNA-replikation, som kan føre til cancer [6]. Futhermore, E7 er også i stand til at interagere med andre proteiner involveret i celleproliferation, såsom histondeacetylaser, komponenter af AP1 transkriptionskomplekset og cyclinafhængige kinaseinhibitorer herunder p21 og p27 [12]. E6 er i stand til at mægle p53 ubiquitinering og nedbrydning. Dette, igen reducerer effektiviteten af ​​det cellulære DNA beskadigelse respons og tillader akkumulering af sekundære mutationer, som på sin side øger risikoen for dannelse cancer [5].

Antigen KI-67 også kendt som Ki -67 eller MKI67 er et kerneprotein, der hos mennesker er kodet af MKI67 genet og er strengt forbundet med celleproliferation. Ki-67-protein er til stede under alle aktive faser af cellecyklus (G1, S, G2, og mitose), men er fraværende fra hvilende celler. Det har vist sig at være en pålidelig prædiktiv faktor for tumorudvikling. Således Ki-67 proliferation, som er udtryk procentdelen af ​​tumorceller, som er aktivt prolifererende, er et almindeligt anvendt markør i diagnostisk patologi til differentiering godartet fra maligne tumorer [13] – [15]. P16

INK4a er en cyclin-afhængig kinase inhibitor, der virker som en tumorsuppressor ved binding til cyclinafhængige kinaser som CDK4 og CDK6, forhindrer phosphorylering og efterfølgende inaktivering af retinoblastoma protein (pRB), hos mennesker kodes af CDKN2A genet og spiller en vigtig rolle i reguleringen af ​​cellecyklussen. Dette gen genererer flere udskrift varianter, der adskiller sig i deres første exoner. Senest én undersøgelse fundet flere hidtil ukendte gener, der skal udtrykkes forskelligt i livmoderhalskræft og er overudtrykt i livmoderhalskræft, bekræftet af immunhistokemi såsom MMP3, UBE2C og p16-protein [16]. Diffus p16

INK4a udtryk er blevet relateret til højrisiko-HPV (HR-HPV) infektioner, især i high grade cervikal intraepitelialneoplasi og kræft [17] – [19].

Proteinet P53, kendt som protein 53 eller tumor protein 53, er en tumor suppressor protein, hvor det regulerer cellecyklus og således fungerer som en tumorsuppressor, som er involveret i forebyggelse af kræft. P53 har en vigtig rolle i bevarelsen stabilitet ved at forhindre genom mutation. Hos mennesker er p53 kodet af TP53 gen lokaliseret på den korte arm af kromosom 17. I tryksvage celler, er p53-niveauer holdes lave gennem en kontinuerlig nedbrydning af p53 imidlertid Hvis TP53 genet er beskadiget, er tumorsuppression kraftigt reduceret [20] . Den TP53 genet kan også blive beskadiget i celler ved mutagener øger sandsynligheden for, at cellen begynder nogen kontrol division. Mere end 50 procent af humane tumorer indeholder en mutation eller sletning af TP53 genet. I livmoderhalskræft, E6 HPV onkoprotein binder til p53 og fremmer dens nedbrydning af ubiquitin proteolyse pathway [21] – [24]. Nogle patogener, som HPV kan også påvirke p53 proteiner ekspression. Modstridende resultater er blevet publiceret vedrørende p53 udtryk, nogle undersøgelser har vist en positiv korrelation af p53 med højkvalitets læsioner og livmoderhalskræft, mens andre erklærer ingen væsentlige foreninger [21], [25].

Den foreliggende undersøgelse var udført for at undersøge den hypotese, at proteinerne involveret i cellecyklus Ki-67, p53 og p16

INK4a overudtrykkes i livmoderhalsen af ​​patienter med cervikal cancer og mere specifikt at vurdere sammenhængen mellem disse biomarkører med FIGO stadium og HPV-genotype. Desuden blev socio-demografiske, adfærdsmæssige og kliniske karakteristika fra den undersøgte population også analyseret, derfor vores vigtigste mål var 1) at analysere ekspressionen af ​​Ki-67, p53 og p16

INK4a i livmoderhalskræft 2) for at søge efter en differential udtryk, der kan hjælpe i vurderingen af ​​klinisk tumor iscenesættelse ifølge FIGO klassificering, og 3) at bestemme HPV-DNA-genotypen distribution i denne population.

Materialer og metoder

Vævsprøver og data samling

undersøgelsen materiale bestod af 130 prøver tilfældigt udvalgt fra arkiverne i Fernandes Figueira Institute, Oswaldo Cruz Foundation, Rio de Janeiro, Brasilien. Prøver fra 87 patienter opnået ved cervikal biopsi eller conization mellem 2003 og 2008 blev histopatologisk bekræftet af en kirurgisk patolog som invasiv livmoderhalskræft. Fyrre-tre patienter, der gennemgår hysterektomi for benign leiomyomata sygdom anvendt som kontroller.

sociodemografiske og sundhedsdata blev opnået fra individuelle diagrammer patient. Følgende data blev indsamlet: alder, historie og pakke års tobaksrygning, historie alkoholforbrug, prævention (hormonelle), alder første samleje, antal graviditeter, uddannelsesniveau, HIV-1 serologi og FIGO stadie. Den Institutional Review Board (IRB) fra Oswaldo Cruz Foundation (Fiocruz), (CAE 0024.0.011.000-09-, Rio de Janeiro, Brasilien) godkendt brugen af ​​skriftlige samtykke i denne undersøgelse.

Tissue Micro-Array (TMA) blok konstruktion.

Tissue Micro-Array blokke blev konstrueret som beskrevet af Pires et al, 2006 [26]. Kort fortalt alle hæmatoxylin-eosin (HE) slides blev gennemgået igen af ​​en anden erfaren patolog og to morfologiske repræsentative områder af invasiv livmoderhalskræft blev valgt og omgivet med en markør pen. To kerner fra hvert tilfælde blev udstanset fra donorblokkene. Den tilsvarende H E slides blev overlejret med en specialbygget 16 gauge Becton-Dickinson PrecisionGlide® kanyle (1,1 mm

2-område). Bagefter blev kerner fastgjort med dobbelt-side tape på en computer-genereret papir gitter opnåelse tilpasning på blokken skimmel, som derefter blev fyldt med flydende paraffin. Tre um tykke snit blev opnået fra en optisk standard rotator mikrotom (Leica, Bensheim, Tyskland). Hver blok billede 40-50 objektglas; Kun prøver viser den oprindelige læsion blev anvendt. I alt to TMA blokke blev bygget, den ene med livmoderhalskræft biopsier og den anden med kontrol, hvor fraværet af cervikal intraepitelial neoplasi (CIN) blev bekræftet ved gennemgang af hematoxylin og eosin farves dias.

DNA-ekstraktion .

fra hver paraffin indlejret cervikal biopsi, 4 skiver af 5 um blev skåret. Kort fortalt, efter afvoksning med xylen ved 48 ° C i 2 timer, ethanol (100%, 70% og 50%) blev tilsat for at fjerne resterende xylen, efterfulgt af rehydrering og centrifugering ved 12.000 rpm pr 15 min i hvert trin. Pelleten blev resuspenderet i opløsning med 300 pi proteinase K (100 ug /ml) og 10% SDS i 48 timer ved 48 ° C. Fem mikroliter proteinase K (200 ug /ml) blev tilsat efter 24 timer. DNA blev isoleret ved en phenolekstraktion indeholdende 300 pi phenol /chloroform /isoamylalkohol (25/24/1), efterfulgt af centrifugering (12.000 rpm pr 10 min) for at opnå den vandige fase. Efter gentagelse af disse oprensningstrin to gange blev DNA’et præcipiteret ved 20 ° C i 24 timer med 100 pi natriumacetat (slutkoncentration 7,5 M) og to gange den vandige fase volumen på 100% ethanol. DNA pellet blev opsamlet ved centrifugering i 15 minutter ved 12.000 rpm ved 4 ° C, vasket med 70% ethanol og resuspenderet i 50 pi TE-buffer (10 mM Tris-base, 1 mM EDTA, pH 7,5). DNA mængde og kvalitet blev analyseret ved NanoDrop (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA).

PCR-amplifikation og HPV-genotypebestemmelse.

Amplifikation af HPV L1 konsensus region blev udført med generisk primere GP5 + og GP6 + (syntetiseret af Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasilien) til at generere et PCR-produkt på ca. 150 bp som tidligere beskrevet (syntetiseret ved Invitroge

n

, Sao Paulo, SP, Brasilien, fremadrettet primer sekvens : GP5 +

TTTGTTACTGTGGTAGATACTAC

; revers primer sekvens GP6 +

GAAAAATAAACTGTAAATCATATTC

) [27], [28]. Negative prøver med disse primere blev udsat for nested PCR ved hjælp af en første runde forstærkning med primere PGMY09 og PGMY11, tidligere beskrevet (syntetiseret af Invitrogen, Sao Paulo, SP, Brasilien frem primersekvens: PGMY11A

GCACAGGGACATAACAATGG

, PGMY11B

GCGCAGGGCCACAATAATGG

, PGMY11C

GCACAGGGACATAATAATGG

, PGMY11D

GCCCAGGGCCACAACAATGG

, PGMY11E

GCTCAGGGTTTAAACAATGG

, revers primer sekvens: PGMY09F

CGTCCCAAAGGAAACTGATC

, PGMY09G

CGACCTAAAGGAAACTGATC

, PGMY09H

CGTCCAAAAGGAAACTGATC

, PGMY09I

GCCAAGGGGAAACTGATC

, PGMY09J

CGTCCCAAAGGATACTGATC

, PGMY09K

CGTCCAAGGGGATACTGATC

, PGMY09L

CGACCTAAAGGGAATTGATC

, PGMY09M

CGACCTAGTGGAAATTGATC

, PGMY09N

CGACCAAGGGGATATTGATC

, PGMY09P

GCCCAACGGAAACTGATC

, PGMY09Q

CGACCCAAGGGAAACTGGTC

, PGMY09R

CGTCCTAAAGGAAACTGGTC

, HMB01

GCGACCCAATGCAAATTGGT

) [29]. Hver PCR-assay indbefattet som en positiv kontrol Hela cellulært DNA (HPV18 DNA) og en negativ skabelon kontrol. Integriteten af ​​prøven DNA blev verificeret ved amplifikation af 110 bp fragment af β-globin-gen med primere PC03 og PC04. Amplifikationerne blev udført i et GeneAmp PCR System 9700 thermocycler (Applied Biosystems), og alle PCR-produkter blev analyseret ved elektroforese i 1,5% agarosegel.

En endelig reaktionsvolumen på 75 pi blev renset ved GF -1 DNA Recovery Kit (Vivantis, Oceanside, CA, USA), med henblik på at genotype. Til sekventering af en opløsning indeholdende 3,2 pmol af hver primer (GP5 + eller GP6 +), 5-10 ng PCR-produkt, 2,5 pi Big Dye Terminator v 3.1 Cycle Sequencing Kit (delnummer 4.337.455; Applied Biosystems, Foster City, CA, USA) og MilliQ vand udfylde for slutvolumen på 10 pi blev fremstillet. Blandingerne blev analyseret på en ABI Prism 3730 Genetic Analyzer (Applied Biosystems) findes på DNA PDTIS /Fiocruz Platform [30]. Alignments blev opnået direkte fra online Blastn server eller fylogenetisk analyseret af software MEGA5 [31]. Tilfælde ikke amplificeret ved PCR eller ude af stand til at blive sekventeret hvor kontrolleres for HPV-DNA ved hjælp af Inno-LiPA HPV Genotypebestemmelse v2 (Innogenetics, Gent, Belgien). Tre tvetydige tilfælde blev også analyseret ved PapilloCheck Kit (Greiner Bio-One, Frickenhausen, Tyskland).

Immunhistokemi (IHC).

IHC reaktioner blev udført på TMA silan-coatede objektglas (Sigma , St. Louis, MO, USA), som tidligere beskrevet [32]. Kort fortalt blev objektglassene afvokset i xylen, rehydreret gennem en gradueret ethanolserie, vasket med destilleret vand og derefter behandlet i opløsning med methanol indeholdende 0,3% hydrogenperoxid i 10 min for at eliminere endogen peroxidaseaktivitet. Antigen-genvinding for alle immunohistokemi blev udført ved kogning vævene med Target Retrieval Solution (Dako, Carpinteria, CA, USA). Ikke-specifik antistofbinding blev inhiberet ved at inkubere sektionerne med serum-frit protein blok (1% BSA). Vævssnit blev sekventielt inkuberet natten over i et fugtigt kammer ved 4 ° C temperatur med de primære specifikke antistoffer (fortyndinger): monoklonalt antistof anti-Ki67 (klar til brug – Dako, Carpinteria, CA, USA), monoklonalt antistof anti-p53 (1 /10 – Santa Cruz, Biotechnology, Inc-CA-USA) og monoklonalt antistof anti-p16

INK4a (1/250 – Santa Cruz, Biotechnology, Inc-CA-USA). Et sekundært biotinyleret multilink antistof blev påført i 30 minutter efterfulgt af streptavidin-peroxidase i 30 min. Den enzymatiske reaktion blev udviklet i en opløsning af 3,3′-diaminobenzidin (DAKO, Glostrup, Danmark) eksponering i 5 minutter, bortset p53 hvor FastRed chromogen blev anvendt (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA). Slides blev modfarvet med hæmatoxylin i 1 min, vasket i destilleret vand, dehydreret i gradueret ethanol, ryddet med xylen og permanent monteret i Entellan (Merck, Darmstadt, Tyskland).

Vurdering af IHC dias og celletælling

To uafhængige observatører revideret og kvantificeret udtryk for alle immunhistokemiske pletter. Ki-67 og p53 pletten kun medtaget nuklear farvning. To repræsentative områder af hver kerne blev manuelt talt af observatører og for Ki-67, klassificeret som: negativ, mindre end 25% positive kræft cellekerner, 25-50% positive eller mere end 50% positive. For p53 var pointsystemet som følger: negativ, mindre eller lig med 5% positiv cancer cellekerner, 5-25% positive og større end 25%. Immunhistokemisk udtryk for p16

INK4a blev kvantificeret i henhold til tilstedeværelse (positiv eller negativ), cellulære placering (nuklear og cytoplasmatisk), farvning intensitet (svag, moderat og stærk) og spredning mønster (diffus eller fokal).

Statistisk analyse.

data blev analyseret ved hjælp af STATA /SE 10.1 software. Statistiske sammenligninger blev udført under anvendelse af parametrisk Student t-test for kontinuerte variable og chi-square-test og Fishers eksakte test for kategoriske variable. En Test for trend tværs bestilt grupper (nptrend) blev inkorporeret for at observere, om biomarkører fulgte en lineær trend udtryk for FIGO scenen. Den Univariated logistisk regression blev anvendt til at verificere sammenhængen mellem de demografiske, adfærdsmæssige og kliniske faktorer med ICC og kontrolgrupper. Følsomhed (sandsynligheden for en sand positiv), specificitet (sandsynligheden for en sand negativ) og Youden indeks (YI) (YI = sensitivitet + specificitet-1), som et mål for den samlede diagnostiske effektivitet, blev beregnet for konsensus diagnoser af FIGO III IV og II-IV. Alle p-værdier er tosidet; p-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Study befolkningskarakteristika analyse

Denne undersøgelse omfattede 130 kvinder (gennemsnitlig alder 51,1 ± 13,1 år gammel,. rækkevidde 24- 88). For at kunne sammenligne de kliniske variable og FIGO stadie blev socio-demografiske, adfærdsmæssige og kliniske karakteristika indsamlet fra individuelle diagrammer patient. Men nogle data var ikke tilgængelig for alle patienter som følgende (N -%): alder (6-4,6%), uddannelsesniveau (41-31,5%), tobaksrygning (41-31,5%), alkoholforbrug (43-33,1 %), antikonception (48-36,9), første samleje (53-40,8%), tal af graviditeter (33-25,4%), HIV-1-status (86-66,2%) og FIGO stadie (17-19,5%).

Sammenslutninger af histopatologi og FIGO scenen med socio-demografiske og kliniske karakteristika

I denne population, som univariated logistisk regressionsanalyse, det blev bemærket, at tobaksrygning, alkoholforbrug, præventionsmidler (p-piller ), alder første samleje, og HIV-1-status var relateret til livmoderhalskræft. Men der var en statistisk signifikant sammenhæng mellem livmoderhalskræft og kontrolgrupper i følgende kategorier: patienter ældre end 55 (OR = 16,6; CI95% = 3,5 til 79,2; p 0,001), kvinder uden formel uddannelse (OR = 8,0; CI95% = 1,5 til 43,4; p = 0,016) og kvinder med mere end fire graviditeter (OR = 7,2; CI95% = 2,4 til 21,5; p = 0,001) (tabel 1). Endvidere blandt patienter med livmoderhalskræft, var der en statistisk signifikant sammenhæng mellem øget antallet af graviditeter (3 eller flere) samt en mangel på formel uddannelse, når man sammenligner FIGO stadie I til FIGO stadie II-IV (p = 0,005).

HPV prævalens og distribution

To af de 43 kontrolprøver gav utilfredsstillende resultater for dna-ekstraktion og blev udelukket fra HPV-DNA prævalens analyser. Tre prøver negative ved PCR med GP5 + /6 + var positive for viral DNA ved en nested PCR under anvendelse PGMY09 /11-primere. Den samlede forekomst af HPV-DNA i kontrol- og livmoderhalskræft grupper var 29,3% (12/41) og 95,4% (83/87), hhv. HPV-genotype fordeling i kontrol og i de livmoderhalskræft grupper fremgår af tabel 2. Infektioner med mere end to typer af HPV i en enkelt prøve var sjældne; 2/92 HPV-positive prøver viste flere infektioner. I kontrolgruppen, HPV type 16 viste den højeste udbredelse (72,7%) efterfulgt af typer 35, 67 og 6 (9,1% for hver). Hos kvinder med livmoderhalskræft, HPV type 16 var også den mest fremherskende (67,5%), efterfulgt af typen 33 (12,0%) og type 35 (3,6%). HPV-type 58 og 6 blev fundet i to tilfælde (2,4%), mens HPV 18, 31, 52, 67, 70, 69 og 30 blev fundet i kun 1 tilfælde (1,2%). Kvinder inficeret med HPV 16 udviste en statistisk signifikant sammenhæng (p = 0,012) med yngre gennemsnit (50,9; SE 1.9) sammenlignet med kvinder med andre typer (59,9; SE 2.8).

Proteinekspression analyse

den relative grad af protein-ekspression som bestemt ved immunhistokemi blev korreleret med FIGO stadium og HPV-genotype i HPV positive tilfælde livmoderhalskræft.

Ki-67 udtryk evaluering

Ki-67 farvning var nukleare og til stede i 34 (82,9%) af kontrollerne og 82 (94,3%) af de tilfælde af livmoderhalskræft. Men der var en markant forskel i fordelingen mønster af Ki-67 i livmoderhalskræft versus normale cervikale epitel. Specifikt blev de Ki-67 positive celler begrænset til det basale epitel lag i den normale cervikale væv henviser, mod cervixcancer prøver, Ki-67-ekspression var diffus og forekommer i de fleste cancerceller fra den basale aspekt til overfladen af ondartet svulst. For at differentiere og kvantificere udtrykket mønster mellem livmoderhalskræft prøver og den kontrol, blev Ki-67-ekspression tildelt bogstaver (A, B, C, D og F). “A” er nævnt no Ki-67 signal, “B” betegnes positive celler til stede udelukkende i de basale /parabasale epitel, “C” repræsenterede positive celle beviser i de basale /parabasale og mellemliggende epitel, “D”, der omtales et signal fra basen til overfladen af ​​epithelet med mindre end 25% af positiv kerne, “E” henvist til et signal fra basen til overfladen af ​​epithelet med 25% til 50% af positiv kerne og “F” var forbundet til en signal fra basen til overfladen af ​​epithelet med mere end 50% af positiv kerne (Figur 1). Som det fremgår af tabel 3, var der en signifikant stigning tendens Ki-67-ekspression med en øget FIGO stadium (np

trend = 0,008) (tabel 3)

A, B og C:. Kontrol epitel; D, E og F: invasiv livmoderhalskræft epitel. (A) Negativ; (B) Strict positiv plet i det basale lag; (C) positiv plet i det basale og mellemlag; (D) mindre end 25% af positive celler over hele epitel; (E) 25-50% af positive celler over hele epitel; (F) mere end 50% af positive celler over hele epitel (DAB, brun plet;. Mag 40 ×).

P16

INK4a udtryk evaluering

Forskellige mønstre af p16

blev observeret INK4a signal baseret på cellulære placering (nuklear og cytoplasmatisk), farvning intensitet (svag, moderat og stærk) og spredning mønster (diffus eller fokal). Kun 5 (11,6%) af kontrollerne var p16

INK4a-positiv, derimod, 83 (95,4%) af de livmoderhalskræft væv blev positive (figur 2). En diffus mønster af p16-ekspression var statistisk (p 0,001) i forbindelse generelt med livmoderhalskræft (85,5%) tilfælde versus kontroller. Sager, der udgør en moderat p16

INK4a udtryk var mere almindelige i den avancerede FIGO stadie III-IV (56,5%), mens svage udtryk var forbundet med tidlig FIGO stadium I (66,7%) (p = 0,023) (tabel 4). blev ikke observeret nogen sammenhæng mellem den cellulære placering mønster af p16

INK4a farvning og enten tumor lønklasse eller FIGO stadie (p = 0,152 og p = 0,183, henholdsvis)

A:. kontrol epitel; B, C, D, E og F: invasiv livmoderhalskræft epitel. (A) Negativ; (B) Focal moderat nukleare og cytoplasmatisk udtryk; (C) Diffus svage kernekraft og cytoplasmatisk udtryk; (D) Diffus moderat cytoplasmatisk udtryk; (E) Diffus stærke kernekraft og cytoplasmatisk udtryk; (F) Negativ (DAB, brun plet;. Mag 40 ×).

P53 udtryk evaluering

Positiv p53-ekspression blev påvist i 43 af de 87 (49,4% ) livmoderhalskræft tilfælde og negativ i alle kontrol tilfælde. p53 blev udelukkende udtrykt i den nukleare rum i alle positive tilfælde. Immunfarvning af mindre end 5%, 5-25% og mere end 25% af positiv cancercellelinie kerner blev observeret i 26 (29,9%), 15 (17,2%) og 2 (2,3%), henholdsvis af livmoderhalskræft (figur 3) .

A, B, C og D: invasiv livmoderhalskræft epitel. (A) negativ; (B) mindre end 5% nukleare plet positivitet; (C) 5% til 25% nuklear farvning positivitet; (D) højere end 25% (FastRed, rød plet, Mag 40 ×, Fig A Mag.20 ×)

Ki-67, p16

INK4a og p53 Klinisk performance

.

Vi undersøgte også den kliniske ydeevne (følsomhed, specificitet og Youden indeks) af forskellige positive endepunkter for p16

INK4a, Ki-67 og p53 farvning, og markørerne tilsammen, i forhold til konsensus diagnoser af FIGO III IV (FIGO III +) og FIGO II-IV (FIGO II +). Ved at kombinere de positive intensitet slutpunkt for p16

INK4a farvning med Ki-67 og p53, farvning øget specificitet og nøjagtighed for FIGO III + og FIGO II + detektion (tabel 5). Den højeste sensitivitet og specificitet blev observeret i de fremskredne stadier (FIGO II +) ved Youden indeks; tilpasning af en cutoff på mere end 25% af celler, der udtrykker Ki-67 og p16

INK4a med moderat eller stærk intensitet 93,5%, 100% og 93,5%.

Forholdet mellem HPV genotyper til Immunohistokemiske Fund

Vi undersøgte, om HPV 16 eller visse kombinationer af HPV genotyper kan påvirke ekspressionen af ​​de analyserede i ICC prøver biomarkører. Høj ekspression af Ki-67 var forbundet med andre HPV-typer, sammenlignet med HPV 16 eller når adskilt i forskellige grupper (HPV 16 enkelt infektion, andre høj risiko, lav risiko og ubestemt, og flere infektioner) som vist i tabel 6. blev ikke observeret nogen sammenhæng mellem P16

INK4a udtryk og HPV gruppe genotyper. Der var ingen signifikant sammenhæng med p53 udtryk og HPV-genotype (tabel 6).

Diskussion

Vi observerede en stigende udtryk for Ki-67, p53 og p16

INK4a i invasiv cancer prøver sammenlignet med normale kontroller. Da Ki-67 er en klassisk proliferationsmarkør og er blevet anvendt til at differentiere godartet versus maligne tumorer på forskellige steder, blev den stærke korrelation af Ki-67 og cervikal malignitet forventet [33]. Ki-67 blev udtrykt i alle lag af pladeepitel med invasiv cancer. Det blev også fundet i normale væv, dog begrænset primært til parabasale lag region. Disse data er i overensstemmelse med flere undersøgelser, hvor Ki-67 har udstillet høje specificitet og sensitivitet som biomarkør for celleforandringer i livmoderhalsen intraepitelialneoplasi [33], [34].

p53 protein ikke udviste mærkning i normalt epitel. I de invasive cervical cancer prøver fandt vi, at 49,4% (43/87) var positive, men viser ekspression i langt færre kerner af carcinomacellerne sammenlignet med ekspressionsmønsteret for andre markører. Litteraturen beskriver modstridende data til p53-ekspression i livmoderhalskræft, med spænder fra meget lave procenter til 62,0% af kræftceller [21], [25]. Selvom grundlag af denne markante forskel af resultaterne er uklar, kan det vedrøre forskellige årsager, herunder forskellige vævsfiksering samt de antigen hentning metoder og vedtaget skærende punkter [35]. Det er også kendt, at i mange typer af human cancer, er den p53 overudtrykkes som følge af mutationer, der modificerer deres transkriptionsaktivitet, der kan på sin side påvirke andre regulatoriske proteiner fx MDM2 (også kaldet HDM2 for det humane protein) . i tilfælde af livmoderhalskræft, Det fremgår imidlertid, at være anderledes, eftersom E6-proteinet fra HPV høj risiko er forbundet med ubiquitinering af p53 og efterfølgende nedbrydning med proteasomet. Ikke desto mindre er dette ikke udelukker muligheden for, at nogle cervikale karcinomer udviser punktmutationer af p53 [36]. Vore data vedrørende p53-ekspression er konsistent med tidligere undersøgelser, såsom ved Bahnassy et al. (2007) og Skomedal et al. (1999), som fandt, henholdsvis 44,2% (19/43) og 55,4% (41/74) af invasive livmoderhalskræft prøver positive for p53 og i begge undersøgelser, intet tilfælde var positiv i kontrol- prøver [33], [37 ].

Hvad angår p16

INK4a har flere undersøgelser dokumenteret overekspression, med et diffust og stærk mønster, ikke kun i high-grade cervikal intraepithelial læsioner, men også med invasiv cancer i forhold til de normale prøver [13] [18], [33]. Vores undersøgelse bekræfter denne stigning i udtrykket i invasiv kræft sammenlignet med kontrol prøver. Vi fandt 95,4% (83/87) af det invasive cancer var positive for p16

NK4a sammenlignet med 11,6% (5/43) af kontrollerne. Kun få papirer har observeret p16

INK4a udtryk i normale væv [36], [38], [39]. Alligevel er det veletableret, at ikke-dysplastiske epitelceller kan udtrykke p16

INK4a, for eksempel under visse fysiologiske betingelser, såsom afkortning af telomerer i ældre væv. Her udtryk for p16

INK4a straks fremkalder cellecyklusstop og kan i sidste ende inducere apoptose med de endelige resultater bliver et samlingspunkt mønster med svag intensitet [40].

Med hensyn til kliniske fase af livmoderhalskræft, vores