PLoS ONE: Tab af GATA4 og GATA6 Expression Angiver kræft i æggestokkene histologisk subtype og går forud neoplastisk transformation af æggestokkene Surface Epithelia

Abstrakt

Baggrund

Familien af ​​zink finger-holdige GATA transskription faktorer spiller kritiske roller i celle afstamning specifikation i den tidlige fosterudvikling og dannelse orgel. GATA4 og GATA6 viste sig at være hyppigt tabt i kræft i æggestokkene, og tabet foreslås at redegøre for dedifferentiering af kræftcellerne.

Metode /vigtigste resultater

Vi undersøgt yderligere udtryk for GATA4 og GATA6 i æggestokkene overflade epitel-læsioner og histologiske undertyper af ovariecarcinomer ved immunfarvning. GATA4 og GATA6 fandtes at være fraværende i høje procentsatser (80 til 90%) af serøs, klar celle, og endometrioide ovariecancer undersøgt. I modsætning hertil blev begge fundet positiv i 11 ud af 12 tilfælde af mucinøse carcinomer, hvilket tyder ekspressionen af ​​GATA faktorer kan skelne mucinøs kræft fra andre histologiske undertyper. GATA4 blev ofte tabt i præneoplastiske læsioner såsom morfologisk normale integration cyster og epitelial hyperplasi støder op til maligne celler. Tabet af GATA6 korrelerer tæt med neoplastisk morfologisk transformation af æggestokkene overflade epitel. I kultur, blev GATA4 udtryk gradvis ved passage primær æggestokkene overflade epitelceller, som korrelerede med ændringer i histon modifikation af GATA4 locus. En reduceret GATA6 gen dosering som i GATA6 (+/-) mus førte til en øget præneoplastiske forandringer og integration cyster i æggestokkene, hvilket tyder tabet af GATA6 bidrager til æggestokkene udvikling af kræft.

Konklusioner /Betydning

Denne undersøgelse tyder på, at udtrykket status GATA4 og GATA6 kan diktere distinkte patologiske veje fører til serøse eller mucinøse ovariecarcinomer. Den let tab af GATA4 udtryk gennem ændringer i kromatin kropsbygning foreslår en potentiel ikke-fænotypisk initierende begivenhed, hvilket fører til efterfølgende tab af GATA6, morfologisk transformation, og ultimativ tumorigenese

Henvisning:. Cai KQ, Caslini C, Capo- chichi CD, Slater C, Smith ER, Wu H, et al. (2009) Tab af GATA4 og GATA6 Expression Angiver kræft i æggestokkene histologisk subtype og går forud neoplastisk transformation af æggestokkene Surface epitel. PLoS ONE 4 (7): e6454. doi: 10,1371 /journal.pone.0006454

Redaktør: Sudhansu Kumar Dey, Cincinnati Children Research Foundation, USA

Modtaget: April 24, 2009; Accepteret: 23 juni 2009; Udgivet: 31 Jul 2009

Copyright: © 2009 Cai et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Disse undersøgelser blev støttet af midler fra tilskud R01 CA095071, CA79716 og CA75389 til XX Xu, og midler fra kræft i æggestokkene SPORE P50 CA83638 (RF Ozols, PI), og Core Grant # CA006927. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

æggestokkene epitelial kræft er generelt menes at opstå fra det coelomic epitel dækker æggestokkene overflade [1], [2] eller fra inklusion cyster, der også menes at stamme fra æggestokkene overfladeepitelet [3], [4 ]. Men der er også stærke argumenter, at i det mindste nogle af æggestokkene epithelcancer stammede fra andre end af overfladen epitel celler [5], [6], [7]. Flere forskellige histologiske undertyper kan klassificeres på grundlag af celle morfologi: disse er serøs, mucinous, klar celle, og endometroid undertyper [8], [9]. En idé til at forklare de forskellige histologiske undertyper er, at æggestokkene overflade epitelceller undergår metaplasi at vedtage forskellige histologiske karakteristika under transformation [2], [8]. En anden idé er at kræft i æggestokkene kan opstå fra resterne af mullerian kanal strukturer [6], som er forløbere for æggelederne, livmoderhalsen, livmoderen, osv, og kan præsentere som alle de histologiske undertyper i tumorer. Faktisk nylige observationer fører til den hypotese, at en betydelig del af serøse ovariecarcinomer kan stamme fra æggeledere [5], [7], som har serøs ligesom epitelceller.

Selv om nogle karakteristika af præcursorceller kan fastholde, sondringen af ​​kræftceller fra prækursor celler fremgår, og flere kendetegnende for neoplastiske celler er blevet anerkendt [10]. Unikke genetiske mutationer er grundlaget for de neoplastiske fænotyper [11] – [13], og derudover cancerceller forekommer ofte i en uhensigtsmæssig differentieret stadium, og udtrykket “dedifferentiering” anvendes ofte [14] – [16]. Den beskrives som “udifferentieret” eller “dedifferentierede” af ovariecancer fænotype ofte refererer til de tilsyneladende ændringer af kræftceller i retning af en mindre epitel-lignende morfologi eller glider fra precursorceller. At tilvejebringe en molekylær fortolkning af “dedifferentiering” af kræftceller, kan man betragte begrebet cellelinie differentiering fremtrædende i udviklingsbiologi, hvori en oprindelig celle undergår ændringer i sin globale genekspressionsprofil mod en specifik moden celletype. Analogt kan dedifferentiering af cancerceller være forårsaget af tabet af en eller flere kritiske gener, som er nøglen til at inducere differentieringen af ​​en oprindelig celletype til dannelse af æggestokkene overflade epitelceller. Nylige undersøgelser tyder på tabet af transskription faktor GATA6 og GATA4 i kræft i æggestokkene kan forklare tabet af epitel egenskaber og kan være den underliggende mekanisme af “dedifferentiation” af kræft i æggestokkene celler [17], [18].

De GATA transkriptionsfaktorer binder en konsensus a /TGATAA /G sekvens i initiativtagere og er bevaret i insekter og hvirveldyr, fra flue til mennesker [19]. GATA4 og GATA6 udtrykkes i de fleste organer, og spille kritiske roller i udviklingen af ​​disse organer [20], [21]. GATA4 og GATA6 først til udtryk under dannelsen af ​​extraembryonic endoderm differentieret fra de pluripotente embryonale stamceller i den indre cellemasse i den tidlige fosterudvikling [22] – [25]. GATA faktorer ikke vævsspecifik men snarere funktion i beskrivelsen og differentieringen af ​​cellelinier i et organ, såsom differentiering af en epitelcelle afstamning fra stromaceller. GATA4 og GATA6 udtrykkes i humane ovarie overflade epitelceller [17], [18], og formentlig, GATA4 og GATA6 er vigtige for dannelse og opretholdelse af den differentierede tilstand af æggestokkene overflade epitelceller. GATA4 og GATA6 ofte tabt i æggestokkene cancerceller [17], [26], og det er spekuleret, at tabet af disse udviklingsmæssigt vigtige transkriptionsfaktorer kan være den underliggende mekanisme af dedifferentiering [17], [18].

Hvorvidt GATA6 er vigtig for dannelsen af ​​æggestokkene overflade epitel er ukendt, da lidt om afledningen af ​​de ovariale overflade epitelceller. Både GATA4 og GATA6 proteiner udtrykkes i æggestokkene overflade epitelceller, men fraværende i de fleste ovariecancerceller [17], [18], [26]. Vi fandt af Chip assay, at histon H3 og H4 acetylering af GATA4 locus faldt meget i cancerceller sammenligne med GATA4-positive ikke-tumorceller [18]. I modsætning hertil blev histon H3 og H4 acetylering af GATA6 locus i mange cancerceller ikke reduceret og kunne påvises spor af GATA6 mRNA ved RT-PCR, hvilket indikerer, at GATA6-genet ikke er transkriptionelt til tavshed men meddelelsen undertrykkes af anden mekanisme (r ) [18].

der er identificeret få transskription mål for GATA faktorer, og Disabled-2 (DAB2) er en kendt transskription mål for GATA6 [27]. DAb2 blev også fundet tabt i ovariecancer [28], korrelerer med fraværet af GATA6 og morfologisk transformation [18]. DAb2 mangel hos mus fører til tidlig embryonisk dødelighed [29] – [31], og heterozygote dAb2 mutante mus udvikler præneoplastiske læsioner fra æggestokkene overflade epitel [32]. DAB2 er en adapter protein involveret i endocytisk handel, og DAB2 spiller en rolle i etableringen af ​​epitelial polaritet og overflade positionering [33]. Tab af DAB2 menes at forårsage morfologisk transformation af æggestokkene overflade epitel [34], [35]. Således er en spekulation er, at tabet af GATA6 vil føre til tab af DAB2 og neoplastisk morfologisk transformation af æggestokkene overflade epitel.

I den aktuelle undersøgelse, vi analyseres yderligere detaljer om GATA4 og GATA6 udtryk i æggestokkene væv og kræft og undersøgt virkningerne af reduktionen af ​​GATA6 i mus på æggestokkene overflade epitelial transformation.

Resultater

Angivelse af GATA4 og GATA6 i ovariecancer histologiske undertyper

Tidligere, både blev observeret GATA4 og GATA6 at være stærkt udtrykt i primær ovarie overflade epitelceller men fraværende i dyrkede ovariecancerceller af både Western blot at undersøge protein eller Northern blot at måle mRNA [17], [18].

med yderligere udvikling af antistoffer og forfinelse af farvning procedure, vi udført immunhistokemisk analyse for ekspression af GATA4 og GATA6 i et panel af æggestokkene ikke-neoplastiske og kræft væv i væv microarray (tabel 1). Yderligere 26 ikke-ovariecancer væv fra profylaktiske oophorectomies blev også anvendt i denne undersøgelse. Disse ovariale væv blev opnået fra både høje og normale kvinder risikofaktorer, men der fandtes ingen mikroskopisk cancer [36]. De 111 informative ovariecarcinomer i væv microarray anvendt i denne undersøgelse består af 82 serøs, 12 mucinous, 12 clear cell, og 5 endometrioide undertyper (tabel 1). I den normale monolag æggestokkene overflade epitel blev alle ovarie overflade epitelceller farvet positive for nuklear GATA4 og GATA6 (figur 1A). Mens GATA4 og GATA6 farvning er fraværende eller stærkt reduceret i de fleste ovariecarcinomer (tabel 1). Blandt de informative tilfælde blev tab af GATA4 fundet i 81/82 (99%) af serøse carcinomer, 1/12 (8,3%) af mucinous carcinomer, 11/12 (92%) af klare cellecarcinomer, og 5/5 ( 100%) af endometroid karcinomer. Tab af GATA6 blev fundet i 55/82 (67%) af serøse carcinomer, 1/12 (8,3%) af mucinous carcinomer, 10/12 (83%) af klar cellecarcinom, og 5/5 (100%) af endometroid karcinomer. Eksempler på immunfarvninger er vist i figur 1, for en GATA4- og GATA6-negative serøst karcinom (figur 1B), en GATA4-negative, men GATA6-positive serøst karcinom (figur 1C), en GATA6-negative, men GATA4-positive serøst karcinom (figur 1 D), og en GATA4 og GATA6-positive mucinøs carcinom (figur 1E). Det er også bemærkelsesværdigt, at nogle GATA4 og /eller GATA6 farvning er til stede i stromale celler i både normale og frygtsom æggestokke, selvom de fleste af disse farvning ikke er så intens som de i epitelceller. I nogle tilfælde, som ses i tumoren vist i figur 1B, nogle små stromaceller, sandsynlige immun- og lymfocytiske celler, viser stærk nuklear farvning af GATA4.

immunfarvninger af GATA4 og GATA6 blev udført i 111 ovariecarcinomer herunder 4 histologiske undertyper. Resultaterne er opsummeret i tabel 1. A. Normal æggestokkene overflade epitelceller er positive for både GATA4 og GATA6 i kernen. 200 × forstørrelse. B. Et eksempel på både GATA4- og GATA6-negative serøse carcinoma. 40 × forstørrelse. C. Et eksempel på GATA4-negative og GATA6-positive serøse carcinoma. 40 × forstørrelse. D. Et eksempel på GATA4-positive og GATA6-negative serøse carcinoma. 40 × forstørrelse. E. Et eksempel på både GATA4- og GATA6-positive mucinøs carcinoma. 40 × forstørrelse. E, epitel; T, tumor; S, stroma.

Et slående træk ved GATA4 og GATA6 farvning er, at selv om GATA4 og GATA6 går tabt i kræft mest æggestokkene (overvejende serøs undertype), carcinomer i mucinøs undertype er for det meste GATA4 – og GATA6-positive (tabel 1). Således udtryk for GATA4 og GATA6 adskiller mucinøse carcinomer fra andre histologiske undertyper.

Tab af GATA4 forud tab af GATA6 i præ-neoplastisk æggestokkene overflade og cyste epitel

GATA4 udtryk er fraværende i flertal af serøs ovariecancer, og GATA6 er også fraværende i mange, men også positive i nogle tilfælde (tabel 1). Negativ GATA6 og positiv GATA4 findes kun i sjældne tilfælde af ovariecarcinomer. Synes således tab af GATA4 at være mere fremherskende end tab af GATA6 i ovariecancer.

Tidligere blev mikroskopiske carcinomer og præneoplastiske morfologiske ændringer observeret i profylaktiske oophorectomies, viser nytten af ​​disse væv i at studere indledningen for ovarie epithelcancer [37]. I den aktuelle analyse, blev 26 tilfælde af æggestokkene væv fra profylaktiske oophorectomies sig at indeholde nogen mikroskopiske tumorer, men udviste morfologisk ændrede læsioner afledt af æggestokkene overflade eller cyste epitel [36]. I nogle åbenlyse ovariecarcinomer, kan morfologisk normale monolag af epitelceller findes ved siden af ​​maligne celler. Netop på grund af den fysiske nærhed, kan disse morfologiske normale epitelceller deler nogle funktioner med de neoplastiske celler. Ved immunfarvning, fandt vi, at i størstedelen af ​​tilfælde GATA4 er fraværende, og GATA6 er positiv i det indre lag, morfologisk benigne læsioner, som vist ved et eksempel (figur 2A). I et andet eksempel, ovarie- epitelceller, der beklæder overfladen er positive for GATA6 og negative for GATA4, og de epiteliale cyster under overfladen mistede både GATA4 og GATA6 ekspression (figur 2B).

Hver lysbilleder af de 26 prøver indeholder variabelt antal læsioner med varierende grader af morfologiske ændringer. Vi har undersøgt omkring 80 af disse læsioner til at gøre flere generelle beskrivelser: GATA4 er negativ i omkring 80% af overfladen epitel, og GATA4 er fraværende i næsten alle åbenlyse læsioner og også omkring halvdelen af ​​morfologisk normale monolag. GATA6 er generelt til stede (70%) i de epiteliale læsioner, og tab af GATA6 korrelerer med neoplastiske morfologiske ændringer (multiple epithelial lagdeling) i ca. 90% af tilfældene. Således GATA4 tab ofte går forud GATA6 tab, og tab af GATA4 og GATA6 sker før malign transformation af æggestokkene overflade epitelceller.

immunfarvning af GATA4 og GATA6 i morfologisk normal ovarie overflade og /eller cyste epitel fundet i æggestokkene karcinomer. A. En æggestokkene overflade epitel er positivt for GATA6 og negativ for GATA4. Positiv GATA4 farvning i stroma noteres. B. En æggestokkene overflade epitel er positivt for GATA6 og negativ for GATA4. Både GATA4 og GATA6 går tabt i cyster epitelceller støder op til overfladen. 200 × forstørrelse. E, epitel; C, cyste; S, stroma.

Tab af GATA4 og /eller GATA6 tæt korreleret med epitelial morfologisk transformation

I årenes løb har vi samlet en samling af 12 ovariecarcinomer der indeholder læsioner af sammenhængende epitel forbinder morfologisk benigne epitelceller til åbenlyse cancerceller [35]. Sådanne læsioner er også blevet beskrevet tidligere for mucinøse og serøs ovariale cystadenocarcinomas [38]. Vi ræsonnerede, at tilstedeværelsen af ​​en overgang fra godartet til malign kan være nyttige til at bestemme involvering af kandidatgener i ovarieepitelceller tumorigenese. Ja, i alle 12 tilfælde af godartet til neoplastiske overgange analyseret, tab af GATA4 og /eller GATA6 tæt associerer med neoplastisk morfologisk transformation. I det første eksempel (figur 3A), GATA4 allerede fraværende i godartet monolag; GATA6 er positiv i monolagcellerne men er tabt i de tilstødende cancerceller. Tab af GATA6 nøje korrelerer med tab af dens transkription target dAb2 (figur 3A). I et andet eksempel er GATA4 og GATA6 ekspression tabt samtidig, tæt forbundet med tab af dAb2 og morfologisk transformation (figur 3B). Det udvidede godartet til neoplastisk overgang (figur 3B, lavere paneler) viser, at GATA4 brat er tabt, og GATA6 er stærkt reduceret på overgangen.

Eksempler på menneskelig ovariecancer farves for GATA4, GATA6, og DAB2 i tilstødende tumorsnit. A. Et ovarie overflade epitel, der består af en morfologisk normal overflade epitel (pilespids) sammenhængende forbinder maligne celler (pil), som enten invaderet i stroma eller ekspanderede i områder omkring ovariet. GATA4 er negativ i både morfologiske normale eller neoplastiske epitelceller. Epitelcellerne i den morfologiske normalt epitel er positive for GATA6 og dAb2, og de maligne celler er negative for GATA6 og dAb2. Nogle spredte celler i stroma er DAB2 positiv, men negativ for GATA6. Disse celler er makrofager, hvor dAb2 udtryk er ikke GATA6-afhængig. B. I dette ovariecarcinom, epitelcellerne i den morfologiske normalt epitel er positive for GATA4, GATA6, og dAb2, og de tilstødende maligne celler er negative for GATA4, GATA6, og dAb2. Billederne blev taget under et mikroskop med en 100 × forstørrelse. De farvninger for GATA4 og GATA6 i overgangen i panel B er vist i en højere forstørrelse (400 ×) på de nederste paneler. E, epitel; C, cyste; S, stroma; T, tumor.

Således tabet af GATA6 ekspression korrelerer tæt med neoplastisk transformation af æggestokkene overflade epitel, som observeret i tilgrænsende æggestokkene overfladeepitelet forbinder morfologisk normal til maligne celler (figur 3). I tidligere undersøgelser [18], [35], den æggestokkene overfladeepitelet umiddelbart op til tumor områder blev betragtet som præ-neoplastiske. Disse præneoplastiske læsioner mangler ofte en intakt basalmembran som angivet ved fraværet af collagen IV og laminin-farvning samt tabet af dAb2 ekspression [35]. I de morfologisk normale epitel umiddelbart støder op til tumor områder, både GATA6 og DAB2 er positive. Imidlertid er de sammenhængende forbundne neoplastiske celler er negative for både GATA6 og dAb2 farvning. De neoplastiske celler i den transformerede epitel, der er umiddelbart forbundet til morfologisk normale ovarie overflade epitelceller sandsynligvis mest ligner den normale, og således anses tidlige tumorceller. En sådan analyse tyder på muligheden for, at tabet af GATA6 er en af ​​de årsagsfaktorer i æggestokkene epitelial transformation.

Observationerne fra humane ovariecancer væv tyder på, at tabet af GATA4 udtryk ofte går forud for tabet af GATA6, og tabet af GATA6, korreleret med tabet af DAB2, associerede virksomheder med epitelial morfologisk transformation.

Reduktion af GATA faktor udtryk ved passage af æggestokkene overflade epitelceller i primære kulturer

i løbet af de sidste 5 år i studier af GATA faktorer i æggestokkene overflade epiteliale og kultur-celler, fandt vi, at GATA4 er fraværende i de fleste ovarian cancer cellelinjer og også SV-40-transficerede, “udødeliggjort” æggestokkene overflade epitelceller [17], [18]. Derudover GATA4 udtryk var variabel i primære kulturer af humane ovarie overflade epitelceller. Således har vi spekulere, at ekspressionen af ​​GATA4 ikke er stabilt i æggestokkene overflade epitelceller og kan gradvist at reducere over tid.

For at teste denne idé, vi omhyggeligt fulgt passager af primære æggestokkene overflade epitelceller i kultur overarbejde og overvåges ekspressionen af ​​GATA4, GATA6, og dAb2 gener. De æggestokkene overflade epitelceller blev høstet fra ovarier fra profylaktiske oophorectomies som beskrevet tidligere [17], [18]. Vævene blev undersøgt og blev bestemt til at være morfologisk normale og ugyldige af mikroskopiske tumorer. Cellen fordoblingstid var omkring to uge efterfølgende kan afkortes til en uge til 5 dage i senere passager. Vi har udført de dele af en slange celle forberedelse (ROE 1.005.816) til passage 10 over en periode på to måneder, og cellerne var stadig meget proliferativ i slutningen. Typisk kan cellerne vokser i kultur i omkring 20 passager over en 6 måneders periode før undergår replikativ senescens. Ved hver passage blev halvdelen af ​​cellerne høstet og anvendt til ekspressionsanalyse, og den anden halvdel blev holdt kontinuerligt i kultur.

Først ændringerne i morfologien af ​​ovarie- overflade epitelceller var indlysende. Oprindeligt cellerne viste sig at være runde og flade, med en “brosten” morfologi, og i stigende grad cellerne blev langstrakte og spindel-lignende, og blev observeret de mest dramatiske ændringer i passagen 4 (figur 4A). GATA4 mRNA niveauer blev fundet at reduceres hurtigt, og blev ikke kan påvises ved passagen 4 (figur 4B, C). Ekspressionen af ​​GATA6 og dets transkription target dAb2, gradvist reduceres over tid, og mRNA-niveauer af begge gener var 20-30% af de oprindelige celler (figur 4C). Som kontrol hus-føring gen TBP (TATA-box bindende protein, tiltrædelse nummer NM_003194) udtryk niveau havde ubetydelige ændringer i løbet af kulturen, og variationen afspejler sandsynligvis rækken af ​​fejl analysen.

humane ovarie overflade epitelceller blev isoleret fra morfologisk normale humane ovarier opnået fra oophorektomi kirurgi. Cellerne blev passeret 10 gange over en periode på 3 måneder, og cellerne blev høstet fra hver passage for mRNA analyse. A. Morfologi af cellerne i passage # 1, 2, 4, 6, 8, 10. B. Den totale RNA blev anvendt til kvantitativ real-time RT-PCR til analyse mRNA-niveauer. Resultaterne er præsenteret som en “heat-map”. C. Mængden af ​​mRNA i forhold til passage 1 blev kvantificeret og præsenteret som et søjlediagram.

Således er alle GATA4, GATA6 og DAB2 mRNA-niveauer reduceres ved passage af de primære æggestokkene overflade epitelceller i kultur. Tabet af GATA4 forud tabet af GATA6 (og dAb2), svarende til observationen i præneoplastiske æggestokkene epiteler støder op til ovariecarcinomer, hvor GATA4 går ofte tabt før GATA6. Tidligere blev tabet af GATA4 og GATA6 i kræft i æggestokkene og epitelceller påvist at være af den mekanisme af hypoacetylation af histoner H3 og H4 og tab af histon H3 /lysin K4 trimethylation på deres initiativtagere [18]. Genekspression er bestemt af mønstret af associeret histon modifikation, kendt som histon koder [39]. Tab af histonacetylering fører til en mere kompakt kromatin kropsbygning og tab af transkriptionel aktivitet [40], og histon H3 /lysin K4 methylering forbinder med aktive gener [41], [42]. Den let tab af GATA4 og GATA6 udtryk foreslår ustabilitet af epigenetiske stater /kromatin kropsbygning, i overensstemmelse med den tidlige tab af GATA faktorer i æggestokkene tumorigenese.

Ændring af kromatin modifikation på GATA4 locus forbundet med tab af udtryk på passage af æggestokkene overflade epitelceller i primære kulturer

for at fastslå årsagen til reduktionen af ​​GATA faktor udtryk i primære kulturer, vi først bestemme udtryk i et stort panel af æggestokkene overflade epitelceller og kræftceller. Totalt RNA blev isoleret fra 8 præparater af primære HOSE celler (fra 7 personer, her, C.47 og D.47 blev opdelt fra samme HOSE præparater, men blev dyrket ved forskellige lab personale), 6 HIO linjer, der HOSE celler transficeret med SV40-T-antigent at forlænge dyrkning levetid, og 6 linjer af ovariecancerceller (figur 5). RNA’et blev underkastet semi-kvantitativ RT-PCR (figur 5A) og real-time RT-PCR (figur 5B) for at bestemme mRNA-niveauer for GATA4, GATA6, dAb2, og GAPDH eller BHD som lastning kontrol. GATA4 ekspression reduceres i nogle HOSE præparater og Hio linjer, og er fraværende i alle cancer linjer som bestemt ved både semi-kvantitativ RT-PCR og real-time RT-PCR (figur 5A, B). Reduktion af GATA6 og dAb2 ekspression i HIO og cancer linjer er mere tilsyneladende ved real-time RT-PCR (figur 5B).

humanovarie overflade epitelceller blev isoleret fra morfologisk normale humane ovarier opnået fra oophorektomi kirurgi. Adskillige Hio linjer blev også etableret ved transfektion af primære celler med SV-40 T-antigen til at forlænge levetiden i kulturer. Totalt RNA isoleret fra en samling af primær slange, HIO og cancerceller blev anvendt til: A. Semi-kvantitativ RT-PCR, og B. Kvantitativ real-time RT-PCR, til analyse mRNA-niveauer for GATA4, GATA6, dAb2, og GAPDH (semi-kvantitativ RT-PCR) eller BHD (real-time RT-PCR) som lastning kontrol. Tilstrækkelig RNA blev opnået fra HOSE.96 (eller C.96), passage # 3; HOSE.47 celler, passage # 5; og HOSE.63 celler, passage # 12; til CHIP assay. C. Beliggenheden af ​​primere F3 og R3 på GATA4 genet for PCR i chippen assayet er vist. D. Lysater fra HOSE.96, HOSE.47, HOSE.63, ES2, SKOV3, A2780, OVCAR3, og OVCAR10 var forberedt på CHIP assay. Kromatin udfældninger af antistoffer mod Ac H3, Ac H4, Me

2H3K4, Me

3H3K4, Me

2H3K9, Me

2H3K27, og HPγ1 blev brugt til at forstærke ved PCR ved hjælp af primere F3 og R3. Indgangssignalet ( “i”, 2% af de samlede kromatin anvendes til immunpræcipitering), intet antistof kontrol ( “nej”), og ingen skabelon kontrol ( “H

2O”) blev medtaget. De lyse felt billeder af semikvantitative PCR-produkter vises. E. Placeringen af ​​primerne F2 og B2 ved GATA6 genet for PCR i CHIP assay er vist. F. Lysat fra HOSE.96, HOSE.47, A2780, OVCAR3, og OVCAR10 var forberedt på CHIP assay. De lyse felt billeder af semikvantitative PCR-produkter er vist.

Vi var i stand til at opnå en tilstrækkelig mængde af 3 primære HOSE celler (HOSE.96, HOSE.47, og HOSE.63) for yderligere undersøgelse af ændringer i kromatin modifikation af GATA4 og GATA6 locus af chip assay under passage af cellerne i kulturerne. Ekspressionsniveauerne af GATA4 omvendt forhold med passage antal celler: HOSE.96 (eller C.96) celler, passage # 3, har høj GATA4 ekspression; HOSE.47 celler, passage # 5, har en lavere GATA4 niveau; og HOSE.63 celler, passage # 12, har en meget reduceret ekspression niveau (figur 5B).

Efter den tidligere fastsatte protokol for chip-analysen for GATA4 og GATA6 gener [18], fandt vi, at, ja, ved et sted umiddelbart opstrøms for GATA4 Exon 1 (figur 5C), reduktion af GATA4 ekspressionsniveauer korrelerer med tab af acetylering af histon H3 og H4 (figur 5D). Ingen signifikante ændringer blev observeret for di og tri methylering af H3K4, markører for aktiv kromatin kropsbygning [41], [42]. Men dimethylering af histon H3 ved lysin 9 og 27 (Me

2H3K9, Me

2H3K27) og HP1 er fraværende, hvilket tyder på tavshed GATA4 genet er ikke at blive indarbejdet i heterochromatin [43].

ved siden af ​​den reducerede acetylering af histon H3 og H4 i A2780 celler, mønstre af histon modifikation på GATA6 locus (figur 5E) er ens mellem HOSE celler og cancer linjer OVCAR3 og OVCAR10 (figur 5F), hvilket tyder på ændring af histon modifikation på GATA6 locus er ikke en generel begivenhed i ovarieepitelceller og kræftceller.

æggestokkene tumor tilbøjelige fænotype af GATA6 heterogene mus

at finde en tæt sammenhæng mellem tab af GATA6 og epitelial transformation fik os til at spekulere i, at tabet af GATA6 kan være sygdomsfremkaldende i omdannelsen af ​​æggestokkene overflade epitelceller. De ovennævnte observationer antyder også, at tabet af GATA6 kan være mere kritisk end tabet af GATA4 at fremme ovarieepitelceller transformation. For at bestemme den konsekvens for tabet af GATA6 i æggestokkene overflade epitel, undersøgte vi æggestokkene fænotype af GATA6 (+/-) mus, da de homozygote mus er embryonale letale [24], [25]. Vi har opnået og opretholdt en koloni af GATA6 knockout-mus i løbet af de sidste 2 år. Æggestokkene væv blev høstet fra musene på omkring et år, og morfologi af ovarier fra kuldsøskende af GATA6 (+/-) og vildtype blev sammenlignet. Slående, alle ovarier hos GATA6 (+/-) genotype udviste nogle abnormaliteter (tabel 2): ​​Nogle æggestokke har omfattende proliferative læsioner i overfladen epitel (figur 6A), og de andre har store ovariecyster, der er positive for cytokeratin (figur 6B ). Den æggestokkene fænotype ligner dem af

DAB2

(+/-) mus [32], i overensstemmelse med DAB2 som GATA6 transskription mål og mediator [27].

æggestokkene morfologi GATA6 (+ /-) og vildtype kuld på omkring et år blev sammenlignet. Cytokeratin farvning blev anvendt som markør for epitelceller. A. Et typisk eksempel på en vildtype æggestok viser talrige follikler i forskellige udviklingsstadier lukkede inde i et lag af overflade epitel. Et repræsentativt GATA6 (+/-) ovarie viser tilstedeværelse af udvækst af epitelceller fra overfladen (pil). B. En stor del af GATA6 (+/-) æggestokke også udviser store cyster inde æggestokkene. Cellerne foring cyster er cytokeratin positive (lavere paneler). Alle billeder blev taget under et mikroskop med en 100 × forstørrelse.

Derfor er dette resultat tyder GATA6 mangel påvirkninger æggestokkene overflade epitel, eventuelt fremme transformation selvom vævsspecifik sletning af GATA6 i æggestokkene overflade epitel celler vil være en bedre test, når GATA6 betinget knockout-mus bliver tilgængelige.

diskussion

Denne undersøgelse undersøgte ekspressionen af ​​GATA 4 og GATA6 i æggestokkene overflade epitelceller og carcinomer i detaljer, og fundet at tabet af GATA4 er mere udbredt og ofte går forud GATA6 i omdannelsen af ​​æggestokkene overflade epitel. Tabet af GATA6 imidlertid korrelerer tæt med den morfologiske transformation af epithel. Den let reduktion af GATA4 og GATA6 udtryk ved dyrkning af de æggestokkene overflade epitelceller foreslår ustabilitet af epigenetiske stat /kromatin kropsbygning af GATA4 og GATA6 locus, i overensstemmelse med den tidlige tab i æggestokkene tumorigenese. Den tidlige tab af GATA4 og GATA6 og den tætte sammenhæng med neoplastisk transformation af æggestokkene overflade epitel foreslår en forårsagende rolle, som støttes af forekomsten af ​​ovarieepitelceller læsioner i GATA6 heterozygote defekte mus [32].

I kontrast til andre histologiske undertyper, mucinøse ovariecarcinomer generelt er positive for GATA4 og GATA6 udtryk. Faktisk morfologi mucinøse ovariecarcinomer er meget entydigt, at kræftcellerne synes at fastholde apikal polaritet og ofte eksistere som monolag epitel.

hurtigt tab af GATA4 i passage af primære celler i kultur er spændende. Tabet af GATA4 ekspression i passage af primære celler i kultur associerede med tab af H3 og H4 histonacetylering på GATA4 promotor locus. Tabet af GATA4 i cancer-cellelinjer synes også medieres af reduktion af H3 og H4 histonacetylering af promotoren locus.