Abstrakt
Baggrund
platinbaseret kemoterapi er en standard strategi for ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), mens kemoresistens er fortsat en stor terapeutisk udfordring i nuværende klinisk praksis. Vores nuværende undersøgelse havde til formål at bestemme, om hæmning af NF-KB /miR-21 /PTEN vej kan øge følsomheden af NSCLC til cisplatin.
Metoder
udtryk for miR-21 i NSCLC væv blev bestemt under anvendelse in situ hybridisering. Dernæst blev virkningen af MIR-21 af følsomheden af A549-celler for cisplatin in vitro. Hvorvidt MIR-21 reguleret PTEN ekspression blev vurderet ved luciferase assay. Endvidere om NF-KB målrettet sine bindende elementer i MIR-21-genpromotoren blev bestemt ved luciferase og chip assay. Endelig har vi målte cellelevedygtighed og apoptose under cisplatin behandling, når NF-KB blev hæmmet.
Resultater
En forhøjet niveau af miR-21 blev observeret i NSCLC lungevæv og var relateret til en kort overlevelsestid. Exogent MIR-21 fremmes celleoverlevelse når de udsættes for cisplatin, mens MIR-21-inhibering kunne vende denne proces. RNA og protein niveauer af PTEN blev signifikant nedsat ved eksogent MIR-21, og 3′-utranslaterede region af PTEN blev vist at være et mål for MIR-21. Ekspressionen af MIR-21 blev reguleret af NF-KB-binding til dets element i promotoren, en konstatering, der blev verificeret ved luciferase og chip assay. Derfor hæmning af NF-KB ved RNA lyddæmpning beskytter celler mod cisplatin via faldende miR-21-ekspression.
Konklusion
Modulation af NF-KB /miR-21 /PTEN vej hos NSCLC viste at hæmning af denne vej kan øge cisplatin følsomhed
Henvisning:. Yang Z, Fang S, Di Y, Ying W, Tan Y, Gu W (2015) Modulation af NF-KB /miR-21 /PTEN pathway sensibiliserer Ikke-småcellet lungekræft til Cisplatin. PLoS ONE 10 (3): e0121547. doi: 10,1371 /journal.pone.0121547
Academic Redaktør: Bernard Mari, IPMC, CNRS UMR 7275 UNS, FRANCE
Modtaget: 14 oktober, 2014 Accepteret: 2 februar 2015; Udgivet: 23 marts 2015
Copyright: © 2015 Yang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres
Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret
Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Program for Jiangsu Health Department (H201341). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet
Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser
Introduktion
Ikke-småcellet lungecancer (NSCLC), omfattende pladecellekarcinom, adenocarcinom og storcellet udifferentierede karcinom, er den mest almindelige form for lungekræft [1,2]. Genetik spiller en væsentlig rolle i den patofysiologiske mekanisme NSCLC [3,4], og det fører til ikke-følsomhed NSCLC til platinbaseret kemoterapi [5], hvilket resulterer i NSCLC er den mest almindelige årsag til kræft-relaterede dødsfald på verdensplan [ ,,,0],1]. Det er således nødvendigt at udvikle nye lægemiddelkandidater baseret på molekylær genetik.
MikroRNA’er (miRNA) er blevet impliceret som centrale modulatorer af flere målgener gennem den endogene RNA-interferens maskiner [6]. De bidrager til cancer biologi ved at ændre ekspression af deres målgener [7]. MIR-21 er en type af miRNA, der fungerer som en potent modulator af tumorcelle adfærd og malign transformation [8]. Det har vist sig at forøge cellevækst i leverkræft og har vist anti-apoptotiske egenskaber i glioblastoma [9]. I NSCLC, miR-21 spiller også en afgørende rolle i cellulær proliferation, invasion og apoptose [10]. Tidligere undersøgelser har vist, at MIR-21 regulerer ekspressionen af phosphatase og tensin homolog (
PTEN
) via direkte målretning dens 3′-utranslaterede område (3’UTR) [8].
PTEN
, et tumorsuppressorgen, spiller en afgørende rolle i reguleringen af cellecyklus, apoptose og dannelse af mange typer af solide tumorer, herunder NSCLC [10]. Det regulerer negativt de intracellulære niveauer af phosphatidylinositol-3,4,5-triphosphat (PI3K) i celler og fungerer som en tumorsuppressor ved negativt at regulere Akt signalvejen [11]. Under normale forhold, udtryk og aktivering af
PTEN
er tæt kontrolleret, mens udtryk for miRNA er dysreguleret i NSCLC. Ændring af
miR-21 /PTEN
blev fundet i NSCLC patienter med gefitinib modstand [12].
I betragtning af den afgørende rolle, miR-21 /PTEN vej hos NSCLC, er der stadig et spørgsmål om, hvorfor udtryk for
miR-21
øges i NSCLC. Vi udførte en bioinformatik søgning (https://alggen.lsi.upc.es/cgi-bin/promo_v3/promo/promo.cgi) og fundet fire bindende elementer af NF-KB i promotoren af
MIR-21
gen. Ydermere er en forskergruppe viste, at DNA-skader induceret
miR-21
opregulering og fremmet brystkræft celle invasion i en NF-KB-afhængig måde [13]. Vi antog derfor, at NF-KB øget niveauet for
miR-21
, som reducerede
PTEN
udtryk post-transkriptionelt at fremme celle overlevelse under cisplatin behandling i NSCLC; derfor kan hæmning af NF-KB /miR-21 /PTEN pathway være et potentielt lægemiddel mål for NSCLC.
Metoder
Tissue microarray
Tissue microarray (TMA) fremstilles ud fra væv stammer fra 34 patienter med NSCLC og 10 patienter uden NSCLC fra januar 1999 og august 2007. undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen (1989) og blev godkendt af den lokale etiske komité (Nanjing First Hospital, Nanjing Medical University, Nanjing, Kina). Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient. Den repræsentative område blev omhyggeligt udvalgt fra en hematoxylin og eosin (HE) -stained sektion, og derefter en 1,5 mm væv kerne blev opnået ud fra de tilsvarende paraffinblokke. Derefter blev paraffin-indlejret materiale skåret i 5 um snit og anbragt på et objektglas, efterfulgt af farvning med HE eller in situ hybridisering (ISH). Snit blev betragtet under et lysmikroskop (Olympus, Japan). NSCLC blev diagnosticeret af to uafhængige patologer ifølge Union for International Cancer Control (UICC) klassifikationssystem for, 7. udgave. Den farvningsintensitet blev scoret som følger: 0, ingen farvning af celler; 1, svag farvning; og 2, stærk farvning. Procentdelen af farvede celler blev klassificeret under anvendelse af en 3-grade skala: 0, ingen positive celler; 1, 50% positive celler; og 2, . 50% positive celler
ISH
ISH af
MIR-21
blev udført ifølge producentens protokol (MK10013, Boster, Kina). Kort beskrevet efter afparaffinering af objektglassene i xylen og ethanol blev objektglassene inkuberet med 3% H
2O
2 i 10 minutter ved stuetemperatur og derefter spaltet med pepsin i 10 minutter ved 37 ° C. Efter skylning i vand blev objektglassene fikseret med 1% PFA i DEPC (Generay, Kina) i 10 minutter. Snit blev derefter vasket i vand tre gange og inkuberet med præhybridiseringsbuffer i 4 timer ved 42 ° C og hybridiseringspuffer natten over ved 42 ° C med et MIR-21-probe (5′-TAGCTTATCAGACTGATGTTGA-3 ‘). Objektglas blev vasket som følger: 2 x SSC i 5 minutter ved 37 ° C, to gange; 0,5 x SSC i 15 minutter ved 37 ° C, én gang; og 0,2 x SSC i 15 minutter ved 37 ° C, en gang. Vævet blev inkuberet i blokeringsbuffer ved 37 ° C i 30 minutter og blev derefter inkuberet med streptavidin-biotin-kompleks (SABC). Efter vask tre gange med PBS blev objektglassene inkuberet med peberrodsperoxidase polymerkonjugat i yderligere 30 minutter ved stuetemperatur. Efterfølgende blev de farvet med 3,3-diaminobenzidin og modfarvet med hematoxylin (Sigma-Aldrich, USA).
Cellekultur
HEK293 celler og A549-celler blev dyrket og opretholdt i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM, Invitrogen, USA) suppleret med 10% føtalt bovint serum (FBS, Gibco, USA), penicillin 100 U /ml og streptomycin 100 ug /ml (Gibco).
Konstruktion af plasmid og rekombinant lentivirus
menneskelige
NF-KB
(p65) genfragment amplificeres ved PCR, blev klonet ind i pcDNA3 og indsættelse blev bekræftet ved sekventering. Derefter blev plasmidet pcDNA-NF-KB fordøjet af EcoRI /Xbal. De fordøjede produkter blev elektroforesebehandlet i en agarosegel.
NF-KB
genfragmentet blev renset ved gel ekstraktion og efterfølgende klonet ind pLVX-IRWS-ZsGreen1. En shRNA konstruktion målretning NF-KB blev også klonet ind pLVX-IRWS-ZsGreen1. Rekombinante lentivira Lenti-shNF-KB og Lenti-NF-KB blev produceret og titreres i henhold til en tidligere rapport [14]. Hele den åbne læseramme af
PTEN
med eller uden
MIR-21
målsekvens i 3’UTR blev klonet i pcCS2 vektoren med et Myc-mærke til konstruktion pcCS2-PTEN-3 ‘UTR og pcCS2-PTEN henholdsvis.
Transfektion af
MIR-21
efterligner og inhibitor
FAM-modificerede 2′-O-Me-oligonukleotider kemisk syntetiseret og oprenset ved højtydende væskekromatografi (GenePharma, Kina). 2′-O-Me-MIR-21 efterligner var sammensat af RNA-duplexer med følgende sekvens: 5′-UAGCUUAUCAGACUGAUGUUGA-3 ‘; sekvenserne af 2′-O-Me-MIR-21 inhibitor og 2′-O-Me-scrambled oligonukleotider var som følger: 5’-UCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3 ‘; og 5’-CAGUACUUUUGUGUAGUACAA-3 ‘. Cellerne blev podet på en plade med 24 brønde med en tæthed på 5 x 10
4 celler per brønd og dyrket til 80% konfluens. MIR-21 inhibitor eller MIR-21 efterligner i en koncentration på 50 nM hver blev transficeret i celler under anvendelse af Lipofectamine 2000 (Invitrogen, USA) ved inkubering i Opti-Mem I MEDIA (Invitrogen) i 4 timer. Cellerne blev derefter overført til frisk dyrkningsmedium. Efter inkubation i 24 timer blev dyrkningsmediet udskiftet og fluorescerende billeder blev erhvervet for at overvåge transfektionseffektivitet. Efter 48 timer blev cellerne høstet til analyse.
Real-time PCR
Totalt RNA blev isoleret fra celler ved anvendelse af Trizol-reagens (Invitrogen) ved at følge fabrikantens anbefalinger. For
MIR-21
QRT-PCR, totalt RNA revers transkriberet under anvendelse af en miRNA-specifik primer og miScript Reverse Transcription Kit (Qiagen, Tyskland). Hårnåle-QRT-PCR blev udført under anvendelse af SYBR green PCR Master Mix (Qiagen) ifølge producentens protokol. Relative ekspression blev bedømt ved den sammenlignende Ct fremgangsmåden og normaliseret til ekspressionen af U6 lille nukleare RNA. Til påvisning af
PTEN
, revers transkription blev udført under anvendelse af første-streng cDNA-syntese kit (Promega, USA) ifølge producentens anbefalinger. QRT-PCR blev udført under anvendelse af QuantiFast SYBR Green PCR-kittet (Qiagen).
GAPDH
mRNA niveau blev ansat som intern kontrol. Alle prøverne blev analyseret i tre eksemplarer på tre uafhængige forsøg. Reaktioner uden cDNA blev anvendt som kontrol uden template, og ingen-RT kontroller blev også sat op til at udelukke genomisk DNA-kontaminering. Den relative kvantificering af mRNA-ekspression blev bestemt ved anvendelse af sammenlignende Ct-metoden.
Western blotting
Celler blev homogeniseret i RIPA-puffer (Cell-Signaling Tech., US). Protein- koncentrationer blev bestemt ved anvendelse af et BCA-kit (Beyotime, Kina). Lige store mængder protein blev separeret på SDS-PAGE og derefter overført til 0,45 um PVDF-membraner (Bio-Rad, USA). Membranerne blev blokeret i 5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvand med Tween 20 buffer (TBST) i 2 timer og derefter inkuberet natten over ved 4 ° C med de følgende primære antistoffer: anti-PTEN (1: 1000, . celle-signalering Tech), anti-total Akt (1: 1000, Abcam), anti-fosfor Ser473 Akt (1: 1000, Abcam) og anti-GAPDH (1: 1000, Cell-signalering Tech), der fungerede som. belastningskontrol. Derefter blev membranerne vasket tre gange med TBST og inkuberet med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (gede anti-kanin IgG (1: 5000) eller gede-anti-muse-IgG (1:. 5000); Cell-signalering Tech) i 2 timer ved stuetemperatur. Blots blev udviklet ved anvendelse af en chemiluminescens-kit (Millipore, USA) og eksponeret for røntgenfilm. Båndene på filmen blev scannet og analyseret ved hjælp
Billede J.
Luciferase vektor konstruktion
Den menneskelige
PTEN
3’UTR indeholder frø sekvens af
miR -21
bindingssteder blev amplificeret ved PCR og blev klonet ind i pMIR-RAPPORT vektor (Ambion, USA) mellem HindIII- og Spel-stederne at udvikle pMIR-PTEN-3′-UTR luciferase vektor. Seed sekvenser blev muteret ved overlap PCR. Det muterede PTEN-3′-UTR-fragmentet blev klonet i pMIR-RAPPORT vektor at udvikle pMIR-PTEN-mut-3′-UTR-vektor. En serie af reporter-konstruktioner med den samme 3′-ende men forskellige 5′-terminalen af MIR-21-promotoren blev amplificeret ved PCR. Alle PCR-produkterne blev klonet i plasmidet pGL4-Minimal (Promega) for at generere pGL4-MIR-21. Mutanten sted blev indført i plasmidet ved overlap PCR. Den efterfølgende PCR-produkt blev klonet til generering pGL4-mut-MIR-21. Alle konstruktioner blev bekræftet ved DNA-sekventering.
Luciferaseaktivitet
Celler i en tæthed på 2 x 10
5 pr brønd blev podet i plader med 24 brønde og dyrket natten over. For
miR-21
assay blev celler cotransficeret med 0,8 ug pMIR-PTEN-3′-UTR eller pMIR-PTEN-mut-3′-UTR, 50 nM miR-21 efterligner eller inhibitor eller forvrænget oligonukleotid sammen med 50 ng pRL-TK vektor som en intern kontrol ved hjælp af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen). For promotoren assayet blev cellerne co-transficeret med 1 ug pcNF-KB eller pcDNA, 20 ng af et luciferasereporterplasmid og 10 ng af Renilla luciferase reporter plasmid (Promega). Fireogtyve timer efter transfektion blev cellerne høstet, og luciferaseaktiviteten blev bestemt ved anvendelse af en dobbelt luciferase reporter assay (Promega, USA). Resultaterne blev udtrykt som relative luciferaseaktivitet som tidligere [15] rapporterede. Alle forsøg blev gentaget tre gange in triplo.
chip assay
Chippen assay blev udført under anvendelse af Magna chip A /G kit (Millipore) ifølge producentens anbefaling. Kort fortalt A549-celler blev tværbundet med 1% formaldehyd (Sigma-Aldrich) i 10 minutter og standset ved glycin. De tværbundne celler blev opsamlet i koldt PBS og sonikeret i seks 15-S pulser ved 50-s mellemrum for at reducere det totale DNA størrelse til 200-1000 bp. Den afskårne kromatin og magnetiske perler blev immunfældet med anti-NF-KB (ab7970; Abcam, USA) eller normalt kanin IgG natten over ved 4 ° C på en rotator. Magnetiske perle-antistof-kromatin komplekser blev vasket en gang med en buffer med lavt saltindhold, efterfulgt sekventielt af høj salt, LiCI og TE buffere. Kromatin komplekser blev elueret og inkuberet ved 62 ° C i 2 timer. DNA-prøverne blev udvundet under anvendelse af spin-søjler. For chip prøver blev realtids-PCR udført ved anvendelse af SYBR fremgangsmåde som beskrevet ovenfor.
3- (4,5-dimethylthiazol-2-yl) -2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT) assay
celler blev podet i plader med 96 brønde ved en densitet på 5000 celler pr. Efter 24 timer blev cellerne transficeret med 100 nM MIR-21 mimic, MIR-21 inhibitor eller krypteret oligonukleotid. For kombinationseksperimenter med MIR-21 efterligning og pcDNA-PTEN blev celler cotransficeret med pcDNA-PTEN (0,2 ug). Mediet blev udskiftet med frisk komplet medium med eller uden cisplatin (5 uM) ved 24 timer efter transfektion ifølge en tidligere rapport [16]. Efter yderligere 24 timer, 20 pi 5 mg /ml MTT (dimethyl thiazolyl diphenyl tetrazolium; Sigma-Aldrich) blev tilsat til hver brønd og inkuberet i 4 timer i en fugtig inkubator. Supernatanten blev derefter kasseret, og 200 pi DMSO blev sat til hver brønd for at opløse formazan. Den optiske densitet (OD) blev målt ved 490 nm. Levedygtigheden af celler uden nogen behandling blev defineret som 100%, og levedygtigheden af andre grupper blev beregnet separat fra de falske celler.
Statistik
Kontinuerlige variabler blev præsenteret som den gennemsnitlige ± SD og bestemt under anvendelse af variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af en post-hoc
t
-test ved anvendelse SPSS 13.0 software. Sammenhængen mellem overlevelse og
miR-21
udtryk blev bestemt ved anvendelse af multipel logistisk regressionsanalyse, herunder følgende faktorer: alder, køn, ryger og histologi. Kaplan-Meier-analyse blev anvendt til at evaluere graden af begivenheden overlevelse og den primære åbenhed. Statistisk signifikans blev defineret som en
P Drømmeholdet værdi mindre end 0,05.
Resultater
miR-21
er overudtrykt i NSCLC lungevæv
Lungevæv fra 34 patienter med NSCLC og 10 patienter uden NSCLC blev anvendt til fremstilling af TMA. De kliniske karakteristika for de emner er vist i tabel 1. Ekspressionen af
MIR-21
blev detekteret ved ISH. Intensiteten af
miR-21
farvning blev øget betydeligt i NSCLC celler. Scoren var signifikant forøget hos patienter med NSCLC (Fig 1A og B;.
P
0,05). Desuden blev overlevelsestiden nedsat hos patienter med NSCLC, som havde et højt
MIR-21
sammenlignet med dem, der havde et lavt niveau af
MIR-21
(figur 1C;.
P
. 0,05)
(a) ISH blev anvendt til at detektere mIR-21 i en TMA med 34 NSCLC og 10 normale lunge prøver. Venstre panel var ISH og højre panel var HAN farvning. (B) Den farvning intensitet score var højere i NSCLC patienter sammenlignet med raske personer. (C) overlevelsestiden for patienter med højt niveau af MIR-21 var kortere end der med lavt niveau af MIR-21. *
P
0,05 som signifikant forskel
miR-21
modulerer overlevelsen af A549 celler
MIR-21
efterligner blev brugt til at repræsentere eksogene
miR-21
, og
miR-21
inhibitor blev anvendt til at hæmme endogene
miR-21
. Niveauet af
MIR-21
i A549-celler blev detekteret ved real-time PCR (fig. 2B). Dernæst brugte vi MTT-assayet til at evaluere cellelevedygtigheden af A549-celler, når de udsættes for cisplatin behandling. Som vist i fig. 2C, cellelevedygtigheden var signifikant forøget i celler behandlet ved
MIR-21 Salg efterligner sammenlignet med kontrolgruppen. Inhibering af
MIR-21
efter dets inhibitor faldt cellelevedygtigheden sammenlignet med kontrolgruppen.
Cellerne i kontrol, MIR-21 efterligner og MIR-21 inhibitoren blev transficeret med 100 nM scrambled oligonukleotid, mIR-21 efterligning og mIR-21 inhibitor, henholdsvis. (A) Time akse af eksperimentet. Den krypterede oligonukleotid, MIR-21 efterligner eller inhibitor blev givet 4h før cisplatin behandling (5 uM). Og 48h efter cisplatin-behandling blev cellerne høstet til yderligere analyse. (B) mRNA ekspression af PTEN blev omvendt forhold med MIR-21. (C) MIR-21 efterligner øget cellelevedygtigheden mens MIR-21 inhibitor faldt det når celler udsættes for cisplatin behandling. (D) Western blotting af PTEN, total Akt (t-Akt) og fosfor Ser473 Akt. (E) Grafisk repræsentation af PTEN, t-Akt og fosfor-Akt. MIR-21 faldt ekspressionen af PTEN og øget forholdet mellem phosphor-Akt. * Sammenlignet med kontrolgruppen, # sammenlignet med miR-21 efterligner gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskel
miR-21
regulerer
PTEN
udtryk ved binding til dets 3′-UTR
a bioinformatik søge vist, at
PTEN
, en tumor-suppressor gen, var et potentielt mål for
miR-21
fordi der var en formodet
miR-21
-bindested frø sekvens i 3’UTR af
PTEN
mRNA (fig. 3A). Vi målte mRNA (fig. 2B) og proteinniveauer af PTEN (fig. 2D) i A549-celler med en høj eller lav grad af MIR-21. En omvendt korrelation mellem
miR-21
udtryk og
blev opdaget PTEN
mRNA-ekspression.
Akt
er neden for
PTEN
, og jeg påvirkede også aktivering af
Akt
(fig. 2D og E). Sammenlignet med kontrolgruppen,
MIR-21
efterligner faldt luciferaseaktiviteten, hvorimod
MIR-21
inhibitor viste en betydelig stigning i den relative luciferaseaktivitet. Når frøet sekvens af
MIR-21
bindingssteder blev muteret, effekten af
MIR-21 til salg på luciferaseaktivitet blev ikke påvist (fig. 3B). Dernæst hele den åbne læseramme af
PTEN
med eller uden
MIR-21
målsekvens i 3’UTR blev klonet ind pcCS2.
Myc
niveau, som repræsenterede eksogene
PTEN
, faldt af
miR-21
efterligner i cellerne transficeret med pcCS2-PTEN-3’UTR, mens der var ingen signifikant reduktion i
Myc
ekspression ved
mIR-21 Salg efterligner i cellerne transficeret med pcCS2-PTEN (fig. 3C og D). Disse resultater antydede, at
MIR-21
reguleret ekspression af
PTEN
i A549 celler via målrettet sekvensen af PTEN 3’UTR.
(A) Opførelse af 3 ‘UTR og muterede 3’UTR af PTEN ind pMIR-RAPPORT vektor. (B) I celler transficeret med pMIR-RAPPORT-PTEN-3’UTR blev luciferaseaktiviteten steget med miR-21 og faldt med miR-21 hæmmer. I celler transficeret med pMIR-RAPPORT-PTEN-mut-3’UTR, luciferaseaktiviteten forblev ingen signifikant forskel mellem de tre grupper. (C) Den åbne læseramme af PTEN med eller uden 3’UTR blev klonet ind pCS2 vektor. En Myc-mærke blev fastgjort til PTEN at skelne mellem den endogene eller exogene PTEN. (D) Grafisk repræsentation af Myc viste, at overekspression af MIR-21 reducerede Myc ekspression mens MIR-21 inhibitor forøgede dets ekspression. Mens PTEN 3’UTR blev slået ud, var udtryk for PTEN ikke påvirket af miR-21. * Sammenlignet med kontrolgruppen, # sammenlignet med miR-21 efterligner gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskel
NF-KB regulerer ekspressionen af miR-21 via binding sin promotor
I betragtning af den rolle
miR-21
i NSCLC, vi havde til formål at undersøge mekanismen for overekspression af
miR-21
i NSCLC. Den bioinformatik analyse foreslog fire potentielle bindende elementer af NF-KB i promotorregionen af
MIR-21
genet (fig. 4A). Chippen realtid assay viste, at niveauet af NF-KB antistofbinding til
MIR-21
promotoren var mere end det af IgG (figur 4C,
P
. 0,05) , hvilket viser, at NF-KB direkte kunne binde til alle fire elementer i promotorregionen af
mIR-21
gen. Dernæst vi subklonet forskellige længder af
MIR-21
promotor og dens mutation i pGL4 og cotransficeres konstruktionerne med Renilla med eller uden pcNF-KB i A549-celler. Som vist i fig. 4B, pcNF-KB forøgede luciferaseaktiviteten væsentligt i forhold til pcDNA. Når den første bindingselement (-2837) blev slettet eller muteret, var der ingen reduktion i luciferaseaktivitet i forhold til fuldlængde-promotoren. Når det andet element (-1211) blev slettet eller muteret, var der en signifikant reduktion i luciferaseaktivitet. Når det tredje element er blevet slettet eller muteret, var der ingen signifikant reduktion i luciferaseaktivitet forhold til, når det andet element fjernes. Men når de bindende sekvenser af NF-KB blev alle deleteret eller muteret, var der også signifikant reduktion i luciferaseaktivitet forhold til, når det andet element er blevet slettet eller muteret. Disse resultater viste, at det andet og fjerde bindende elementer kan bidrage til reguleringen af
miR-21
transskription af NF-KB.
(A) Den fulde længde af miR-21 har fire NF -κB bindende elementer. Forskellige længder af MIR-21-promotoren blev klonet til pGL4 vektor. De fire elementer var muteret individuelt og de muterede promotorer blev også klonet til pGL4 vektor. (B) Den relative luciferaseaktivitet i A549-celler cotransficeret med pcNF-KB og pGL4 rapportering vektor. (C) chips realtime assay viste, at NF-KB-antistof binde mere DNA end normalt IgG. Primer 1 til 4 betyder primeren indeholdt fire NF-KB bindende elementer fra opstrøms til nedstrøms. *
P
. 0,05 som signifikant forskel
NF-KB /miR-21 /PTEN vej modulerer følsomheden af A549 celler til cisplatin
niveau af
mIR-21
blev induceret ved overekspression af NF-KB og inhiberes af Lenti-shNF-KB, der faldt ekspressionen af NF-KB (fig. 5A).
PTEN
ekspression blev omvendt korreleret med NF-KB-ekspression (fig. 5A). Cellelevedygtigheden af A549-celler var signifikant forhøjet ved Lenti-NF-KB når de udsættes for cisplatin behandling (fig. 5B). I celler transficeret med pcCS2-PTEN at overudtrykke
PTEN
, virkningerne af overekspression af NF-KB eller
MIR-21 til salg på cellelevedygtigheden af A549-celler blev inhiberet (fig. 5C) .
(A) mRNA udtryk for NF-KB, miR-21 og PTEN i cellerne transduceret med Lenti-kontrol, Lenti-NF-KB og Lenti-shNF-KB. MIR-21 niveau blev væsentligt forøget, mens PTEN blev reduceret i cellerne transduceret med Lenti-NF-KB sammenlignet med kontrol vektor. MIR-21 niveau blev signifikant nedsat, mens PTEN blev reduceret i cellerne transduceret med Lenti-NF-KB. (B) Cellelevedygtighed blev øget med Lenti-NF-KB mens faldet med Lenti-shNF-KB. (C) Overekspression af PTEN restaureret følsomheden af A549-celler for cisplatin behandling sammenlignet med overekspression af NF-KB eller MIR-21. * Sammenlignet med kontrolgruppen, # sammenlignet med Lenti-NF-KB-gruppe.
P
. 0,05 som signifikant forskel
Diskussion
I den foreliggende undersøgelse, vi viste, at
miR-21
blev opreguleret i patienter med NSCLC, hvilket indikerer en dårlig prognose. Desuden blev det konstateret, at
MIR-21
inducerede modstand af NSCLC cellelinie til cisplatin via målretning af 3’UTR af
PTEN
at formindske dets ekspression post-transkriptionelt. Desuden NF-KB translokerer ind i kernen og binder til de specifikke elementer i
miR-21
gen promoter at fremkalde
miR-21
udtryk. Endelig modulering af NF-KB /MIR-21 /PTEN pathway forøget følsomhed over NSCLC celler til cisplatin-behandling. Vores data kan give ny indsigt i den patofysiologiske mekanisme NSCLC og foreslår en nyt lægemiddel mål for NSCLC.
miR-21
har vist sig at være overudtrykt i mange typer af solide tumorer, herunder leverkræft, prostatakræft og tarmkræft. I vores nuværende studie, vi udvundet væv fra patienter med NSCLC og kontrolpersoner til at udføre TMA. ISH resultat detekteret et højere
MIR-21
hos patienter med NSCLC sammenlignet med kontrolpersoner. Desuden det høje niveau af
miR-21
angivet en dårlig prognose for patienter med NSCLC. Dette understøttes af mange tidligere undersøgelser. I Markou et al. undersøgelse blev 48 NSCLC frisk-frosne vævsprøver indsamlet til at opdage
miR-21
udtryk ved real-time PCR, og det blev konstateret, at
miR-21
blev opreguleret i 16 af 29 ( 55,2%) patienter med tilbagefald og 15 af 23 (65,2%) afdøde patienter [17]. Derudover er der i ikke-rygere, den afvigende øget ekspression af
MIR-21
viste sig at bidrage til lunge carcinogenese [18]. To metaanalyser sammenfattet data fra forskellige undersøgelser og konkluderede, at overekspression af
miR-21
var en uafhængig prognostisk faktor for NSCLC [19], især i de asiatiske mennesker [20].
Til forstå virkningen af
miR-21 til salg på NSCLC,
mIR-21
efterligner og dets inhibitor blev brugt henholdsvis at øge og hæmme dens biologiske funktion i A549 NSCLC cellelinje. Det konstateredes, at exogent
MIR-21
fremmes celleoverlevelse når de udsættes for cisplatin behandling, hvorimod
MIR-21
inhibering ført til det modsatte funktion. Disse resultater blev bekræftet af en undersøgelse, som viste, at forhøjede
miR-21
forøgede modstand A549 celler til platin, mens reduceret
miR-21
faldt denne modstand [21]. Baseret på de ovenstående resultater,
miR-21
kunne være en potentiel terapeutisk mål for NSCLC. Den underliggende mekanisme af cisplatin modstand NSCLC er kompliceret, og
miR-21
har også flere mål i henhold til bioinformatik analyse. At udforske effekten af jeg på NSCLC, før det rykker længere ind i kliniske anvendelse scenen, to væsentlige spørgsmål fortsætter:. Hvordan jeg påvirker resultatet af NSCLC, og hvordan jeg er opreguleret i NSCLC
Bioinformatik undersøgelser tyder et mål site af
miR-21
i 3’UTR af
PTEN
mRNA. Jeg er en allestedsnærværende tumor-suppressor-gen, og dens deregulering resulterer i mange faste tumorer. I NSCLC, har jeg været impliceret som en vigtig bidragyder til patogenese og tumorvækst [22].
PTEN
tab er blevet anerkendt som mekanismen for gefitinibs modstand i NSCLC [23]. Målrettet sletning af
PTEN
fører til udvikling af NSCLC [24]. Derfor blev det antaget, at
miR-21
, som hæmmer
PTEN
ved at målrette sin 3’UTR ville påvirke NSCLC patologiske proces. Vi oprindeligt identificeret et omvendt forhold mellem
miR-21
og
PTEN
i A549 celler. Vi derefter klonet 3’UTR af
PTEN
i pMIR-RAPPORT luciferase reporter og fandt, at
miR-21
efterligner faldt betydeligt luciferase aktivitet, når cotransficeret med pMIR-RAPPORT-PTEN-3 ‘ UTR, hvorimod blev bemærket nogen ændring i luciferase aktivitet, når
miR-21
efterligner blev cotransficeret med pMIR-RAPPORT-PTEN uden 3’UTR. Tidligere undersøgelser har også støttet dette fund [25,26]
På den ene side,
miR-21
reguleret ekspression af
PTEN
.; på den anden side blev det reguleret af andre faktorer. Nogle miRNA har deres egne initiativtagere, mens andre deler en promotor med andre miRNA for miRNA gen placeret i intron værtslandets genet. Hvorvidt miRNA har deres egen promotorer eller dele initiativtagere, kan deres udtryk reguleres af visse transkriptionsfaktorer, herunder p53 og NF-KB, som er målrettet deres initiativtagere. Der er fire bindende elementer i NF-KB i
miR-21
gen promotor [27]. Derfor er det muligt, at
MIR-21
kunne reguleres af NF-KB målretning sine bindende elementer. Vores chip assay bekræftede, at NF-KB direkte kunne binde til alle fire elementer i promotoren af
MIR-21
gen. Men kun de elementer placeret på -1211 og -404 af
miR-21
gen promotor havde biologiske funktion i henhold til den luciferaseaktiviteten analysen. Vores data blev delvist støttet af de andre studier. I prostatacancerceller, interferon-inducerede
miR-21
udtryk krævede NF-KB /p65 rekruttering til
miR-21
promotor [27]. I humane bryst- MDA-MB-231 og colorektale HCT116 tumorcellelinjer blev NF-KB sig også at binde til
MIR-21
genpromotoren [28]. I NSCLC blev NF-KB først identificeret til at regulere ekspressionen af
miR-21
ved at binde til dens elementer i
miR-21
gen promotor. Vi fandt også, at NF-KB-induceret
MIR-21
ekspression modulerer sit målgen,
PTEN
, den reducerede ekspression fremmer celleoverlevelse.
Leave a Reply
Du skal være logget ind for at skrive en kommentar.