PLoS ONE: [6] -Gingerol inducerer Caspase-Dependent Apoptose og Forhindrer PMA-proliferation i Colon Cancer Cells ved at hæmme MAPK /AP-1 Signaling

Abstrakt

Vi rapporterer mekanisme-baserede beviser for anticancer og kemoforebyggende effekt af [6] -gingerol, den største aktive princip i lægeplante, Ginger (

Zingiber officinale

), i kolon kræftceller. Forbindelsen blev evalueret i to humane coloncancer-cellelinjer for dens cytotoksiske virkning og den mest følsomme cellelinie, SW-480, blev udtaget til mekanistisk evaluering af dets anticancer og kemoforebyggende effekt. Den ikke-toksiske beskaffenhed af [6] -gingerol blev bekræftet ved levedygtighed assays af hurtigt delende normale mus colonceller. [6] -gingerol hæmmet celledeling og induceret apoptose som det fremgår af eksternalisering af phosphatidylserin i SW-480, mens de normale colon celler var upåvirkede. Følsomhed over for [6] -gingerol i SW-480-celler var forbundet med aktivering af caspaser 8, 9, 3. og 7 og spaltning af PARP, som vidner induktion af apoptotisk celledød. Mekanistisk, [6] -gingerol nedreguleres phorbolmyristatacetat (PMA) induceret phosphorylering af ERK1 /2 og JNK MAP-kinaser og aktivering af AP-1 transkriptionsfaktor, men havde kun lidt indvirkning på phosphorylering af p38 MAP-kinase og aktivering af NF -kappa B. Derudover er det suppleret inhibitorer af enten ERK1 /2 eller JNK MAP-kinase for at bringe PMA-induceret celleproliferation i SW-480-celler. Vi rapporterer hæmning af ERK1 /2 /JNK /AP-1-vejen som en mulig mekanisme bag anticancer samt kemopræventive effekten af ​​[6] -gingerol mod tyktarmskræft

Henvisning:. Radhakrishnan E, Bava SV , Narayanan SS, Nath LR, Thulasidasan AKT, Soniya EV, et al. (2014) [6] -Gingerol inducerer Caspase-Dependent Apoptose og Forhindrer PMA-induceret spredning i Colon Cancer Cells ved at hæmme MAPK /AP-1 signalering. PLoS ONE 9 (8): e104401. doi: 10,1371 /journal.pone.0104401

Redaktør: Rana Pratap Singh, Jawaharlal Nehru University, Indien

Modtaget: Marts 17, 2014 Accepteret: 13 Jul 2014; Udgivet: 26 August, 2014

Copyright: © 2014 Radhakrishnan et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

Konkurrerende interesser:. Ruby John Anto er en PLoS ONE Editorial Board medlem. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE Redaktionelle politikker og kriterier.

Introduktion

Tyktarmskræft er den tredje mest diagnosticeret type kræft, og den tredje hyppigste årsag til kræft-relaterede dødsfald i Forenede Stater. Globalt er det den fjerde mest almindelige dødsårsag på grund af kræft. Variationerne i kostvaner og øget forbrug af rødt og forarbejdet kød bidrager til denne stigning i forekomsten af ​​tyktarmskræft [1], [2] .Surgical procedurer og kemoterapi udgør de vigtigste terapeutiske regimer for tyktarmskræft [3]. Stigningen i lægemiddelresistens vanskeliggør behandlingen af ​​coloncancer og problemerne i forbindelse med metastase øger dens sværhedsgrad. Søgning er tændt i hidtil ukendte terapeutiske midler, der er rettet mod molekylære signalveje i tyktarmskræft for at standse dens vækst og metastase.

Ginger (

Zingiber officinale

) har længe været anvendt i traditionel medicin og er kaldes “

Maha-aushadhi

” i Ayurveda, som betyder “

den store medicin

” [4]. Rhizomet fra ingefær indeholder mange bidende phenolforbindelser som [6] -gingerol, [6] -shagol, [6] -paradol og zingeron [5] .Disse forbindelser er blevet undersøgt for deres anti-bakteriel, anti-oxidant, anti inflammatoriske og anti-tumor egenskaber [6], [7]. Mange undersøgelser har vist anti-cancer egenskaber af disse phenoler mod cancere af forskellig oprindelse. Rhizomet af ingefær er en ingrediens i daglige kost i mange lande, og er en aktiv ingrediens i mange traditionelle systemer af plantelægemidler, ligesom orientalsk medicin og Ayurveda, til styring af mange lidelser, herunder fordøjelsesbesvær og andre gastrointestinale lidelser. Denne traditionelle viden udløser en særlig interesse i at karakterisere kemo-forebyggende og anti-kræft karakter af disse fenoler mod gastrisk kræft som kolorektal cancer eller pancreascancer.

Blandt disse phenolforbindelser, [6] -gingerol (1- [4′-hydroxy-3′-methoxyphenyl] -5-hydroxy-3-decanon) er blevet undersøgt for dets cytotoksiske virkninger i forskellige cancercellelinier, herunder colorectal cancer. [6] -gingerol blev vist at inducere celledød i livmoderhalskræft cellelinie HeLa, ved caspase-3 afhængig apoptose og autofagi [8]. Det kunne inhibere metastase af MDA-MB-231 brystcancerceller og inducere apoptose i LNCaP-prostatacancerceller [9], [10]. Indgivelse af [6] -gingerol hæmmede væksten af ​​flere typer murine tumorer, såsom melanomer, nyrecellecarcinomer og coloncarcinomer ved at forbedre infiltrationer af tumor-infiltrerende lymfocytter CD4 og CD8 T-celler og B220

+ B-celler [11]. [6] -gingerol viste sig også at inhibere progressionen af ​​phorbolester-induceret hud tumor i ICR-mus [12]. Kun et begrænset antal undersøgelser er blevet offentliggjort på de anti-cancer egenskaber [6] -gingerol og dens virkningsmekanisme mod tyktarmskræft [13], [14], [15].

I denne undersøgelse af cytotoksiske virkninger af [6] -gingerol på SW-480 colon cancerceller blev sammenlignet med dets virkning på hurtigt delende normale intestinale epitelceller fra mus. Undersøgelsen udføres også en

in vitro

mekanistisk evaluering af de inhiberende virkninger af [6] -gingerol på phorbol 12-myristat 13-acetat (PMA) inducerede anti-apoptotiske signaler i SW-480-celler.

Materialer og metoder

2.1.

materialer

Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) blev opnået fra Life Technologies (Grand Island, NY, USA); Føtalt bovint serum (FBS) fra PAN Biotech (GmbH, Aidenbach, Tyskland); Hanks balancerede saltopløsning (HBSS), epidermal vækstfaktor (EGF) og insulin, transferrin, selen, natriumpyruvat opløsning (ITS-A) fra Invitrogen; Antistoffer mod phospho-p38, phospho-ERK1 /2, phospho-JNK, beta-actin og caspaser blev indkøbt fra Cell Signaling (Beverly, MA, USA) og antistoffer mod poly ADP ribose polymerase (PARP) var fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA). [6] -gingerol blev købt fra Biomol (Hamborg, Tyskland). De MAP kinase hæmmere U0126, SP600125, SB203580 og NF-kappaB hæmmer SN50 blev indkøbt fra Calbiochem (San Diego, CA). Alle andre kemikalier, herunder phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) blev købt hos Sigma Chemicals (St. Louis, MO, USA).

2.2. Cellekultur

Humane tyktarmskræft cellelinjer, SW-480 og HCT116 blev opnået fra Nationalt Center for Cell Sciences (NCC’erne), Pune, Indien. Celler blev dyrket i Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM) suppleret med 10% kalvefosterserum (FBS) sammen med 100 U /ml penicillin, 50 mikrogram /ml streptomycin og 1 mikrogram /ml amphotericin B. Cellelinierne blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO2 og blev sub-dyrket to gange om ugen.

Normale intestinale epitelceller (IECS) blev isoleret fra muse colon som pr fastlagt protokol [16], [17], med passende ændringer, som er godkendt af Institutional Animal Etisk Udvalg, Rajiv Gandhi Center for Bioteknologi som pr reglerne i

Udvalget for formålet med kontrol og tilsyn med forsøg på dyr

, Miljøministeriet og Skov, Indiens regering ( sanktion No: IAEC /151 /RUBY /2012). Kort fortalt mus (

schweiziske albino

, 7 uger gamle, IAEC sanktionere No: IAEC /151 /RUBY /2012) colon blev dissekeret ud og rengøres aseptisk med 1 × Hanks Balanced Salt Solution (HBSS) for at fjerne fecal sagen . Tarmen blev længderetningen åbnet og skåret i 1 cm stykker og blev inkuberet i nærvær af type 1 collagenase (200 U /ml) i 30 min under kraftig omrystning. De fjernede epitelceller blev isoleret ved centrifugering af supernatanten. Disse celler blev dyrket i højglucose DMEM med 10% FBS og 2 × antibiotika, der indeholder 10 ng /ml epidermal vækstfaktor (EGF) og 5 ug /ml insulin-transferrin-selen-natriumpyruvat (ITS-A) (Invitrogen, USA ). Denne cellelinje blev holdt ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2 og blev sub-dyrket gang i en måned.

2.3. Drug behandling

[6] -gingerol lager (20 mg /ml) fremstilles i ethanol og arbejdsgrupperne koncentrationer blev fremstillet ved at fortynde denne bestand i dimethyl sufoxide (DMSO). For MTT-assay, 5 x 10

3 celler /brønd af humane coloncancer-celler og 10

4 celler /brønd af muse IECS blev podet i plader med 96 brønde. Celler blev behandlet med [6] -gingerol i 48 timer, 72 timer eller 96 timer før udførelse MTT assay og i 16 timer før Annexin-V-farvning. PMA (5 mg /ml) blev fremstillet i DMSO og opbevaret ved -20 ° C. I alle kombinationsbehandlinger [6] -gingerol blev tilføjet 2 h før behandling med PMA. I celleviabilitetstest /Western blot for kombinationsbehandlinger med MAP-kinase inhibitorer (2,5 mikromolær U0126, 5 mikromolær SP600125, 1’micromolar SB203580) eller NF-kappaB inhibitor (18 mikromolær SN50) blev celler først behandlet med inhibitoren i 1 time og efterfølgende forbehandlet med [6] -gingerol i 2 timer, efterfulgt af udsættelse for PMA i 48 timer før udførelse MTT assay. For elektroforetiske mobilitet (EMSA), 10

6 celler af SW-480 blev podet i 60 mm plader, og celler blev forbehandlet med [6] -gingerol i 2 timer og derefter med PMA i 30 min.

2.4. Cellelevedygtighed assay

cytotoksiske virkninger af [6] -gingerol blev bestemt ved MTT-assay som tidligere beskrevet [18], og den relative procentvise cellelevedygtigheden udtrykkes som [A

570 af behandlede brønde /A

570 af ubehandlede brønde × 100].

2.5. Annexin V-Propidium iodfarvning

Membranen flip-flop induceret af 16 timer behandling med [6] -gingerol blev analyseret ved farvning af cellerne med fluorescein-isothiocyanat-konjugeret annexin V /PI (Santa Cruz Biotechnology) ifølge producentens instruktioner og de apoptotiske celler blev fotograferet under fluorescerende mikroskop [19]. Det samlede antal celler i den mikroskopiske område blev talt under et fasekontrastmikroskop, og antallet af fluorescerende celler i det samme område blev talt under et fluorescerende mikroskop. Fraktionen af ​​fluorescerende celler til det samlede antal celler er repræsenteret som procentdelen af ​​apoptotiske celler. Dette blev gentaget i flere områder af samme brønd og den gennemsnitlige blev taget for plotning.

2.6. Immunoblotting

Den samlede protein isoleret fra celler efter behandlinger, med eller uden PMA /[6] -gingerol, blev underkastet Western blotting som tidligere [20] beskrevne. Kort sagt, 60 mikrogram helcellelysat blev separeret på en 10-15% polyacrylamidgel, blottet på en PVDF-membran, probet med tilsvarende antistof og påvist under anvendelse af ECL (Millipore, Billerica, MA, USA).

2.7. Elektroforetisk mobilitet (EMSA)

EMSA blev udført for at vurdere DNA-bindingsaktivitet af NF-kappa B eller AP-1 transkriptionsfaktorer i celler behandlet med PMA og /eller [6] -gingerol, som beskrevet tidligere [21]. Kort fortalt 10 ug kerneproteiner, isoleret fra celler efter lægemiddelbehandlinger, blev inkuberet i 30 min med

32P-endemærket dobbeltstrengede 45-mer oligonukleotid til NF kappaB (5’TTGTTACAAGGGACTTTCCGCTGGGGACTTTCCAGGGAGGCGTGG-3 ‘; ved 37 ° C) eller 21-mer oligonukleotid til AP-1 (5’-CGCTTGATGACTCAGCCGGAA-3 ‘; ved 30 ° C) og DNA-protein-kompleks blev opløst på 6,6% ikke-denaturerende polyacrylamidgel, som blev tørret og visualiseret på Phosphor Imager (Personal Molecular Imager FX, Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA, USA).

2.8. Statistisk analyse

Alle forsøgene blev udført mindst tredobbelt (n = 3). Fejlsøjlerne repræsenterer ± standardafvigelse (S.A.) af forsøgene. Den statistiske analyse blev udført ved hjælp af t-test og symbolerne *, ** og *** repræsenterer P-værdier, p ≤ 0,05, p≤0.005 og p≤0.001 henholdsvis.

Resultater

3.1. [6] -gingerol inducerer dosisafhængig cytotoksicitet i colon cancerceller, mens normale intestinale epitelceller er upåvirkede

[6] -gingerol blev screenet for sine cytotoksiske virkninger på SW-480 og HCT116-celler ved forskellige koncentrationer i området fra 5 mikromolær til 300 mikromolær, i 72 timer under anvendelse af MTT-assayet. Dosisafhængige ændringer i cellulær morfologi var tydeligt under fasekontrastmikroskop (fig. 1A). Resultaterne viser [6] -gingerol at være cytotoksisk over for både SW-480 og HCT116 celler i en dosis-afhængig måde, med fremtrædende cytotoksicitet ved højere koncentrationer, der producerer en IC

50 værdi på 205 ± 5 mikromolær og 283 ± 7 mikromolær henholdsvis (fig. 1B og fig. 1C) .Den effekt var mere fremtrædende i tilfælde af SW-480 end HCT116 og dermed det tidligere blev anvendt i alle yderligere undersøgelser. Tværtimod resultaterne fra MTT-assay med mus normal IECS afslørede kun 10-15% cytotoksicitet selv ved det dobbelte af IC

50 koncentration af [6] -gingerol mod SW-480.The cellulær morfologi og celleantal blev set stort set upåvirket selv ved 500 mikromolær af [6] -gingerol (fig. 2A). At studere den tidsafhængige virkning af [6] -gingerol ved effektive koncentrationer afslørede en stigning i cytotoksicitet SW-480-celler over tid fra 48 timer til 96 timer, selvom cellelevedygtigheden af ​​mus normale IECS forblev uændret (fig. 2B) .Disse resultater antyder specificiteten af ​​[6] -gingerol til induktion cytotoksicitet i kræftceller uden at være toksisk for normale celler selv ved højere koncentrationer.

(A) fasekontrastmikroskopi billeder af morfologiske ændringer i SW-480-celler når de behandles med angivne koncentrationer af [6] -gingerol i 72 timer. (B) Relativ cellelevedygtighed af SW-480 celler efter [6] -gingerol behandling, bestemt ved MTT-assay og udtrykt som procent af den ubehandlede kontrol. 5000 celler /brønd af SW-480-celler blev behandlet med den angivne koncentration af [6] -gingerol i 72 timer forud for MTT-assayet. (C) Relativ cellelevedygtighed af HCT-116-celler efter [6] -gingerol behandling. Resultaterne er vist som gennemsnit af tredobbelte eksperimenter ± standardafvigelse (SD).

(A) fasekontrastmikroskopi billeder af IECS behandlet med angivne koncentrationer af [6] -gingerol i 72 timer. (B) Tidsafhængige cytotoksiske virkninger af [6] -gingerol på SW-480 og IECS på 48, 72 og 96 timer. 5000 celler /brønd af SW-480 og 10.000 celler /brønd IECS blev behandlet i 48 til 96 h med angivne doser af [6] -gingerol før MTT-assay. Resultaterne er repræsenteret som middelværdi ± SD fra tredobbeltforsøg.

3.2. [6] -gingerol inducerer apoptose i colon cancerceller, men ikke i normale intestinale epitelceller

For at vurdere, om induktion af cytotoksicitet efter [6] -gingerol medieres af apoptose, membranen flip-flop og eksternalisering af phosphotedylserine blev overvåget i [6] -gingerol behandlet SW-480 celler ved at udføre Annexin-V /PI farvning. Resultaterne fra Annexin-V /PI-farvning bekræftede de tidlige begivenheder af apoptotis i [6] -gingerol behandlet SW-480-celler, som det fremgår af den dosisafhængige forøgelse af fluorescerende celler (fig. 3A) .De resultaterne fra lignende undersøgelse udført på mus IECS viste kun ubetydeligt antal fluorescerende celler, selv ved 500 mikromolær af [6] -gingerol treatment.100 mikromolær 5-Fluro Uracil (5-FU) tjente som positiv kontrol for Annexin V-farvning på normale IECS (fig. 3B ).

(A, øvre panel) SW-480-celler blev behandlet med angivne koncentrationer af [6] -gingerol i 16 timer og farvet for Annexin V /propidiumiodid (PI) positivitet. Grøn-fluorescens indikerer Annexin V-binding til den beskadigede cellemembran under tidlig apoptose og rød fluorescens indikerer PI binding til den eksponerede DNA under sent apoptose. (A, nedre panel) Grafisk repræsentation af procentdelen af ​​Annexin V /PI positive SW-480-celler i forhold til [6] -gingerol koncentration. (B, øvre panel) IECS blev behandlet med op til 500 pM af [6] -gingerol i 16 timer før udførelse Annexin V-PI-farvning. Behandling med 100 pM 5-FU blev anvendt som positiv kontrol for apoptose induktion. (B, nederste panel) Repræsentant histogram af procentdelen af ​​Annexin /PI positive IECS efter [6] -gingerol /5-FU-behandling. Resultaterne er vist som middelværdi fra tredobbelte eksperimenter ± SD.

Vi analyserede også celleekstrakterne fra SW-480-celler behandlet med [6] -gingerol for aktiveringen af ​​caspase-8, 9, 3 , 7 og spaltning af PARP ved hjælp immunoblotting eksperimenter. Caspaser er en familie af cysteinproteaser, der aktiveres under den apoptotiske program. Vi observerede en signifikant spaltning af pro-caspase 8 dets aktive fragmenter (P43 /41) og procaspase-9 til dets aktive fragmenter (p35 /37) (fig. 4A og 4B). Aktiveringen af ​​effektor-caspaser 3 og 7 blev også induceret af [6] -gingerol på en dosis-afhængig måde, spaltning procaspase-3 til dens aktive fragmenter (p17 /19) og forbedring af spaltningen af ​​procaspase-7 til dets aktive fragment (p20) (fig. 4C og 4D). Endelig undersøgte vi spaltning af DNA’et reparation protein, PARP, som er et substrat for caspase-3.Upon behandle cellerne med 200 og 300 mikromolær af [6] -gingerol blev den 116-kDa form af PARP spaltes til 89 kDa fragmentet (fig. 4E), hvilket bekræfter en caspase-medieret apoptose. Siden 200 mikromolær af [6] -gingerol blev effektivt aktiverende caspaser fører til PARP-spaltning og apoptose, blev denne koncentration benyttes ved senere signalering undersøgelser.

SW-480-celler (10

6 celler /brønd) blev behandlet med de angivne koncentrationer af [6] -gingerol i 48 timer og hele celleekstrakter blev Western blottet på til PVDF-membran. Aktiveringen af ​​caspaser og PARP-spaltning blev detekteret ved at probe den blottede membran med antistoffer mod caspase-3, 7, 8, 9 og mod PARP. Blottene blev fremkaldt under anvendelse forøget kemiluminescens (ECL). De relative fold forskelle bands med kontrol behandlinger blev kvantificeret fra volumen analyse af de bands der bruger Biorad- Mængde One-software. p-actin tjente som lastning kontrol i hvert enkelt tilfælde.

3.3. [6] -gingerol inhiberer PMA-induceret aktivering af MAP-kinaser i SW-480 celler

PMA er en kendt tumor promotor, der aktiverer næsten alle proteinkinase C (PKC) isozymer, som er fremtrædende opstrøms regulatorer af mitogenaktiveret protein (MAP) kinase pathway [22], [23] .De kinetikken af ​​phosphorylering af Ras /Raf /ekstracellulær signal-reguleret kinase (ERK1 /2), c-jun NH2-terminale kinase (JNK) og p38 MAP-kinase i SW-480-celler som respons på behandling med 50 ng /ml (80 nM) PMA i forskellige tidsintervaller blev undersøgt. Western blot-analyse afslørede en tidsafhængig phosphorylering af ERK1 /2, JNK og p38.In alle tre tilfælde, phosphorylering var tydelig ved 5 min fra PMA-behandling og det toppede med 30 minutter og derefter aftog ved 120 min (fig. 5A). Effekten af ​​[6] -gingerol på PMA-induceret transient phosphorylering af MAP-kinaser undersøgtes på 30 min PMA-behandlede SW-480-celler, forbehandlet med 200 mikromolær [6] -gingerol i 2 timer. Interessant, [6] – gingerol forbehandling ophævede PMA-inducerede forbigående phosphorylering af ERK1 /2 og JNK næsten fuldstændigt, men kun delvist ophævede phosphorylering af p38 MAP kinase i SW-480-celler (Fig 5B.)

(A) natten over dyrket SW-480-celler blev behandlet med 50 ng /ml PMA for forskellige tidsintervaller (0-120 min) og den helcellelysat blev immunblottet på PVDF-membran, probet under anvendelse af antistoffer mod phospho-ERK1 /2, phospho-JNK og phospho-p38, udviklet af ECL. Kinetikken af ​​PMA-induceret phosphorylering af disse MAP-kinaser blev fulgt fra denne blot (B) SW-480-celler blev forbehandlet med 200 pM [6] -gingerol før behandling med 50 ng /ml PMA i 30 minutter og det hele cellelysater blev immunoblottet, probet og detekteret som ovenfor. Den relative ganges forskel af bånd med kontrolbehandlinger er angivet nedenfor hver bane. β-actin tjente som ladningskontrol i hvert tilfælde. (C) SW-480-celler, forbehandlet med angivne koncentrationer af [6] -gingerol i 2 timer, blev behandlet med PMA (50 ng /ml) i 30 min. Kerneekstrakterne fra hver behandling blev analyseret for aktiveringen af ​​AP-1 eller (D) NF-kappaB, ved at udføre den transkriptionelle bindingsassay på isotop mærket AP-1 /NF-kappaB DNA binding probe og analysere det på elektroforetisk mobility shift assay (EMSA). Den pilespids i hvert tilfælde indikerer komplekser mellem AP-1 /NF-kappaB og DNA-probe.

3.4. [6] -gingerol inhiberer den transkriptionelle bindingsaktivitet af PMA-induceret AP-1, men ikke NF-kappaB, i SW-480

PMA er en velkendt aktivator af transkriptionsfaktorer AP-1 og NF- kappaB i forskellige kræftceller [24], [25], [26], [27]. For at bestemme den transkriptionelle bindingsaktivitet af AP-1 i SW-480, induceres som respons på PMA, kerneekstrakt fra cellerne behandlet med 50 ng /mikroliter PMA i anvendtes 1 h for EMSA. En klar dosisafhængig aktivering af AP-1 blev observeret i SW-480 celler efter PMA-behandling (figur 5C;. Bane 5) .Et dosisafhængig nedregulering af denne PMA-induceret AP-1 binding blev observeret ved 2 timer før -Behandling med [6] -gingerol (figur 5C;. Lane 6-8). [6] -gingerol forbehandling viste ikke en drastisk virkning på den transkriptionelle bindende egenskab af NF-kappaB, selv om der var en signifikant inhibering af dets DNA binding ved 300 mikromolær [6] -gingerol (figur 5D;. Lane 6-8 ).

3.5. [6] -gingerol hæmmer PMA-induceret celleproliferation i SW-480 gennem hæmning af ERK1 /2 og JNK MAP-kinase pathways

For yderligere at forstå de mekanistiske detaljer bag de inhiberende virkninger af [6] – gINGEROL på PMA-aktiverede signalveje i SW-480, blev levedygtighed og spredning af SW-480 celler overvåget af MTT assay efter at behandle dem med forskellige kombinationer af PMA, [6] -gingerol og hæmmere af MAP kinaser eller NF-kappaB. Primært, PMA behandling forbedret spredning af SW-480 celler betydeligt. Men, [6] -gingerol forbehandling af cellerne nedbragte PMA-inducere proliferation drastisk. Imidlertid levedygtighed SW-480-celler efter [6] -gingerol behandling var forholdsvis højere i nærvær af PMA (fig. 6A).

(A) natten over dyrket SW-480-celler blev forbehandlet med inhibitorer ( U0126, SP600125, SB203580 for ERK1 /2-, JNK og p38 MAP-kinaser, henholdsvis eller SN50 for NF-kappaB) i 1 time og derefter behandlet med [6] -gingerol i 2 timer, efterfulgt af udsættelse for PMA i 48 timer, før udførelse af cellelevedygtighed under anvendelse af MTT. Den relative levedygtighed SW-480 celler i hver behandling repræsenteret procentdel af ubehandlet kontrol. Værdierne præsenteres er gennemsnit af tredobbelte forsøg ± SD. Total lysater fra celler behandlet med en kombination af [6] -gingerol med (B) U0126 og (C) SP600125 inhibitorer og passende kontrol behandlinger var Western blottet og probet med anti-caspase-3-antistof og blots blev fremkaldt under anvendelse af ECL. Beta-actin tjente som lastning kontrol.

Næste, vi udførte de samme eksperimenter på SW-480 celler forbehandlet med hæmmere af medlemmer af MAP kinase familie og NF-kappaB. U0126 blev anvendt som en specifik inhibitor af ERK1 /2-vejen, SP600125 som en inhibitor af JNK-aktivering og SB203580 som inhibitor af p38 MAP kinase pathway.SN50 blev anvendt som en inhibitor af NF-kappaB transcription faktor. Ingen af ​​de ovennævnte inhibitorer havde nogen cytotoksisk virkning på SW-480-celler ved den testede koncentration (fig. 6A). Men, forbehandling med U0126 og SP600125 reducerede signifikant PMA-induceret proliferation af SW-480-celler i samme omfang, selv om i mindre grad i forhold til [6] -gingerol forbehandling (fig. 6A). Disse resultater viser sig væsentlige rolle ERK1 /2 og JNK MAP kinaser veje til at inducere spredning af SW-480 celler i tilstedeværelse af PMA. Forbehandling med SB203580 og SN50 havde lille indvirkning på PMA-induceret proliferation af SW-480-celler (fig. 6A), hvilket beviser den manglende inddragelse af p38 MAP-kinase-vejen og NF-kappaB transcription faktor i denne proces.

Endelig [6] -gingerol behandling blev udført på SW-480 celler forbehandlet med hver af de ovennævnte inhibitorer forud for induktion med PMA. Overraskende, i hvert tilfælde cellelevedygtigheden blev reduceret til et niveau svarende til det af forbehandling med kun [6] -gingerol før PMA-behandling. Dette resultat antyder, at i nærværelse af U0126, [6] -gingerol supplerer denne ERK1 /2-inhibitor ved ophævelse af aktiveringen af ​​JNK MAP-kinase, og i nærværelse af SP600125 det hæmmer ERK1 /2-aktivering, hvilket reducerer cellelevedygtighed til samme niveau i begge disse tilfælde. I nærværelse af SB203580 og SN50 inhibitorer [6] -gingerol udøver sine inhiberende virkninger på begge ERK1 /2-og JNK MAP kinase pathways, således bringer ned cellelevedygtigheden til samme niveau som ovenfor. Disse resultater vidner den lige bidrag fra såvel ERK1 /2-og JNK MAP kinase pathways i [6] -gingerol medieret inhibering af PMA-induceret celleproliferation af SW-480. Da der ikke er additive eller synergistiske hæmmende virkning på spredning af PMA-behandlede SW-480 celler som følge af forbehandling med kombinationen af ​​[6] -gingerol med U0126 eller SP600125 sammenlignet med forbehandling med [6] -gingerol alene , ERK1 /2 og JNK MAP-kinase-vejen synes at være de vigtigste signalveje ramt af [6] -gingerol under inhibering af PMA-induceret celleproliferation i SW-480.

for at teste om de inhibitoriske virkninger på PMA-induceret celleproliferation af SW-480-celler ved [6] -gingerol og U0126 eller SP600125 blev apoptose medieret, monitorerede vi aktiveringen af ​​caspase 3 fra hver af disse behandlinger ved Western blotting. Vi observerede spaltning af procaspase 3 i alle behandlinger, der omfatter [6] -gingerol, U0126 eller SP600125 og i kombination af [6] -gingerol og disse inhibitorer (fig. 6B og 6C). Det var også interessant at bemærke, at ingen yderligere nedbrydning af caspase 3 moderen bånd blev produceret, når inhibitorerne og gingerol blev anvendt sammen. Dette bekræfter, at nedregulering af ERK1 /2 /JNK /AP-1-vejen induceret af PMA, er ansvarlig for de inhiberende virkninger af [6] -gingerol på PMA-induceret celleproliferation i SW-480.

diskussion

anti-cancer og anti-inflammatoriske egenskaber af [6] -gingerol har været anerkendt siden lange og mange undersøgelser har rapporteret forskellige molekylære mekanismer bag disse egenskaber. De inhibitoriske virkninger af [6] -gingerol mod cancere af forskellig oprindelse blev rapporteret tidligere. [6] -gingerol har vist sig at være særligt effektive mod hudkræft og ved inhibering af angiogenese i endotelceller [28], [29]. Ingefær er et kosttilskud og en vigtig ingrediens i mange traditionelle lægemidler, er det logisk at undersøge virkningerne af [6] -gingerol på kræft i mave-tarmkanalen, såsom tyktarmskræft. Desuden de farmakokinetiske undersøgelser af de aktive komponenter af ingefær fra oralt indgivne ingefær ekstrakter menneskehandel opdaget en betydelig grad af [6] -gingerol, enten i fri eller konjugeret form, i plasma og colon væv [30], [31]. En anden undersøgelse af biotilgængeligheden af ​​[6] -gingerol i rotter foreslået, at ved oral indgivelse det detekteres ved koncentrationer på 4,3 ug /ml i plasma ved ti minutter efter indgivelse. Den samme undersøgelse bestemt også sin høje fordeling i væv med højeste koncentration i væv af mave-tarmkanalen. Vævet til plasma ratio på [6] -gingerol blev rapporteret at være 1 og blev tilskrevet sin lipofilicitet [32]. Alle disse kendsgerninger støtte en undersøgelse om anti-cancer effekter af [6] -gingerol på tyktarmskræft.

Den første årti af 21

århundrede havde et øget antal undersøgelser på karakterisere mekanismerne bag anti -cancer effekter af fytokemikalier. Undersøgelser af mekanistisk evaluering af anti-cancer egenskaber [6] -gingerol mod forskellige former for kræft forudsat værdifuld indsigt i sine mange virkningsmekanismer i at gennemføre cytotoksiske eller pro-apoptotiske virkninger i cancerceller. Nogle af de seneste rapporter om anti-cancer aktiviteter [6] -gingerol mod tyktarmskræft præsenterede forskellige mekanismer for sin indsats på forskellige tyktarmskræft cellelinjer [13], [14], [15], [33]. Den foreliggende undersøgelse på SW-480 cellelinje viser

in vitro

cytotoksicitet [6] -gingerol med en IC

50 værdi på 205 mikromolær. Den tidligere undersøgelse om

in vitro

cytotoksiske virkninger af [6] -gingerol på SW-480 cellelinje rapporterede kun 17% celledød ved denne koncentration [13] .Disse forskelle i størrelsen af ​​virkningerne kan skyldes variationerne i den anvendte metode i at studere cytotoksicitet. Det er også bemærkelsesværdigt, at den samme undersøgelse rapporteret kun 13% cytotoksicitet i LoVo-celler, når de behandles med 200 mikromolær af [6] -gingerol i 72 timer, som senere blev rapporteret i en anden undersøgelse som 75% ved 50 mikromolær i samme cellelinje efter 48 timers behandling [15]. Dosis-afhængig stigning i apoptotiske celler (Annexin-V /PI positive celler) i SW-480-celler ved behandling med [6] -gingerol, op 25-folds ved 300 uM koncentration, bevist, at cytotoksiciteten hovedsagelig blev induceret ved apoptose. Tidligere undersøgelser rapporteret både cellecyklusstandsning og apoptose som virkningsmekanismen af ​​[6] -gingerol [13], [34]. To gange stigning i apoptose blev rapporteret på lignende betingelser i SW-480 ved [13], men de viste også signifikant G2 /M anholdelse i cellecyklus som reaktion på [6] -gingerol behandling. Mange tidligere rapporter foreslog, at [6] -gingerol inducerer apoptose kun på eller i nærheden af ​​300 mikromolær i cancerceller [13], [34], [35], [36] og under denne koncentration inducerer cytotoksicitet hovedsageligt af andre mekanismer. Men vi observerede fluorescerende celler i SW-480 behandlet med endnu 100 mikromolær [6] -gingerol, klart antyder tidlige apoptose begivenheder, selv ved lavere koncentrationer. Endvidere dosis-afhængig aktivering af caspaser-8,9, 3 og 7 i vores undersøgelse bekræftede yderligere apoptose som den vigtigste mekanisme for celledød i SW-480-celler behandlet med [6] -gingerol. Aktivering af caspase-9 ved [6] -gingerol bekræfter inddragelse af mitokondrie vej i [6] -gingerol-medieret apoptotis. Imidlertid spaltningen af ​​caspase-8 induceret af [6] -gingerol kan ikke i det væsentlige antyder involveringen af ​​receptor-medieret vej, som mitokondrie pathway også kunne føre til kløvning af caspase-8 til spaltning af BH3 interagerende domæner død agonist (BID ) [37]. Induktion af apoptose i SW-480, en p53-mutant coloncancercellelinie ved [6] -gingerol er særlig interessant som p53-mutant celler anses for at være mere modstandsdygtige over for standard kemoterapeutika og bestråling [13], [36]. p53-uafhængig induktion af apoptose efter [6] -gingerol blev rapporteret tidligere i bugspytkirtelkræft cellelinier, hvor ekspressionen af ​​cyclin-afhængig kinase inhibitor, p21

CIP1, blev forøget uafhængig af p53-ekspression, der fører til fald i cyclin A og