PLoS ONE: Carcinoembryonalt Antigen-relaterede celleadhæsionsmolekyler (CEACAM) 1, 5 og 6 som Biomarkører i pancreas Cancer

Abstrakt

Baggrund

Formålet med denne undersøgelse var at vurdere den biologiske funktion i tumor progression og metastatisk proces carcinoembryonisk antigen-relaterede celleadhæsionsmolekyler (CEACAM) 1, 5 og 6 i pancreas adenocarcinom (PDAC).

Eksperimentel design

CEACAM banke ned celler blev etableret og vurderet in vitro og i en subkutan og intraperitoneal mus xenograft model. Tissue og serum udtryk for patienter med PDAC blev vurderet ved immunhistokemi (IHC) og ved enzymbundet immunosorbentassay.

Resultater

Tilstedeværelse af lymfeknude metastaser var korreleret med CEACAM 5 og 6 udtryk (bestemt ved IHC) og tumor tilbagefald udelukkende med CEACAM 6. Patienter med CEACAM 5 og 6 udtryk viste en signifikant forkortet OS i Kaplan-Meier overlevelse analyser. Forhøjet CEACAM6 serumværdier viste en korrelation med fjernmetastaser og. Survival analyse afslørede en forlænget OS til patienter med lav serum CEACAM 1 værdier. In vitro proliferation og migration kapaciteten blev forøget i CEACAM vælte PDAC celler, dog mus podet med CEACAM banke ned celler viste en forlænget samlet overlevelse (OS). Antallet af spontane pulmonal metastaser blev øget i CEACAM knock down gruppe.

Konklusion

Virkningerne medieret af CEACAM udtryk i PDAC er komplekse, selvom overekspression er korreleret med loco-regional aggressive tumorvækst . Imidlertid kan tab af CEACAM betragtes som en del af epitel-mesenkymale overgang og er derfor af snarere betydning i processen med fjernmetastaser

Henvisning:. Gebauer F, Wicklein D, Horst J., Sundermann P, Maar H, Streichert T, et al. (2014) Carcinoembryonalt Antigen-relaterede celleadhæsionsmolekyler (CEACAM) 1, 5 og 6 som Biomarkører i kræft i bugspytkirtlen. PLoS ONE 9 (11): e113023. doi: 10,1371 /journal.pone.0113023

Redaktør: Aamir Ahmad, Wayne State University School of Medicine, USA

Modtaget: Juli 22, 2014 Accepteret: 20 Oktober 2014; Udgivet: November 19, 2014

Copyright: © 2014 Gebauer et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Forfatterne erklærer, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

i de seneste år, prognosen for patienter, der lider af pancreas duktalt adenokarcinom (PDAC) er ikke væsentligt forbedret [1], [2]. De fleste patienter stede med avancerede tumor stadier umuliggør helbredende behandling. Komplet kirurgisk resektion, efterfulgt af adjuverende kemoterapi er i dag guld-standard i terapi af PDAC. Men selv hos patienter efter fuldstændig kirurgisk tumor resektion, den samlede overlevelse forbliver fattige med en median overlevelsestid på 20-24 måneder, [3] – [5]. Aggressiv loco-regional tumorvækst ud over tidlig fjernt og peritoneal metastase og en høj grad af kemoresistens gøre PDAC en af ​​de mest dødelige gastrointestinale tumorer [6].

dag, hverken pålidelige serum eller væv markører forudsige den kliniske løbet af patienter efter diagnose af PDAC er tilgængelige. Endvidere er de molekylære interaktioner af tumoren med værten og de lokale faktorer, der tillader PDAC at vise sådan en aggressiv progression dårligt forstået. Derfor er der en absolut nødvendighed behov for en bedre forståelse af tumor biologi med hensyn til mekanismerne i lokal tumor invasion og tilbagefald.

Carcioembryonic antigen-relateret celleadhæsionsmolekyler (CEACAMs) er medlemmer af glycosylphosphatidylinositol (GPI )-bundne immunglobulin (Ig) superfamilien [7]. Der er mere end 17 gener, der tilhører denne familie, med deres genprodukter primært integreret i cellemembranen. Inden for CEACAM familien de CEACAM undertyper er strukturelt ens og fysiologisk udtrykt på den apikale overflade af talrige celletyper, fx endotelceller og hæmatopoietiske celler samt epitelceller fra forskellige organer. Afhængigt af celletypen og CEACAM subtype, den transmitterede effekt efter binding en vis partner varierer, herunder regulering af celleadhæsion, tumor suppression, angiogenese, aktivering af leukocytter og andre immunoreaktive celler, og regulering af cellecyklussen [8] – [11]. Den CEACAM 5 gen, har dets produkt også kendt som CD66e koder for carcioembryonic antigen (CEA) og blive en af ​​de mest kendte medlemmer af Ig-superfamilien, da det har en væsentlig rolle i den kliniske rutine som en tumor markør for flere tumor enheder, herunder gastrointestinal og respiratoriske maligniteter [12]. Men på grund af manglende følsomhed og specificitet dens prædiktive værdi alene er stadig utilfredsstillende [13] – [16]. De CEACAM undertyper 1 og 6 er beskrevet at være under- eller overudtrykt i flere tumor enheder såsom lungecancer, coloncancer og melanom [17] – [23]. Selvom overekspression er almindeligt observeret, nogle undersøgelser endda rapportere en nedsat udtryk i visse tumor enheder på forskellige tumor stadier.

Interessant, nyere undersøgelser fundet CEACAM 1 og 6 udtryk i primær PDAC korreleret med en forkortet samlet patient overlevelse [24 ], [25]. De biologiske principper, hvorfor CEACAM udtryk medierer tumor progression er ikke fuldt forstået. Vi analyserede derfor virkningerne af CEACAM 1, 5 og 6 in vitro og etableret en xenograft musemodel at undersøge den funktionelle rolle af CEACAM udtryk i PDAC. For at vurdere, om CEACAM udtryk har en indvirkning på tumorprogression hos patienter, vi kombineret serum og immunhistokemisk analyse for CEACAM molekyler 1, 5 og 6 for at analysere, om der er en sammenhæng af CECACM udtryk med klinisk-pathologcial data for patienter med PDAC.

Materiale og metoder

Cell linje og CEACAM banke ned

Den menneskelige pancreas adenocarcinom cellelinie PaCa 5061 blev etableret fra en primær tumor. Detaljerede karakteristika etablering og kultur i cellelinje har tidligere [26] blevet beskrevet. Kort fortalt blev celler opnået fra en patient med en PDAC der gennemgik kirurgisk resektion ved Institut for General, Visceral og Thorax kirurgisk ved University Medical Center Hamburg-Eppendorf. Den endelige klassificering tumor i henhold til UICC 7

th ed. afslørede en pT3, N1, L1, V1, R0, G2 PDAC af bugspytkirtlen hovedet.

CEACAM banke ned varianter blev udført af shRNA interferens som beskrevet tidligere [27]. Oligonukleotider blev klonet ind i en pSIREN-RetroQ vektor og transficeret ved Fugene transfektionsmidler, (Roche Diagnostics, Hilden, Tyskland) med tumorcellerne. Valg af banke ned kloner blev udført ved ekspression af en Puromycin kemoresistens (Clontech, Saint-Germain-en-Laye, Frankrig) og flow-cytometer (FACS-LSR Fortessa, BD Bioscience, San Jose, USA). Kun celler med et knæk ned i 90%, som bestemt ved flowcytometri, blev anvendt til in vitro og in vivo forsøg. Ukonjugerede antistoffer mod CEACAM 1, 5 og 6 og den tilsvarende mus biotinyleret IgM eller rotte IgM-isotypekontrol (Dako, Glostrup, Danmark) blev detekteret med gede-anti-muse-Ig-APC (BD Biosciences). Celler blev analyseret ved hjælp af en CyFlow cytometer (Partek, Münster, Tyskland) med en efterfølgende tilsætning af AlexaFluor488 konjugeret streptavidin (Invitrogen) før farvning.

In vitro karakterisering af CEACAM banke ned celler

Cell spredning blev vurderet ved anvendelse kolorimetrisk XTT-assay (Roche Diagnostics, Basel, Schweiz) ifølge producentens instruktioner. Celler blev udpladet i plader med 96 brønde ved 3000 celler /brønd. Efter 48 timer for at tillade celleadhærence blev celler inkuberet med kolorimetriske substrater. Kolorimetriske ændringer blev målt i en multi-brønds spektrofotometer (MR5000 Multiplate Reader, Dynatech, Denkendorf, Tyskland).

Forskelle i cellemigrering blev vurderet ved anvendelse FluoroBlok Migration Assay (BD Bioscience, San Jose, USA) med 24- godt 8 mikron porestørrelse skær. Celler blev trypsinbehandlet og resuspenderet i serumfrit RPMI1640 (Invitrogen, Darmstadt, Tyskland) i en koncentration på 300.000 celler /ml. 400 pi cellesuspension blev sat til det apikale kammer og 800 pi RPMI1640 med 10% føtalt kalveserum (FCS, Invitrogen) blev tilsat til den nederste kammer. Assayet blev inkuberet i 24 timer under standard cellekultur betingelser.

Efter fjernelse af kemo tiltrækningsstof af bundkammeret blev visualisering af migrerede celler udført ved tilsætning af 500 pl /brønd HBSS buffer med Calcein AM (Invitrogen) 4 pg /ml i bunden brønd og inkubering i 1 time. Udlæsning blev udført ved 494/517 nm (Ex /Em) på en Genios bottom-læsning fluorescenspladelæser (Tecan, Männedorf, Swizerland).

Laminar flow blev udført ved hjælp IBIDI microslides VI (IBIDI, München, Tyskland) forbundet til en sprøjtepumpe (model 100-serien, kdScientific, Holliston, MA) og cellebevægelse blev observeret med et inverteret mikroskop (Zeiss, Jena, Tyskland; Axiovert 200). Tumorceller blev suspenderet i celledyrkningsmedium (20 ml, 200 000 celler /ml) og microslides blev coatet med human Pulmonal mikrovaskulære endotelceller (HPMEC) (Promocell, Heidelberg, Tyskland). HPMEC blev suspenderet i celledyrkningsmedium, podet i microslides ved en koncentration på 5 × 10

5 celler /ml og 20 pi medium med cellerne blev pipetteret i hver strømningskanal. Celle voksede sammenflydende natten over under standardbetingelser. Anvendt shear varierede fra 0,05 dyn /cm

2-10,0 dyn /cm

2. Cell bevægelse blev registreret og analyseret med hensyn til kvaliteten af ​​bevægelsen (vedhæftning, rullende og tethering) og rullende hastighed ved hjælp CapImage 8.5 program (Dr. Heinrich Zeintl, Heidelberg, Tyskland).

Dyreforsøg

dyreforsøg i henhold til UKCCR retningslinjer for dyrevelfærd i eksperimentel neoplasi [28], de lokale etiske komité for dyreforsøg (Behörde für Soziales, Familie, Gesundheit, Verbraucherschutz, Amt für Gesundheit und Verbraucherschutz;. Billstr 80 , D-20539 Hamburg, Tyskland, projekt nr G58 /09) og så godt det institutionelle dyrevelfærd officer af University Medical-center anbefalede og godkendt undersøgelsen.

for det subkutane tumor model, en million PaCa 5061 tumorceller blev injiceret i højre bovbladet region i 8-12 uger gamle C57BL /6 N PFP

– /- /rag2

– /- double-knockout-mus. Dyrene blev aflivet, når primære tumorer oversteg 2 cm

3 eller sår musen hud, musene var terminalt narcotized og ofret ved cardiocentesis.

Til vurdering af den indflydelse, CEACAM udtryk på peritoneal formidling, vi etableret en intraperiteoneal tumormodel som tidligere beskrevet [29]. Kort fortalt blev en million tumorceller injiceret i nederste venstre abdominale kvadrant intraperitonealt i suspension volumen på 200 pi. Vurdering og tidspunkter for opsigelse af forsøget er gennemført i henhold til en tidligere etableret pointsystem. Vurdering af omfang af den intraperitoneale tumorvækst blev gjort med et modificeret peritoneal carcinomatose indeks (PCI) som tidligere beskrevet [30]. Kort fortalt er det peritoneale hulrum opdelt i 9 abdomino-bækken regioner, afhængigt strækker af tumorvækst, er score mellem 0 og 3 point tildelt (0 point: ingen tumor tilstedeværende 1 point: tumor 1 mm

3 ; 2 point: tumor 1 og 3 mm

3, 3 punkter: tumor 3 mm

3), der fører til en PCI score fra 0 til 27.

Kvantificering af pulmonal metastase, dissemineret tumorceller (DTC) og CTC af Alu-PCR

Den venstre lunger blev homogeniseret i en prøve disruptor (TissueLyser II, Qiagen, Hilden, Tyskland) og udsat for DNA-isolering (QIAamp DNA Mini kit, Qiagen). Knoglemarv blev opsamlet ved skylning af venstre lår med 1 ml NaCl 0,9%. 200 pi blod og knoglemarv suspensioner blev underkastet DNA- isolation under anvendelse af QIAamp DNA Blood Mini Kit.

DNA koncentrationer af alle prøver blev kvantificeret ved anvendelse af en NanoDrop spektrofotometer (Peqlab, Erlangen, Tyskland). Da indholdet af påviselige Alu-sekvenser i følgende qPCR ville være blevet påvirket blot ved varierende DNA-koncentrationer, alle lunge- og knoglemarv-DNA-prøver blev normaliseret til 30 ng /pl bruge AE buffer (Qiagen). Koncentrationerne af blod-DNA var ret ens i alle prøver. (Ca. 10 ng /pi) og var derfor ikke normaliseret. qPCR blev udført med etablerede humane-specifikke Alu-primere [31]. 2 pi total DNA (dvs. 60 ng lunge /knoglemarv-DNA; 20 ng blod-DNA) blev anvendt til hver qPCR. Numeriske data blev bestemt mod en standardkurve som beskrevet [32]. Detektionsgrænsen for specifikke humane Alu-sekvens signaler blev bestemt for hver vævstype ved at teste DNA fra fem raske (ikke-injicerede) PFP

– /- /rag2

– /- mus af tilsvarende køn og alder. For hver prøve analyser blev udført i dubletter og som uafhængige forsøg mindst to gange.

Patienter og kirurgiske procedurer

Mellem 1992 og 2009, alle patienter, der fik foretaget større resectional bugspytskirurgi på Institut for General, Visceral og thorax kirurgisk ved University Medical Centre Hamburg-Eppendorf indgik i et prospektivt, pancreas database. Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for den afdeling af Læger i Hamborg, Tyskland. Skriftligt samtykke til at bruge prøverne til forskningsformål blev opnået fra alle patienter før operation eller blod tegning.

Patienter med PDAC af pancreas hoved regionen rutinemæssigt gennemgik enten delvis pancreatoduodenectomy (PD) eller pylorus-bevare duodenopancreatectomy (PPDP ) og orgel-bevarelse resektion metoder i tilfælde af kronisk pancreatitis (CP). Kun patienter med makroskopisk komplet tumor resektion blev medtaget i den endelige analyse. In-hospital mortalitet blev defineret som død på noget tidspunkt i hele den periode, hospitalsindlæggelse. Opfølgning oplysninger blev indhentet fra vores institutionens ambulatorium, fra de relevante praktiserende kontorer, eller fra det regionale kræft registreringsdatabasen. Når datoen for død ikke blev registreret, blev patienterne censureret på den sidst optagede kontakt.

Tissue mikro-array konstruktion og immounohistochemistry

Tissue kerner blev opnået fra formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) væv blokke fra patienter med patologisk dokumenteret PDAC. Repræsentative områder af tumoren blev udvalgt baseret på hæmatoxylin-eosin-farvning

TMA konstruktion blev udført som tidligere beskrevet [33] – [35].. Kort fortalt blev 252 væv cylindre med en diameter på 0,6 mm stanset fra “donor” væv blokke ved hjælp af en skræddersyet halvautomatisk robot præcision instrument og anbringes i en paraffin blok, der indeholdt 252 individuelle prøver. Inden for disse prøver, der var 142 PDACs, 40 neuroendokrine pancreastumorer (netto), 33 intraduktal papillære mucinøs neoplasme (IPMN), og 37 prøver af sundt væv som en negativ kontrol. De resulterende TMA blokke blev anvendt til at fremstille 4-um snit, der blev overført til en klæbemiddelbelagte glidesystem (Instrumedics Inc., Hackensack, New Jersey, USA).

immunohistokemisk farvning protokoller blev optimeret på forskellige godartet og maligne væv i en omfattende flertrins procedure at modificerede farvningen protokol, indtil den ønskede selektive farvning blev opnået med den lavest mulige baggrund signal (ifølge [36]).

Snit blev afparaffiniseret og tørret natten over ved 37 ° C . Antigen genfinding blev udført ved mikrobølgeovn behandling i citratbuffer (pH 6,0) i 1 min, blev snit derefter rehydreret i Tris-bufret saltvand (TBS; 0,05 M Tris-HCI ved pH 7,6 og 0,15 M NaCl) og blokeret med kanin-AB-serum (Biotest Diagnostics, Dreirach, Tyskland) fortyndet 1:10 i TBS i 60 minutter. CEACAM farvning blev udført under anvendelse af et specifikt CEACAM monoklonalt antistof (CEACAM1 klon 4D1 /C2 IgG2a, in-house-klon (tidligere beskrevet af [37]) ved en fortynding på 1:200, CEACAM5 klon # 2383 IgG1 ved en fortynding på 1:50 (Cell Signaling, Beverly, USA); CEACAM6 klon IgG1 (9A6), i en fortynding på 1:40 [Sigma-Aldrich, Hamborg, Tyskland]) natten over ved 4 ° C. Biotinyleret sekundært polyklonalt kanin-anti-muse-antistoffer (Dako, Hamburg, Tyskland) blev anvendt til binding af CEACAM primære antistof. Epitel-mesenchymale overgangsperioderne (EMT) markører var undersøgelser af immunhistokemi så godt. ZEB 1 (IgG ved en fortynding på 1:100, polyklonale kanin-anti-humant, Atlas Antibodies, Stockholm, Sverige), ZEB 2 (IgG ved en fortynding på 1:100, polyklonale kanin-anti-humant, Atlas Antibodies, Stockholm, Sverige ), E-Cadherin (), Pan-cytokeratin ().

påvistes bindingsstederne hjælp af ABC-AP-Kit (Vector Laboratories Inc., Burlingame, USA). Alkalisk phosphataseaktivitet af en biotin-streptavidin-alkalisk phosphatase-kompleks blev visualiseret ved anvendelse af naphthol-AS bisphosphat som substrat og hexatozised New Fuchsin blev anvendt til samtidig kobling. Snittene blev modfarvet med Mayers hemalum (Merck, Darmstadt, Tyskland).

farvningsintensitet (0, 1+, 2+, 3+) og fraktionen af ​​positive tumorceller blev scoret for hvert væv stedet som nylig offentliggjort [34]. Steder uden farvning og med en farvning intensitet på 1+ i 70% og 2+ i 30% af tumorcellerne blev bedømt som CEACAM lav, blev medium scorer gives for en farvning intensitet på 1+ i ≥70%, 2+ i ≥30% eller 3+ i 30% af tumorcellerne, og high scores blev givet til en farvningsintensitet på 2+ i ≥70% eller 3+ i ≥30% af tumorcellerne. Immunohistokemisk analyse af sektionerne blev udført uden kendskab til patientens identitet eller kliniske status. Immunohistokemisk analyse og scoring blev udført af to uafhængige forskere, der var uvidende om patientens udfald eller andre kliniske fund. I 95% af prøverne, evalueringerne af de to observatører var identiske, de resterende slides blev revurderet, og beslutninger konsensus blev foretaget.

farvning protokol blev så godt bruges til mus dyrket tumorer og viste lignende sensitivitet og specificitet sammenlignet med TMA farvning.

Enzyme linked immunosorbent assay (ELISA)

for kvantificering CEACAM undertyper i perifert blod, serum prøver fra 46 kaukasiske patienter med PDAC og 47 kaukasiske patienter med CP , som blev indikeret for kirurgisk behandling, blev analyseret med et enzymbundet immunassay (ELISA). Alle blodprøver blev opnået direkte før operation. Som raske kontrolpersoner, 50 kaukasiske blod-bank donorer, opnået fra institut for transfusion medicin (University Medical Center Hamburg-Eppendorf), blev inkluderet i undersøgelsen. Fremstilling af serumprøver blev udført ifølge en standardiseret protokol [38]. Median alder var 62,4 år ved diagnosetidspunktet (spændvidde 36.3-90.4 år, 24 mænd [52,2%], 21 kvinder [47,8%]). Serum værdier på 47 patienter, som gennemgik kirurgi på grund af kronisk betændelse i bugspytkirtlen (median alder på diagnosetidspunktet 47,0 år, spændvidde 31.1-76.1 år) og 50 prøver fra raske bloddonorer blev anvendt som kontroller (25 mænd [50%], 25 kvinder [ ,,,0],50%]).

til påvisning af CEACAM 1 og CEACAM 5 i serum, 96-brønds fleksible mikrotiterplader (Costar 9019, USA) blev overtrukket med 50 ul pr brønd af 2 ug /ml monoklonalt muse indfangende antistof (Klon 283.324 og 843.130, mus IgG1, R fraktion V, 98% renhed, Sigma-Aldrich, Tyskland) i PBS /T (phosphatbufret saltvand, pH 7,3, indeholdende 0,05% volumen /volumen Tween) i 45 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet i 1 time med humane sera fortyndet 1:50 i PBS ved stuetemperatur. Efter fem vaske med PBS /T, blev bundet protein påvist med biotin-konjugeret polyklonalt antistof anti-CEACAM 1 eller 5 (CEACAM 1 gede-IgG, klon 842.284; CEACAM 5 får IgG, klon 843131Goat IgG, R fraktion V, 98% renhed, Sigma Aldrich) i PBS /T (phosphatbufret saltvand, pH 7,3, indeholdende 0,05% volumen /volumen Tween) i 45 minutter ved stuetemperatur og derefter inkuberet i 1 time med detektionsantistoffet anti-CEACAM 6 (muse IgG1, klon 843.158, R 5% sammenlignet med CEACAM udtryk på kontrol celler (figur 1A). Proliferation og migration steget i de CEACAM vælte celler sammenlignet med kontrollen celler (Figur 1B og C), men CEACAM knockdown påvirkede ikke tilslutning på stimuleret endotel (HPMEC) (Figur 1D og E).

( EN). Basal CEACAM udtryk varierede afhængigt af CEACAM undertype blev højeste niveauer fundet for CEACAM 1, mellemprodukt til CEACAM 6 og laveste niveauer for CEACAM 5. Som det ses i proliferation (B) og migration analyser (C), viste CEACAM vælte celler en højere proliferative og migrative potentiale i forhold til at styre celler. Forskelle i adhæsion på stimulerede (TNFa) endotelceller var ikke påviselig mellem CEACAM kd og kontrolceller. Hverken det gennemsnitlige antal (D) eller den gennemsnitlige adhæsion tid til endotelcellerne var forskellige (E). Murine xenotransplantattumorer var meget positivt for CEACAM 1, 5 og 6. immunhistokemisk farvning i kontrol- celler viste fuldstændigt fravær af CEACAM udtryk i immunhistokemi i banke ned celler (F).

Til kontrol af tilstedeværelsen af CEACAM banke ned i de murine vokset tumorer blev IHC farvning af CEACAM 1, 5 og 6 udføres, og, som vist i figur 1F, knock down niveauer var stabile og stadig til stede i tumorer dyrket i mus.

xenograftmodel til funktionel analyse af CEACAMs i PDAC

for at besvare spørgsmålet om, hvorvidt CEACAM familiemedlemmer har en funktionel effekt på tumor dannelse, vækst og metastase, en tumor xenograft eksperimentere med humane PDAC celler (med og uden CEACAM knockdown ) i PfP

– /rag2

– mus blev udført. Efter subkutan tumorcelleinjektion, mus inokuleret med CEACAM knock down celler viste en signifikant forlænget samlede overlevelse indtil nå ophørskriterier (median overlevelse 144 d) ved sammenligning med PaCa 5061 kontrol (median overlevelse 104 d; P = 0,014) og vildtype PACA 5061 (median overlevelse 79 d; P = 0,01) (figur 2A). Tumoren størrelse og vægt på dødstidspunktet var ikke signifikant forskellig mellem grupperne (data ikke vist).

intraperitonealt blev ingen forskelle i peritoneal carcinomatose indeks (PCI) observeret på tidspunktet for scarification (80 dage efter indsprøjtning). CEACAM banke ned viste flere DNA-kopier af humant DNA i venstre lunge (p = 0,021) (C), som er korreleret med en højere metastatisk belastning i lungen, blev dog ingen forskel observeret for cirkulerende tumorceller i blodet (D) .

Mens den subkutane xenograft model viste en forlænget OS til mus med CEACAM knockdown, indflydelse af CEACAM banke ned i intraperitonealt xenograft model ikke var til stede. Den peritoneal carcinomatose indeks afveg ikke mellem grupperne, som også blev repræsenteret i manglende forskelle i udbredelsen, da der ikke var nogen forskelle mellem CEACAM banke ned og kontrolgruppen i cirkulerende tumorceller i perifert blod (figur 2B og D). Men i CEACAM vælte gruppe, vi fandt højere mængder af humant DNA (hvilket mærkbart mere PDAC celler) i lungerne i sammenligning med kontrolgruppen (figur 2C). PDAC celler viste ingen affinitet til udbredelse til knoglemarven blev human tumor-DNA ikke påvist i nogen af ​​grupperne. Markører til EMT viste ingen signifikante forskelle mellem vildtype og CEACAM banke ned tumorer som bestemt ved immunhistokemi (Fig S1).

immunhistokemisk CEACAM 1, 5 og 6 udtryk i patienter prøver

Ud af de 142 tumor spots blev 5 (3,5%) eksemplar ikke evaluerbare på TMA grund af manglende eller ikke-repræsentativ tumorvæv. Vævsprøver af 137 patienter var endelig evalueres og korreleret med klinik-patologiske data. Patienterne var mellem 33.1-85.0 år (median 63,5 år). Der var 82 mandlige patienter (59,9%) og 55 kvinder (40,1%).

CEACAM 1-ekspression blev fundet i 62,8% af alle tumor prøver (n = 86), CEACAM 5 i 87 patienter (63,5%) , CEACAM 6 ekspression blev observeret i 99 patienter (72,3%). Størstedelen af ​​tumorerne viste en homogen farvning inden hver prøve, men i et mindretal af tumor prøver, vi observerede et inhomogent IHC farvning mønster i tumoren området. Ekspressionsmønsteret for alle tre CEACAMs var membranøs og cytoplasmatisk samt (figur 3). Ekspression af CEACAM 5 var forbundet med tilstedeværelsen af ​​CEACAM 6 ekspression (P .001). En korrelation mellem CEACAM 1 og CEACAM 5 udtryk (P = 0,113) eller CEACAM 6 blev ikke observeret (P = 0,09).

En sammenhæng med klinisk-patologiske data viser ingen signifikant sammenhæng med nogen parameter for CEACAM 1 undtagen en korrelation med fjernmetastaser (P = 0,008). CEACAM 5 og 6 udtryk var korreleret med en positiv lymfeknude status (P = 0,017 og P = 0,046, henholdsvis) og fjernmetastaser (P 0,001). (Tabel 1)

Kaplan-Meier overlevelse analyse viste ingen sammenhæng mellem CEACAM 1-ekspression og den samlede (OS) eller sygdomsfri overlevelse (DFS), hhv. Patienter med en positiv CEACAM 5 og /eller 6-ekspression havde en afkortet OS og DFS (P = 0,025 og P = 0,007, P = 0,010 og P = 0,030, henholdsvis) (figur 4A-C, tabel 2). Hos patienter med positivt udtryk for alle tre CEACAM proteiner ingen signifikante forskelle i DFS eller OS sammenlignet med de patienter, der var negative for alle CEACAM undertyper (P = 0,144 og P = 0,742, data ikke vist) blev observeret.

(A-C). CEACAM 1-positive patienter viste en median OS på 17,0 måneder (14.0-20.1 måneder), CEACAM 1 negative 23,0 måneder (9.5-36.5 måneder, P = 0,279). OS af CEACAM 5 positive patienter var 16,0 måneder (12.8-19.2 måneder) vs. 22,0 måneder (4.1-47.9 måneder) (p = 0,025). CEACAM 6 positive patienter viste en OS på 14,0 måneder (7.9-20.0) vs. 22,0 måneder (5.6-38.4 måneder, P = 0,010). Overlevelse kurver for sammenhængen mellem den samlede overlevelse og CEACAM serum udtryk (D-F). CEACAM 1-positive patienter viste en OS på 11,8 måneder (2.4-25.2) vs. 18,3 måneder (10.0-26.2 måneder, P = 0,022). Median OS for patienter er positive for CEACAM 5 var 15,7 måneder (2.4-32.3 måneder) vs. 18,6 måneder (8.7-28.6 måneder, p = 0,651), og den mediane OS for patienter med CEACAM 6 positivitet var 18,8 måneder (9.5-28.1 måneder ) vs. 12,8 måneder (3.3-22.3 måneder, P = 0,187). Boxplots for CEACAM en serum udtryk (G), CEACAM 5 (H) og CEACAM 6 (I) sammenlignet pancreas ductal adenocarcinom (PDAC), kronisk pancreas (CP) og raske bloddonorer (BD). Modtager drift kurven (ROC) for CEACAM serum udtryk (J).

CEACAM 1, 5 og 6 i serum

CEACAM 1 værdier i PDAC ikke forhøjede sammenlignet med patienter med CP, men var højere i forhold til BD (PDAC median 33,0 mg /l, område 3,3 til 136,7 mg /l; CP median 23,1 mg /l, område 1,8 til 110,1; BD median 16,1 mg /l, rækkevidde 7,8-36,5 pg /l, P = 0,059 og P 0,001, henholdsvis). Lignende resultater blev fundet for CEACAM 5: serumværdier var højere i PDAC gruppen sammenlignet med BD, men ikke for CP (PDAC median 8,5 ug /l, område 0,7-75,2 ng /ml; CP median 4,8 ug /l, område 0,7- 24,0; BD median 1,9 ug /l, område 0,2-9,2 ug /l, P = 0,122 og P = 0,002, henholdsvis). Patienter med PDAC viste forhøjet CEACAM 6 serum udtryk i forhold til både, CP og BD (PDAC median 2,90 mg /l, rækkevidde 1,34-5,46 mg /l; CP median 2,25 mg /l, rækkevidde 0,77-5,15; BD median 2,34 mg /l , interval 1,25-6,99 ug /l, P = 0,06 og P = 0,029, henholdsvis). I ingen af ​​de udførte analyser, en betydelig forskel mellem CP og BD kunne påvises (Figur 2G-I).

Receiver opererer karakteristiske kurver blev anvendt til at etablere følsomheden-specificitet forhold til CEACAM 1, 5 og 6. de optimale afskæringsværdier blev bestemt ved Youdens-Index beregning. Området-under-the-kurven (AUC) for CEACAM 1 var 0,711 (cut-off værdi 184,1 mg /l), for CEACAM 5 0,689 (cut-off værdi 1,95 mg /l) og for CEACAM 6 0,664 (cut-off værdi 3,58 mg /l) (Figur 2J) følsomhed CEACAM 1 i detektering PDAC var 53,5% med en tilsvarende specificitet på 54,7%. For CEACAM 5, er sensitiviteten 79,1% med en specificitet på 44,2%. Følsomhed af CEACAM 6 var 47,0% med en specificitet på 82,6%. AUC for en kombination af alle tre CEACAMs viste ingen forbedring i forhold til bestemmelsen af ​​hver af alene CEACAMs (AUC 0.680, data ikke vist).

For en korrelation mellem CEACAM serumværdier med klinisk-patologiske data, serum værdier blev delt i et lavt niveau ( 75

percentil) og en gruppe på højt plan (≥75

percentil). Høj CEACAM 6 værdier med tilstedeværelsen af ​​fjernmetastaser (P = 0,009) og klassificering (P = 0,019) (tabel 1).