PLoS ONE: Heterogen EGFR Gene Copy Number Stigning er almindelig i kolorektal cancer og Definerer Reaktion på Anti-EGFR Therapy

Abstrakt

Anti-EGFR terapi er almindeligt anvendt til behandling af kolorektal cancer (CRC), selv om kun et undergruppe af patienter har gavn af behandlingen. Mens

KRAS

mutation forudsiger ikke-lydhørhed, positive prædiktive markører er ikke i klinisk praksis. Vi har tidligere vist, at immunhistokemi (IHC) -Guidede

EGFR

genkopitallet (GCN) analyse kan identificere CRC patienter nyder godt af anti-EGFR behandling. Her testede vi den prædiktive værdi af en sådan analyse i chemorefractory metastaserende CRC, belyst

EGFR

GCN heterogenitet inden for tumorer, og vurderet sammenhængen mellem

EGFR

GCN,

KRAS

status og anti-EGFR antistofrespons i CRC cellelinier. Den chemorefractory patient kohorte bestod af 54

KRAS

vildtype (WT) metastaserende CRC patienter.

EGFR

GCN status blev analyseret ved sølv

in situ

hybridisering ved hjælp af en cut-off værdi på 4,0

EGFR

gen kopier /celle.

KRAS

-WT og

KRAS

mutant CRC cellelinjer med forskellige

EGFR

GCN blev brugt i

in vitro

studier. De chemorefractory CRC tumorer med

EGFR

GCN stigning (≥4.0) reagerede bedre til anti-EGFR-behandling end

EGFR

GCN ( 4,0) tumorer (klinisk fordel,

P

= 0,0004, PFS, HR = 0,23, 95% CI 0,12-0,46).

EGFR

GCN talt under anvendelse af EGFR IHC vejledning var betydeligt højere end værdien fra tilfældigt udvalgte områder verificere intratumoral

EGFR

GCN heterogenitet. I CRC cellelinjer,

EGFR

GCN korreleret med EGFR. Bedste anti-EGFR respons blev set med

KRAS

-WT,

EGFR

GCN = 4 celler og dårligste svar med

KRAS

-WT,

EGFR

GCN = 2 celler. Anti-EGFR respons var forbundet med AKT og ERK1 /2 fosforylering, som effektivt blev hæmmet kun i celler med

KRAS

-WT og øget

EGFR

GCN. Afslutningsvis IHC-styret

EGFR

GCN er en lovende indikator for anti-EGFR behandling effekt i chemorefractory CRC

Henvisning:. Ålgars A, Avoranta T, Österlund P, Lintunen M, Sundström J , Jokilehto T, et al. (2014) Heterogene

EGFR

Gene Copy Number Stigning er almindelig i kolorektal cancer og Definerer Reaktion på Anti-EGFR Therapy. PLoS ONE 9 (6): e99590. doi: 10,1371 /journal.pone.0099590

Redaktør: Anthony W.I. Lo, Den kinesiske University of Hong Kong, Hongkong

Modtaget: Januar 19, 2014 Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 18 juni 2014

Copyright: © 2014 Ålgars et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Den finske Medical Foundation, Den finske Cancer Foundation, The National Graduate School of Clinical Investigations, Turku Universitetshospital EVO tilskud, The Academy of Finland, og The Kræftens Bekæmpelse af sydvestlige Finland. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Aa, ML, JS, RR og OC er opfindere i et patent relateret til dette arbejde: US 20110217296 A1 Metode til udvælgelse af patienter til behandling med en EGFR inhibitor. Alle resterende forfattere har erklæret nogen interessekonflikter. Dette ændrer ikke forfatternes overholdelse PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) signalering er almindeligt aktiveres i kolorektal cancer (CRC). EGFR-targeting monoklonale antistoffer (mAb) er blevet en standard behandlingsmulighed, især i chemorefractory fase af metastatisk sygdom [1].

KRAS,

en signalmolekyle nedstrøms for EGFR, muteres hos ca. 40% af CRCs [1], og disse aktiverende mutationer formidle anti-EGFR behandling resistens [2]. I

KRAS

vildtype (WT) tumorer, er objektivt respons opnås i hver tredje patient indikerer, at andre faktorer bidrager til medikamenteffektivitet [3]. Således er der er et presserende behov for nye prædiktive markører.

EGFR

genkopitallet (GCN) stigning har været knyttet til anti-EGFR behandlingsrespons. De fleste undersøgelser har vist en sammenhæng mellem GCN niveau og klinisk fordel, progressionsfri overlevelse (PFS), og i nogle tilfælde, med samlet overlevelse (OS) [4] – [6]. Men

EGFR

GCN er i øjeblikket ikke udnyttes i den kliniske kontekst på grund af tekniske hindringer og betydelig variation mellem de pointsystemer [7]. Vi har for nylig rapporteret en roman algoritme, som kan forbedre den prædiktive værdi af

EGFR

GCN. Vi først viste, at

EGFR

GCN som analyseret af sølv

in situ

hybridisering (SISH) positivt korreleret med immunhistokemisk (IHC), da evalueringen blev udført fra tumor områder af højeste farvningsintensitet [ ,,,0],8]. Vi endvidere vist, at en øget

EGFR

GCN, hjælp afskæringsværdi (≥4.0), korreleret positivt med respons på anti-EGFR-behandling i alle tre parametre analyserede: klinisk fordel, PFS og OS.

EGFR

GCN var uafhængig af

KRAS

status, og når de to analyser blev kombineret, de forudsagde behandlingsrespons bedre end alene enten test. Den gennemsnitlige

EGFR

GCN, som analyseret ved denne metode var 5,5, og kopiere nummer stigning ≥4.0 blev set i 64% af tumorer. Den GCN Stigningen var typisk forbundet med kromosom 7 polysomy, mens højt niveau forstærkning sjældent blev set.

En årsag til variationen i offentliggjorte

EGFR

GCN resultater kan være tumor heterogenitet, som ikke har været behandlet i tidligere undersøgelser. Der er tegn på, at EGFR kan heterogent udtryk inden for de enkelte kolorektale tumorer, både på gen og protein niveau [5]. Heterogenitet kan komplicere analysen af ​​EGFR protein-ekspression og kopiere nummer ændringer og føre til dårlig test reproducerbarhed [7], [9]. Dette kan især være relevant i FISH-baseret analyse, hvor GCN optællingen ikke kan korreleres med histologi [7]. Hvis

EGFR

heterogenitet spiller en biologisk rolle, så en algoritme, hvor proteinekspression (IHC) guider

EGFR

GCN evaluering, kunne forbedre den prædiktive værdi.

Formålet med denne undersøgelse var at teste romanen

EGFR

GCN metode i en uafhængig patient kohorte og at vurdere virkningen af ​​

EGFR

GCN status med resultatet i en kombineret chemorefractory patient kohorte. I begge patientkohorter en

EGFR

stigning (≥4.0) blev vist at associere med en forbedret klinisk resultat, herunder kliniske fordele sats, PFS og OS. Sekundære mål var at belyse

EGFR

GCN heterogenitet inden for de tumorer og til at teste, om CRC cellelinjer med forskellige

EGFR

GCN, reagerer forskelligt på EGFR mAbs. Ifølge vores resultater,

EGFR

GCN er heterogen i CRC og de opnåede med IHC vejledning fra udvalgte tumor områder værdier er højere end dem opnået ved tilfældig udvælgelse. Vigtigere kun

EGFR

GCN tælles med EGFR IHC vejledning var i stand til at forudsige respons på anti-EGFR behandling. Vores

in vitro

undersøgelser understøtter vores kliniske fund, da det bedste svar på anti-EGFR behandling blev set i

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 4,0 celler og fattigste svar i

KRAS

WT,

EGFR

GCN = 2 celler.

Materialer og metoder

Patienter

den oprindelige Turku Universitetshospital opdagelse kohorte er blevet rapporteret [8]. Valideringen kohorte bestod af 31

KRAS

-WT patienter behandlet med EGFR mAbs i andet til sjette linje på Helsinki University Hospital for metastaserende CRC mellem juni 2008 og juli 2010. Udvælgelseskriterierne for denne undersøgelse blev: (I ) væv var til rådighed fra den primære tumor på diagnosetidspunktet før start af enhver behandling, (II) tumoren var

KRAS

-WT, (III) patienterne modtog anden- til sjette linie behandling med cetuximab eller panitumumab med eller uden kemoterapi, og (IV) patienterne havde ingen anden malignitet i deres historie. Den histologi af hver validering kohorte sagen blev revurderet af en ekspert i GI-patologi (AR).

Den kombinerede kohorte af chemorefractory patienter omfattede 54 patienter, 25 fra den oprindelige Turku kohorte og 29 fra Helsinki validering sæt. Den chemorefractory patient kohorte omfattede patienter i behandling med anti-EGFR mAbs i tredje linje eller mere, enten som enkelt terapi eller i kombination med irinotecan +/- fluoropyrimidin. Vigtige kendetegn for alle tre kohorter er beskrevet i tabel 1.

reaktion på anti-EGFR behandling blev vurderet ved computertomografi (CT) eller magnetisk resonans imaging (MRI) i henhold til respons evalueringskriterier i solide tumorer (RECIST version 1.1) [10]. Kliniske fordele blev anset partielt respons (PR) eller mindst 3 måneder af stabil sygdom (SD). Progressionsfri overlevelse (PFS) blev beregnet fra påbegyndelsen af ​​anti-EGFR indtil sygdomsprogression. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet fra starten af ​​anti-EGFR-terapi indtil døden af ​​enhver årsag.

Etik Statement

Undersøgelsen blev gennemført i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. De kliniske data blev hentet og histologiske prøver indsamlet og analyseret med godkendelsen af ​​den nationale myndighed for retsmedicinske anliggender samt Institutional Review Board i Hospital District of Southwest Finland og Etisk Review Board på Helsinki University Hospital. Skriftlig eller mundtlig informeret samtykke blev ikke opnået som følge af, at en stor del af patienterne i denne retrospektiv undersøgelse var døde af deres sygdom. Behovet for informeret samtykke fra deltagerne blev frafaldet af den nationale myndighed for Medico-Retsudvalget.

IHC og SISH- Procedurer

KRAS

mutation analyse blev udført med DxS KRAS mutation kit (DxS Ltd., Manchester, UK). Detaljerede metoder til EGFR IHC og

EGFR

GCN er blevet beskrevet [8]. Kort fortalt blev tre um snit først farvet med EGFR (klon 5B7) mAb (Ventana Medical Systems /Roche Diagnostics, Tucson AZ, USA). Farvninger blev udført med BenchMark XT (Ventana /Roche) ved hjælp af

ultra

VIEW Universal DAB Detection Kit (Ventana /Roche).

EGFR

genet blev opdaget fra efterfølgende fem um sektioner med

EGFR

DNA Probe (Ventana /Roche) og

ultra

VIEW SISH Detection Kit (Ventana /Roche). I hver tumor,

EGFR

GCN fyrretyve tumorceller blev analyseret ved hjælp af en 40x mål ved to observatører (ML, JS) fra områder højeste IHC reaktivitet. Efterforskerne blev blindet af det kliniske oplysninger. For at evaluere den gennemsnitlige

EGFR

GCN inden for hver tumor, fem tumor områder blev vilkårligt valgt. Fra hver af disse områder,

EGFR

GCN af 20 tilfældigt udvalgte kræftceller blev talt med to observatører (TA, JS). Resultaterne blev rapporteret som middelværdi og interval inden for hvert område.

cellelinjer, vestlige Blotting og cytotoksicitet Analyser

C2BBe1, SK-CO-1 og NCI-H747-cellelinjer blev købt fra ATCC (Manassas, VA, USA) og CW-2-cellelinje fra Riken Bioressource center (Tsukuba, Japan). NCI-H747 og CW-2-celler blev dyrket i RPMI-1640, SK-CO-1-celler i EMEM og C2BBe1 celler i DMEM suppleret med 0,01 mg /ml humant transferrin (Sigma, St. Louis, MO, USA). Alle medier blev suppleret med 10% FBS, 2 mM glutamin og 1% penicillin /streptomycin.

I signalvejen analyse celler blev dyrket på 6-brønds-plader og fik lov til at fæstne i 12 timer i normalt medium. Derefter blev de ændret til medium med 1% FBS og givet 0-200 ug /ml cetuximab (Erbitux, Merck Serono) i 24 timer. 25 mg /ml EGF blev givet til cellerne i fem minutter før lysis.

Proteinniveauer blev analyseret ved Western blotting af celler lyseret i RIPA-buffer (50 mM Tris-HCI, 150 mM NaCl, 1% Nonidet P -40, 0,5% deoxycholat, 0,1% SDS, 1 mM orthovanadat, og inhibitor blanding protease, pH 7,4). Proteiner blev adskilt ved SDS-PAGE og overført til nitrocellulosemembraner. Efter inkubation natten over i + 4C ° med primært antistof [anti-EGFR (D38B1, Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA), phospho-EGFR (Tyr1173, 53A5, Cell Signaling Technology), ERK2 (K-23, Santa Cruz Biotechnology , Dallas, TX, USA), phospho- ERK1 /2 (Thr202 /Tyr204, D13.14.4E, cellesignalering Technology), phospho-AKT (Ser 473), panAKT (C67E7, Cell signaling Technology)], blev membranerne inkuberet i 1 time ved stuetemperatur med peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (Dako, Glostrup, Danmark) og signalerne blev påvist med SuperSignal West Pico kemiluminescerende substrat (Thermo Scientific, Waltham, MA, USA). Anti-α-tubulin mAb (B-1-5-1-2, Sigma) eller HRP-konjugeret anti-GAPDH-mAb (mAbcam 9484, Abcam, Cambridge, UK) blev anvendt som en loading kontrol.

for cellelevedygtighedsassays, 5000 celler /brønd blev udpladet på plader med 96 brønde. Efter inkubation natten over i nærvær af 2% FBS, blev cellerne eksponeret for 0-200 ug /ml cetuximab (Erbitux, Merck Serono) eller panitumumab (Vectibix, Amgen) i 72 timer i medium suppleret med 1% FBS. Hver behandling blev udført tre gange, og forsøget blev gentaget fire gange. Cellelevedygtighed blev vurderet med CellTiter 96 Aqueous One Solution celleproliferationsassay (Promega, Madison, WI, USA). Cellen levedygtighed gives som procentdel af kontrol celler.

Statistisk analyse

Statistiske analyser blev udført med SAS 9.2 og Enterprise Guide 4.2 programmer (SAS Institute Inc., Cary, NC). Hyppighed tabeldata blev analyseret med χ2-test eller Fishers eksakte test. Forskellen i

EGFR

GCN værdier opnået ved forskellige evalueringsmetoder (normalfordelte variabler) blev beregnet med de studerende t-test. Kaplan-Meier og log-rank test samt Cox proportionel risiko regressions model blev brugt til univariate overlevelse analyse. Alle statistiske tests var to-sidet.

P

-værdier 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant. Den statistiske signifikans for cellelevedygtighedsassays blev beregnet med Microsoft Excel 2011 og StatPlus: mac LE (Version 2009 AnalystSoft Inc.). Betydningen mellem forskellene i svarene i cellelinjer blev bestemt med to-vejs ANOVA efterfulgt af flere t-tests.

Resultater

EGFR

GCN Testvalidering med en uafhængig patient kohorte

for at validere vores tidligere resultater på sammenhængen mellem

EGFR

GCN og anti-EGFR behandlingsrespons, vi studerede en uafhængig patient kohorte behandlet på Helsinki University Hospital. Metoderne til

EGFR

GCN afsløring og cut-off værdi for GCN stigning var identiske med opdagelsen undersøgelse [8]. I valideringen kohorte, 18 ud af 31 (58%) tumorer havde en

EGFR

GCN over cut-off værdi (≥4.0), sammenlignet med 64% i den oprindelige opdagelse sæt. Fjorten (78%) af den høje

EGFR

GCN (≥4.0)

KRAS-

WT patienter viste klinisk fordel [partielt respons (PR) + stabil sygdom (SD)] fra anti-EGFR terapi, mens kun 4 (31%) af lav

EGFR

GCN ( 4,0) nydt godt af behandlingen (Chi-square test,

P

= 0,009). En forhøjet

EGFR

GCN forbundet betydeligt med forbedret overlevelse. Den mediane PFS tid

EGFR

GCN≥4.0 var 25 uger sammenlignet med kun 11 uger af

EGFR

GCN 4,0 patienter (Log-Rank test,

P

= 0,002, Cox test,

P

= 0,003, HR = 0,28, 95% CI 0,12-0,65; figur 1a). Desuden

EGFR

GCN≥4.0 forbundet betydeligt med forbedret OS (median 12,1 versus 8,2 måneder; Log-Rank test,

P

= 0,004; Cox test,

P

= 0,006, HR = 0,32, 95% CI 0,14-0,72;. figur 1b)

progressionsfri overlevelse (a) og samlet overlevelse (b) af testen validering kohorten efter

EGFR

genkopital. Progressionsfri overlevelse (c) og samlet overlevelse (d) i den kombinerede chemorefractory patient kohorte.

Sammenhæng mellem

EGFR

GCN og behandlingsrespons i Chemorefractory Patienter

Vi kombinerede den chemorefractory

KRAS

WT patienter fra begge kohorter (

n

= 54) for yderligere statistiske analyser. Firs procent (28 ud af 35) af patienterne med en høj

EGFR

GCN (≥4.0) opnået klinisk fordel. I modsætning hertil den kliniske fordel lå kun 32% (6 ud af 19) for patienterne med en lav

EGFR

GCN ( 4,0) (Chi-Square test,

P

= 0,0004).

Vi analyserede særskilt de 31 chemorefractory patienter behandlet med cetuximab (57%) og 21 med panitumumab (39%). To patienter blev behandlet med både anti-EGFR-antistoffer sekventielt og derfor udelukket fra analysen. Den kliniske dagpengesats i patienter behandlet med cetuximab +/- cytotoksisk behandling med en høj

EGFR

GCN i deres primære tumorer var 86% (18/21) sammenlignet med 20% (2/10) i gruppe af patienter med en

EGFR

GCN 4,0 (Fishers eksakte test,

P

= 0,0007). I patientgruppen behandlet med panitumumab +/- var cytotoksisk behandling klinisk fordel 67% (8/12) hos patienter med en høj

EGFR

GCN og 44% (4/9) i dem med en lav

EGFR

GCN. Resultaterne præsenteres mere detaljeret i tabel S1.

Øget

EGFR

GCN Associates med Forbedret PFS og OS i Chemorefractory Disease

Den mediane PFS for chemorefractory patient kohorte var signifikant længere i

EGFR

GCN≥4.0 patienter end i

EGFR

GCN 4,0 patienter; . 29.5

vs

10,8 uger (Log-Rank test,

P

0,0001, Cox test,

P

0,0001, HR = 0,23, 95% CI 0,12 -0,46). Den mediane OS tid for patienter med

EGFR

GCN≥4.0 tumorer var 12,5 måneder sammenlignet med 7,2 måneder for dem med

EGFR

GCN under cut-off værdi (Log-Rank test,

P

= 0,0002, Cox test,

P

= 0,0003, HR = 0,32, 95% CI 0,17-0,59). Kaplan-Meier-overlevelseskurver er vist i figur 1 c-d.

PFS forblev længere i patienter med en høj

EGFR

GCN uanset hvilket anti-EGFR mAb blev anvendt. I patienter behandlet med cetuximab +/- cytotoksisk behandling var den mediane OS tid statistisk signifikant længere i kohorte af patienter med en

EGFR

GCN≥4.0 i forhold til dem med en

EGFR

GCN under 4,0 (12,5

vs

4,6 måneder. Log-Rank test

P

= 0,0006; Cox test

P

= 0,001, HR 0,25, 95% CI 0,10-0,58 ), mens ingen statistisk signifikant OS forskel blev set hos patienter behandlet med panitumumab. Resultaterne er vist i tabel S1.

overlevelsesdata fra den oprindelige discovery-, den uafhængige validation-, og kombinerede chemorefractory patientkohorter sammenlignes i figur 2.

hazard ratio og tillid intervaller på den oprindelige opdagelse, validering og kombinerede chemorefractory patientkohorter er vist. En høj

EGFR

GCN (IHC guidet SISH) er forbundet med en forbedret sygdom resultat i alle tre

KRAS

vildtype metastatisk kolorektal cancer patientkohorter behandlet med anti-EGFR terapi (to uafhængige kohorter og én samlet kohorte af chemorefractory patienter).

EGFR

GCN Heterogenitet inden tumorer

EGFR

GCN blev tilfældigt evalueret, uden IHC vejledning, fra alle 31 validering kohorte tumorer. Middelværdien

EGFR

GCN værdier fra tilfældigt udvalgte områder var signifikant lavere sammenlignet med den metode, hvor

EGFR

GCN blev evalueret selektivt fra områder med højeste EGFR-proteinekspression (

P

0,0001). Medianen

EGFR

GCN af disse 31 primære CRC tumorer var 4,3, da IHC vejledning blev brugt og 3,3 når analysen blev udført på en tilfældig måde. Den heterogenitet

EGFR

GCN inden for en CRC tumor prøve demonstreres i figur 3.

EGFR IHC viser heterogen farvning med intensiv membranøs reaktivitet i midten (a).

EGFR

SISH fra de intensivt farvede område viser gen klynger (b).

EGFR

SISH fra de omkringliggende områder med svag eller negativ EGFR IHC farvning viser marginalt forhøjede eller normale gen kopiantal (c-d).

Når tilfældigt valgt

EGFR

GCN værdier blev brugt til at overleve analyser (

EGFR

GCN≥4.0

vs EGFR

GCN 4,0.) blev der ikke observeret nogen statistisk signifikant forskel mellem de to grupper (PFS:

P

= 0,07, HR 0,40, 95% CI 0,15-1,08; OS:

P

= 0,22, HR = 0,58, 95% CI 0,25-1,38). Ingen signifikant forskel i anti-EGFR behandling effekt (klinisk fordel

vs.

Progressiv sygdom) blev bemærket enten (Fishers eksakte test,

P

= 0,19).

EGFR

GCN og reaktion til Anti-EGFR Abs In vitro

Vi søgte Sanger center kræft cellelinje database (https://www.sanger.ac.uk/cgi-bin/genetics/CGP /cghviewer/CghHome.cgi) for

EGFR

GCN ændringer. Et lavt niveau af

EGFR

GCN stigning (4-15 kopier /celle), typisk som følge af kromosom 7 polysomy, blev set i 18 af 39 (46%) cellelinjer. For at korrelere

EGFR

GCN og

KRAS

status med anti-EGFR mAb svar, valgte vi fire linjer til analyse. CW-2 og C2BBe1 cellelinjer er

KRAS

-WT og har to og fire kopier af

EGFR,

hhv. NCI-H747 og SK-CO-1 er begge

KRAS

mutant og har mere end fire eksemplarer (6-7) af

EGFR

.

EGFR

GCN blev bekræftet af SISH (figur 4a).

EGFR

GCN blev direkte afspejlet i EGFR-proteinekspression som vist ved Western blot-analyse (figur 4b). I cellelevedygtighedsassays,

KRAS

-WT cellelinje med

EGFR

GCN 4 (C2BBe1) var den mest følsomme over for både cetuximab og panitumumab behandling (figur 4c). Forskellen var særdeles signifikant sammenlignet med nogen af ​​de andre cellelinier (t-test,

P

0,001). Interessant,

EGFR

disomic, WT

KRAS

cellelinje (CW-2) var mest modstandsdygtige over for mAb behandling. De cellelinjer med mutant

KRAS

EGFR

GCN 4 viste mellemliggende følsomhed, især til panitumumab behandling. Resultaterne er således i overensstemmelse med vores kliniske data, der indikerer, at både

EGFR

GCN og

KRAS

status definere tumor celle respons på anti-EGFR mAbs.

(a)

EGFR

GCN SISH analyse af de forskellige cellelinjer. (B) et Western blot billede, der viser niveauerne af EGFR-protein i de forskellige cellelinier. α-tubulin blev anvendt som en kontrol for lige belastning. Cellelevedygtigheden af ​​de forskellige cellelinier med varierende koncentrationer af (c) cetuximab og (d) panitumumab. Resultaterne er givet som procent af levedygtige celler i sammenligning med de ikke-behandlede celler (middel ± SE for fem eksperimenter). (E) Western blots viser EGFR pathway signalmolekyler i de forskellige cellelinjer. Cellerne blev forbehandlet med de angivne mængder af cetuximab i 24 timer i medium indeholdende 1% FBS og givet EGF (25 ug /ml) i 5 minutter før lysis. De angivne signalmolekyler blev analyseret med Western blotting. GAPDH blev anvendt som en kontrol for lige belastning.

Vi kiggede nærmere på effekten af ​​anti-EGFR mAb behandling på intracellulær signalering i disse cellelinjer. I

KRAS

mutante cellelinier med mere end fire

EGFR

genkopier, phosphorylering af EGFR var tydeligt og effektivt blokeret af anti-EGFR-mAb (fig 4e). Anti-EGFR hæmning delvist reduceret pErk1 /2 niveauer, mens niveauet af Pakt ikke blev påvirket. I

KRAS

-WT cellelinjer med 2-4

EGFR

genkopier EGFR phosphorylering var under detektionsgrænsen (ikke vist). Men vejen var tilsyneladende operationel som angivet ved svar på nedstrøms signalering. I

EGFR

disomic linje CW-2, anti-EGFR mAb behandling reducerede pErk1 /2-niveau, men påvirkede ikke AKT-phosphorylering (Figur 4e). Kun i

EGFR

polysomic og vildtype

KRAS

C2BBe1 celler, en effektiv blokering af både ERK1 /2 og AKT-signalering, blev påvist (figur 4e). Disse resultater og dermed antyder, at både

EGFR

GCN og

KRAS

mutation status bestemme virkningen af ​​anti-EGFR mAb på EGFR nedstrøms signalering og kolorektal cancer celle overlevelse.

Diskussion

i denne undersøgelse viser vi, at heterogene

EGFR

GCN stigning er en stærk indikator for anti-EGFR behandling fordel i metastaserende CRC. Resultaterne udvide vores tidligere fund af et enkelt institut patient kohorte til en uafhængig validering kohorte. Derudover har de demonstrerer den prædiktive værdi af

EGFR

GCN for anti-EGFR terapi effekt hos chemorefractory CRC patienter, det vigtigste patientgruppe berettiget til denne behandling. Resultaterne viser endvidere, at intratumoral

EGFR

GCN heterogenitet er almindelig i CRC. Vi hypotesen, at denne tidligere forsvundet

EGFR

heterogenitet er en grund til den rapporterede dårlig korrelation mellem

EGFR

GCN analyse og effekt af anti-EGFR-behandling, og foreslå en forbedret metode til prædiktiv

EGFR

GCN test.

patienten materiale i vores undersøgelse omfattede patienter behandlet med anti-EGFR-behandling både i en tidlig og chemorefractory fase af metastatisk CRC terapi. For at kontrollere for de forstyrrende effekter af kemoterapi følsomhed, når det kombineres med anti-EGFR mAbs på vores resultater, den prædiktive værdi af

EGFR

GCN om anti-EGFR behandling respons blev vurderet separat i undergruppen af ​​patienter behandlet på en chemorefractory fase (tredje linje eller mere). De opnåede i chemorefractory undergruppe resultater svarede til resultaterne af hele patientens kohorte, hvilket understøtter vores fortolkning, at en høj

EGFR

GCN er faktisk en indikator for gunstig anti-EGFR behandling respons.

Både cetuximab og panitumumab i chemorefractory patient undergruppe viste forbedrede PFS i

EGFR

GCN≥4.0 patienter. Samlet overlevelse og sygdomskontrolrate blev statistisk forbedret for cetuximab kohorte, og numerisk, men ikke statistisk i den lille panitumumab kohorte. De to terapeutiske Ab’er er af forskellig type, panitumumab er et fuldt humant mAb, hvorimod cetuximab er en mus-human-kimære.

In vitro

assay viste identisk cytotoksicitet for de testede CRC linjer, men

in vivo

, andre mekanismer, herunder antistof-afhængig cytotoksicitet (ADCC) kan være i drift. I denne henseende kan cetuximab og panitumumab være anderledes, og derfor øget

EGFR

GCN kunne bedre indikere følsomhed over for cetuximab behandling [11]. Ifølge prækliniske og kliniske data visse cytotoksiske behandlinger +/- immunmodulerende midler, herunder f.eks Den Gilf (gemcitabin, irinotecan, levofolinic, og 5-fluorouracil), GILFI (gemcitabin, irinotecan, levofolinic syre, fluorouracil, aldesleukin), og GOLFIG (gemcitabin, oxaliplatin, levofolinat, 5-fluorouracil, GM-CSF, aldesleukin) regimer, har evnen til effektivt at opregulere EGFR på tyktarmskræft celler, og dermed forbedre følsomheden af ​​tyktarmskræft celler til cetuximab-medieret ADCC [12] – [14]. I vores undersøgelse blev panitumumab anvendt som single terapi oftere end cetuximab, 42,9

vs

6,5% henholdsvis, som i hvert fald delvis kan forklare forskellen observeret i effektresultaterne mellem de to antistoffer. Begge antistoffer, når de ikke administreres som eneste behandling, blev kombineret med irinotecan baseret kemoterapi. I vores undersøgelse blev oxaliplatin eller enkelt capecitabin ikke kombineres til anti-EGFR-behandling i chemorefractory fase af sygdommen. To patienter fik cetuximab og panitumumab sekventielt og derfor udelukket fra dette studie. Derfor hverken kombinationen cytotoksiske lægemiddel eller administration af begge antistoffer sekventielt, forklarer forskellen i de opnåede resultater med de forskellige anti-EGFR-antistoffer. Alternativt kan vores resultat afspejler en forskel mellem behandlede patienter. Cetuximab blev mere almindeligt anvendt i opdagelsen kohorte, som defineret testen afskæringsværdi, og panitumumab i valideringen kohorten med kun chemorefractory patienter. Da begge kohorter var retrospektiv, kan vi ikke udelukke forskelle i patientgrupper, der kunne tegne sig for forskelle i behandlingsresultater.

Tumor heterogenitet er blevet foreslået at bidrage til vanskeligheder i validering af onkologiske biomarkører [15] . I det foreliggende arbejde, middelværdien

EGFR

GCN-værdier var signifikant lavere ved analyse på en tilfældig måde i forhold til de værdier, der opnås ved at vælge cellerne med den højeste GCN. Kun sidstnævnte metode var i stand til at skelne patienter i henhold til deres anti-EGFR behandlingsrespons. Dette understøtter det synspunkt, at terapeutiske beslutningsproces baseret på scorer det dominerende fænotype kan være vildledende [15]. Selv en mindre procentdel af mutant alleler og genekspressionsprofiler kan være afgørende for behandling respons [16].

EGFR

GCN heterogenitet er en veletableret fænomen i gliomer [17]. Selvom

EGFR

GCN heterogenitet i CRC kan være blevet identificeret tidligere, er dette fund er generelt bort, og ikke anvendes som et parameter i diagnostiske analyser. I nogle henseender, sammenhængen mellem

EGFR

GCN og behandlingsrespons ligner resultaterne af en anden EGFR familiemedlem,

Her2,

i mavekræft.

Her2

forstærkes eller overudtrykt i 7-34% af gastrisk kræft [18]. I modsætning til i brystcancer, Her2 ekspression i gastrisk cancer shows markeret intratumoral heterogenitet, og derfor diagnostisk test fortolkning afviger fra brystcancer [19]. De nuværende prædiktive diagnostik for trastuzumab behandling i mavekræft er baseret på en kombination af Her2 IHC og

Her2

GCN analyse af områder med størst IHC farvning. I biopsier kan sådanne områder dækker kun 5% af tumoren [19]. Selv om der er paralleller, Her2-mavekræft algoritme adskiller sig fra

EGFR

GCN i CRC. I mavekræft, er cut-off værdi baseret på gen til kromosom-forholdet ≥2.0, selv om de seneste anbefalinger tyder på, at

Her2

GCN 6.0 kan betragtes som positiv. I CRC,

EGFR

GCN stigning er typisk et resultat af kromosom 7 polysomy og derfor genet til kromosom-forholdet er ikke informativ. På den anden side kromosom 17 er sjældent polyploid i gastrisk kræft, hvilket indikerer en anden biologisk mekanisme for

EGFR

Her2

stigning.

Tumor heterogenitet er blevet foreslået at ligge til grund modstandsdygtighed over for målrettede kræftlægemidler [15]. I denne henseende, konstateringen af, at en mindre bestand af

EGFR

GCN høje celler definerer behandlingsrespons er uventet.