PLoS ONE: inflammatoriske cytokiner og Survival Faktorer fra Serum Modulate Tweak-induceret apoptose i PC-3 prostatakræft Cells

Abstrakt

Tumor nekrose faktor-lignende svag inducer af apoptose (TWEAK, TNFSF12) er medlem af tumornekrosefaktor superfamilien. TWEAK aktiverer FN14 receptoren, og kan regulere celledød, overlevelse og proliferation i tumorceller. Men der er lidt information om funktion og regulering af dette system i prostatakræft. FN14 Ekspressions- og nappe handlinger blev undersøgt i to human prostatacancer-cellelinier, androgen-uafhængige PC-3-cellelinjen og androgensensitive LNCaP-celler. Endvidere blev ekspressionen af ​​FN14 analyseret i humane biopsier af prostatacancer. FN14 ekspression er forøget i histologiske snit af human prostata-adenocarcinom. Både prostata cancercellelinier udtrykker konstitutivt FN14, men, androgen-uafhængig cellelinie PC-3 viste højere niveauer af FN14 at LNCaP-celler. FN14-ekspression blev opreguleret i PC-3 humane prostatacancerceller i nærværelse af inflammatoriske cytokiner (TNFa /IFNy) samt i nærvær af bovint føtalt serum. Nappe induceret apoptotisk celledød i PC-3-celler, men ikke i LNCaP-celler. Desuden er der i PC-3 celler, co-stimulation med TNF /IFNy /TWEAK inducerede en højere apoptose. Men nappe eller TWEAK /TNF /IFNy ikke inducere apoptose i tilstedeværelse af føtalt serum. Nappe induceret celledød gennem aktivering af FN14 receptoren. Apoptose var forbundet med aktivering af caspase-3, frigivelse af mitokondrie cytochrom C og en forøget Bax /BclxL ratio. TWEAK /FN14-aktivering fremmer apoptose i androgen-uafhængige PC-3 celler under visse dyrkningsbetingelser. Yderligere karakterisering af det terapeutiske mål potentiale TWEAK /FN14 til human prostatacancer, berettiget

Henvisning:. Sanz AB, Sanchez-Niño MD, Carrasco S, Manzarbeitia F, Ruiz-Andres O, Selgas R, et al . (2012) inflammatoriske cytokiner og Survival Faktorer fra Serum Modulate Tweak-induceret apoptose i PC-3 prostatacancerceller. PLoS ONE 7 (10): e47440. doi: 10,1371 /journal.pone.0047440

Redaktør: Daniel Sanchis, Universitat de Lleida – IRBLLEIDA, Spanien

Modtaget: Juni 20, 2012; Accepteret: September 17, 2012; Udgivet: 15 oktober, 2012 |

Copyright: © Sanz et al. . Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering: yde støtte fra Fondo de Investigacion Sanitaria (FIS) PS09 /00447, Instituto de Salud Carlos III-Redes Temáticas de Investigación Cooperativa en Salud (ISCIII-Retic) REDinREN /RD06 /0016. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Prostatacancer er den næststørste årsag til kræft dødsfald hos mænd [1]. De fleste tilfælde af prostatacancer stede som lokaliseret sygdom og kan hærdes med kirurgi og strålebehandling. Men som det er tilfældet med de fleste faste maligniteter, udvikling af metastatisk sygdom er i sidste ende døden. Trods aktive systemiske behandlinger, vil det metastatiske fænotype køre i udvikling af resistens og sygdomsprogression. Desuden systemiske behandlinger i prostatacancer er begrænsede. Indtil for nylig var der kun tre FDA-godkendte kemoterapeutiske midler til anvendelse i kastrationsniveau-resistent prostatacancer (estramustin, mitoxantron, og docetaxel), og yderligere to agenter blev godkendt i 2010 (sipuleucel-T og cabazitaxel [2]. Der er dog stadig et klart behov for at udvikle yderligere systemiske behandlinger. væksten i normale prostata epitelceller er under stram styring af forskellige vækstfaktorer, især androgener, kastration fører til apoptose af denne celle population. Androgen-udtømning har en lignende effekt på prostatakræft . Men følgende umiddelbare regression tumorer ofte vender tilbage i en androgen-depletion uafhængig form, der er ofte dødelig. det er således af særlig interesse for at søge efter agenter i stand til at dræbe androgen-uafhængige prostatacancerceller.

Tumor nekrose faktor (TNF) blev oprindeligt beskrevet som en faktor giftig for tumorer [3], [4]. det blev senere vist at tilhøre den TNF superfamilien (TNFSF) af cytokiner [5], [6]. Mange TNFSF cytokiner regulerer celledød og proliferation samt inflammation og kan spille en rolle i tumor biologi, herunder prostatacancer biologi [7] – [9]. Som et eksempel, har de seneste opmærksomhed fokuseret på antitumoraktiviteten af ​​TNF-relateret apoptoseinducerende ligand (TRAIL) [10], [11]. Men in vivo prostatakræft udtrykker osteoprotegerin, en lokkedue receptor for både TRAIL og aktivator af nuklear faktor-KB ligand (RANKL) [12]. TNFSF cytokiner aktiverer en familie af receptorer (TNFRSF), hvoraf mange bærer en dødsdomænet (DD) og fungerer som dødsreceptorer. Aktivering af dødsreceptorer i tumorceller ved cytotoksiske immunceller er den vigtigste mekanisme, hvor immunsystemet eliminerer maligne celler [13].

Tumor nekrose faktor-lignende svag inducer af apoptose (TWEAK, Apo3L, TNFSF12) er en af ​​de seneste medlemmer af TNFSF at identificere [14], [15]. TWEAK blev oprindeligt beskrevet som en inducer af apoptose i tumorceller. Desuden kan justere regulere celleproliferation, celledød, cellemigration, celledifferentiering, vævsregenerering, neoangiogenese og inflammation [16] – [24]. TWEAK aktiverer en enkelt receptor, fibroblastvækstfaktor-inducerbar-14 (FN14, nappe receptor, TNFRSF12A, CD266). TWEAK aktivering af FN14 receptoren resulterer i apoptotisk celledød af flere tumorcellelinier [22], [25] – [29]. Faktisk et fase I klinisk forsøg med et humaniseret anti-TWEAK receptor monoklonalt antistof hos forsøgspersoner med fremskredne solide tumorer blev for nylig afsluttet [30]. Men TWEAK-FN14 opregulerer, VEGF udtryk for at fremme æggestokkene kræftcelle metastaser [31] og fremmer brystkræft celle invasiv kapacitet [32]. Der er beviser for, at de forskellige, selv imod, handlinger TWEAK kunne bestemmes af mikromiljø. I denne henseende TWEAK inducerer apoptose i tubulære celler i en pro-inflammatorisk miljø, mens det fremmer proliferation i nærvær af bovint føtalt serum [33], [34]. Prostatacancerceller er blevet vist at udtrykke FN14 og høj ekspression af FN14 var signifikant associeret med højere prostataspecifikt antigen tilbagefald hos patienter, som gennemgik radikal prostatektomi [35]. FN14 blev højt udtrykt i androgen-uafhængig prostatacancer-cellelinier, DU145 og PC-3, hvorimod ekspression var svag i androgen-sensitive LNCaP-celler. En rolle for FN14 i migration, invasion og spredning blev beskrevet i PC-3 celler [35].

Vi har nu undersøge manipulation af cellekultur betingelser som en potentiel værktøj til at dreje TWEAK /FN14 system mod den svulst. Vi rapporterer, at de inflammatoriske cytokiner og overlevelse faktor fra serum modulere respons PC-3 celler til at nappe. I fravær af serum TWEAK /FN14-aktivering fremmer apoptose i androgen-uafhængige PC-3-celler, men ikke i androgen-sensitive LNCaP-celler. En bedre forståelse af denne forordning kan vise en potentiel fordel af tumorceller i en terapeutisk mulighed.

Prostata adenocarcinom Gleason score 7 (3 + 4). Original forstørrelse × 200. FN14 farvningen er meget positiv i grad 3 adenocarcinom (sorte pile) og mildt positive i en høj kvalitet PIN fokus (hvid pil). Ingen eller ringe farvning er observeret i normal kirtel (pilespidser). B) Detalje af adenocarcinomceller fra samme biopsi. Original forstørrelse × 400. C) prostataadenocarcinom Gleason score 6 (3 + 3). Mild FN14 farvning i high-grade kvalitet PIN fokus (hvid pil), mens normalt væv er negativ (pilespids). Original forstørrelse × 200. D) FN14 farvningen er meget positiv i grad 3 adenocarcinom (sorte pile), mens normalt væv er negative (pilespidser). Original forstørrelse × 200

Metoder

Celler og reagenser

To humane prostatakræft-cellelinier blev anvendt:. Androgen-uafhængige PC-3-cellelinje og androgen -følsom LNCaP-celler (ATCC, Rockville, MD, CRL 1435 og 1740, henholdsvis) [36], [37]. Celler blev dyrket i RPMI 1640 med 10% føtalt bovint serum (FBS), 2 mM glutamin og antibiotika (100 U /ml penicillin og 100 ug /ml streptomycin), i 5% CO2 ved 37 ° C. RPMI-1640, penicillin, streptomycin og trypsin-EDTA var fra BioWhittaker (Waltham, MA) og FBS fra Gibco (Carlsbad, CA). Til forsøg blev celler serum-depleteret i 24 timer og derefter behandlet med forskellige stimuli. Som blev anvendt positiv kontrol med FN14 ekspression humant proksimal tubulær epithelial (HK-2) celler (ATCC, CRL 2190) [38].

A) Analyse af FN14 og TWEAK mRNA-ekspression ved kvantitativ RT-PCR. Middel (± SEM) af tre uafhængige forsøg; * P 0,05 vs LNCaP-celler. B) Analyse af FN14-proteinekspression ved western blot i humane prostatacancerceller dyrket med eller uden 10% FBS i 24 timer. Middel (± SEM) af tre uafhængige forsøg * p. 0,02 vs LNCaP-celler.

† p 0,05 vs 0% FBS PC-3 celler. HK2 celler er vist som positiv kontrol. C) Analyse af celleoverfladeekspression af FN14 ved flowcytometri. Repræsentativt eksperiment. Celler blev farvet med en isotype-matchet antistof (hvidt område) eller anti-FN14-antistof (sort område).

Rekombinant humant TWEAK (Millipore, Billerica, MA), medmindre andet er angivet, blev anvendt ved 100 ng /mL. ITEM-2 neutraliserende anti-FN14-antistof (eBioscience, San Diego, CA), neutraliserende anti-TWEAK antistof (BioLegend, San Diego, CA) og neutraliserende anti-TNF-antistof (BioLegend) blev tilsat 1 time før stimuli. Human TNFa (PrePotech, London, UK) ved 30 ng /ml, og humant interferon-γ (IFNy) (PrePotech) 30 U /ml, blev anvendt i nogle forsøg. Alle disse koncentrationer er baseret på forudgående dosis-respons undersøgelser i vores laboratorium [33], [34]. Benzyloxycarbonyl-Val-Ala-DL-Asp-fluoromethylketone (zVAD-fmk) (Calbiochem, San Diego, CA, USA) blev opløst i DMSO og tilsat 1 time før stimuli. Slutkoncentrationen af ​​DMSO i kulturen ikke modulere celledød. Bax inhibitor peptid, P5, blev opløst i vand og blev tilsat 1 time før stimuli (Tocris, Bristol, UK) [38].

PC3 og LNCaP-celler blev stimuleret med 100 ng /mL TWEAK for det angivne point og FN14 og MCP-1 mRNA-niveauer blev målt ved RT-PCR. Begge cellelinier reagerer på tweak, men, PC-3 respons er mere vedholdende i forhold til LNCaP celler. Mean (± SEM) af tre uafhængige forsøg * p. . 0,05 vs kontrol

Cell Surface FN14 Expression

Celler blev udpladet med en tæthed på 8 x 10

4 celler i tolv brønde. Efter stimulering blev de fritliggende med 2 mM EDTA /1% BSA i PBS, vasket og resuspenderet i PBS /1% BSA og blokeret i 4 min. Derefter blev celler inkuberet med 1 ug /ml anti-FN14 ITEM4 antistof (eBioscience, San Diego, CA) eller et isotype-matchet kontrol antistof i 30 minutter på is. Celler blev vasket to gange, blokeret i 4 min og inkuberet med Alexa488-mærket gede-anti-muse-IgG-antistof (1/300, Invitrogen, Carlsbad, CA) i 45 minutter på is i mørke. Efter to yderligere vaske med PBS /1% BSA blev cellerne resuspenderet i 1% paraformaldehyd filtreret i PBS og analyseret ved flowcytometri under anvendelse BD CellQuest Software (BD Biosciences, San Jose, CA) [39].

PC -3 prostatacancerceller dyrket med 0% eller 5% FBS i 3 eller 24 timer. FN14-mRNA-ekspression blev målt ved kvantitativ RT-PCR (A) og FN14 proteinekspression blev undersøgt ved Western blot (B). Mean (± SEM) af fire uafhængige forsøg. * P 0,03 versus 0% FBS 3h; # P 0,003 vs 0% FBS 24 timer. C, D) Analyse af FN14-mRNA-ekspression (C), og FN14 proteinekspression (D) i PC-3-celler behandlet med TNFa (30 ng /mL) /IFNy (30 U /ml) i 3 eller 24 timer. Mean (± SEM.) I fire uafhængige forsøg. # P 0,03 vs kontrol 24 timer. E) Repræsentant Western blot af FN14 i PC-3 celler dyrket med 0% FBS, 5% FBS eller TNF /IFNy i 3 og 24 timer.

RNA Extraction og Real-Time Polymerase Chain Reaction

Totalt RNA blev ekstraheret fra celler ved TRI Reagent metoden (Sigma) og 1 ug RNA blev revers transkriberet med høj kapacitet cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA). Pre-udviklede primer og probe assays for FN14, og GAPDH (human) var fra Applied (Applied Biosystems). Kvantitativ PCR blev udført af 7500 Real Time PCR System med Prism 7000 System SDS Software (Applied Biosystems) og RNA udtryk for forskellige gener blev korrigeret for GAPDH [40].

Cell død blev vurderet ved flowcytometri af DNA tilfreds. Hypodiploid celler blev anset apoptotiske. A) PC-3-celler, dyrket med eller uden 10% FBS, blev stimuleret med TWEAK (100 ng /ml) alene eller i nærvær af TNFa (30 ng /mL) /IFNy (30 U /ml) i 24 timer. Middel (± SD) af fire uafhængige forsøg. * P 0,002 vs kontrol; # P 0,001 vs TWEAK alene; † p 0,002 vs 0% FBS med stimuli. B) LNCaP-celler, dyrket uden FBS, blev stimuleret med TWEAK alene eller i kombination med TNFa /IFNy i 24 timer. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. C) TWEAK, alene eller i kombination med TNFa /IFNy, inducerer apoptose i PC-3-celler på en dosis-afhængig måde. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,002 vs kontrol; # P 0,0001 over for kontrol. D) Tidsforløb af TWEAK-induceret apoptose i PC-3-celler alene eller i kombination med TNFa /IFNy. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,002 vs kontrol; # P 0,0001 over for kontrol

Western Blot

Celleprøver blev homogeniseret i lyseringspuffer (50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA, 2 mM EGTA, 0,2%. Triton X-100, 0,3% NP-40, 0,1 mM PMSF og 1 ug /ml pepstatin A) og derefter separeret ved 12% SDS-PAGE under reducerende betingelser. Efter elektroforese blev prøver overført til PVDF-membraner (Millipore), blokeret med 5% skummetmælk i PBS /0,5% vol /vol Tween 20 i 1 time, vasket med PBS /Tween og inkuberet med kanin polyklonalt anti-FN14 (1: 1000, Cell Signaling, Danvers, MA), muse monoklonalt anti-BclxL (1:500, Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA), kanin polyklonalt anti-Bax (1:500, Santa Cruz Biotechnology), eller kanin-polyklonalt anti- spaltet aktiv caspase 3 (1:500, Cell Signaling). Anti-FN14 blev fortyndet i 5% BSA, og de andre antistoffer blev fortyndet i 5% mælk PBS /Tween. Blots blev vasket med PBS /Tween og inkuberet med passende peberrodsperoxidase-konjugeret sekundært antistof (1:2000, Amersham, Aylesbury, UK). Efter vask med PBS /Tween blots blev fremkaldt med kemiluminescensmetoden (ECL) (Amersham). Blots blev derefter probet med monoklonalt muse-anti-α-tubulin-antistof (1:2000, Sigma) og ekspressionsniveauer blev korrigeret for mindre forskelle i lastning [41].

Celledød blev vurderet ved flowcytometri af DNA tilfreds. A) PC-3-celler blev forbehandlet med anti-TWEAK neutraliserende antistof (10 ug /ml), ITEM2 anti-FN14-antistof (10 ug /ml), eller anti-TNFa-neutraliserende antistof (10 ug /ml), tilsat 1 time før TWEAK. Celledød blev vurderet efter 24 timer. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,02 vs kontrol; # P 0,0001 vs TWEAK alene. B), C) PC-3-celler blev forbehandlet med anti-TWEAK neutraliserende antistof (B) eller med ITEM2 anti-FN14-antistof (C), tilsat 1 time før TWEAK /TNFa /IFNy. Celledød blev vurderet efter 24 timer. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,02 vs kontrol; # P. 0,0001 vs TWEAK /TNFa /IFNy alene

Apoptose og celledød

10.000 celler blev podet i 12-brønds plader (Costar, Cambridge, MA) i 10% FCS RPMI natten over. I nogle tilfælde blev de hvilede i serum-frit medium i 24 time. Derefter stimuli blev tilsat til subsammenflydende celler. Apoptose var præget af morfologiske og funktionelle kriterier. Kerner af formalin-fikserede celler blev farvet med DAPI (Sigma) for at observere de typiske morfologiske ændringer, som tidligere beskrevet [33], [42]. Til vurdering af apoptose ved flowcytometri adhærente celler blev samlet med spontant løsnede celler og inkuberet i 100 ug /ml propidiumiodid (PI), 0,05% NP-40, 10 ug /ml RNAse A i PBS ved 4 ° C i 1 time. Denne analyse permeabiliserer cellerne, således PI pletter både levende og døde celler. Procentdelen af ​​apoptotiske celler med nedsat DNA-farvning (hypodiploid celler) blev talt ved flowcytometri under anvendelse BD CellQuest Software (BD Biosciences) [33], [34], [42].

Flowcytometri af DNA-indhold. Bemærk hypodiploid, apoptotiske celler (| – |) blandt dem, der blev behandlet med TWEAK, eller med TWEAK /TNF /IFNy i 24 timer. Middel (± SD) af fire forsøg * p. 0,05 vs kontrol. B) Karakteristisk skrumpet, pyknotiske, fragmenterede kerner er til stede blandt DAPI-farvet, nappe eller nappe /TNF /IFNy-behandlede celler (pile), men er sjældne blandt kontrol eller TNF /IFNy-behandlede celler. Forstørrelse x400, detalje x1000. C) PC-3-celler blev dyrket med eller uden serum og behandlet med TWEAK eller nappe /TNFa /IFNy i 24 timer. Celler blev farvning med Annexin V /PI og analyseret ved flowcytometri. Tweak stiger både tidligt (AnnexinV

+ /PI

-) og sent (Annexin V

+ /PI

+) apoptose under serum afsavn betingelser. Grafisk viser procentdel af tidlig og sen apoptose [(AnnexinV

+ /PI

-) + (AnnexinV

+ /PI

+)]. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,008 vs kontrol; # P. 0,001 vs 0% FBS med stimuli

For at kvantificere celledød blev celler resuspenderes i 100 pi PBS og farvet med 100 ug /ml PI lige før at flowcytometri. Dette assay er baseret på den kendte evne PI at indtaste i døde celler. Procentdelen af ​​døde celler (farvet med PI) og levende celler (ikke farvede celler) blev talt ved flowcytometri under anvendelse BD FACS Diva Software (BD Biosciences).

PC-3-celler blev stimuleret med TWEAK eller nappe /TNFa /IFNy, og Bax (A) og (B) BclxL proteinniveauer blev analyseret ved western blot. Middel (± SEM) af tre eksperimenter * p. 0,05 vs kontrol. C) Ratio af Bax /BclxL protein niveauer i PC-3 celler. Mean (± SEM) af tre uafhængige forsøg * p. 0,05 vs kontrol. D) PC-3-celler blev behandlet med Bax inhibitor peptid P5 ved angivne doser en time før at tilføje TWEAK /TNFa /IFNy. Celledød blev målt ved flowcytometri af DNA-indhold. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. # P 0,002 vs kontrol; * P 0,05 vs TWEAK /TNF /IFNy; ** P. 0,005 vs TWEAK /TNF /IFNy

PC-3 celler behandlet med i 24 timer viste mitokondrie cytochrom C frigivelse. Konfokal mikroskopi. Cytochrom C i rødt og DAPI i blåt. (Forstørrelse x400, detalje x1000). Pictures repræsentanter for tre eksperimenter.

Vurdering af apoptose med Annexin V-FITC

Kort fortalt 5 × 10

5-celler blev vasket med iskold PBS, resuspenderet i 100 pi bindingsbuffer, og, farvet med 2,5 pi FITC-Annexin V (Myltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Tyskland). Cellerne blev inkuberet i 15 minutter ved 37 ° C i mørke. Derefter blev 200 pi bindingsbuffer indeholdende PI (20 pg /ml) tilsat lige før flowcytometri. Cellerne blev analyseret ved anvendelse af FACS Canto cytometer og FACS Diva Software (BD Biosciences). Tidlig og sen apoptose blev vurderet på PE fluorescens (PE for PI) versus FITC fluorescens (FITC for Annexin) plots. Celler farvet med kun Annexin V blev evalueret som værende i tidlig apoptose; celler farvet med både Annexin V og PI blev vurderet som værende i sen apoptose stadium.

Inhibering af caspaser med pan-caspaseinhibitor zVAD (20 uM) forhindrede apoptose i PC-3-celler stimuleret med TWEAK /TNFa /IFNy i 24 timer. Apoptose blev vurderet ved flowcytometri af DNA-indhold. Middel (± SD) af tre eksperimenter. * P 0,002 vs kontrol; # P 0,001 vs TWEAK /TNFa /IFNy alene. B) Inkubation med TWEAK eller nappe /TNFa /IFNy resulterede i fremkomsten af ​​aktive caspase-3 fragmenter (pile, repræsentativt Western blot), c), og dette er næppe observeret i nærvær af 10% FBS. D) Aktiv caspase 3 immunofluorescens i PC-3-celler behandlet med TWEAK /TNFa /IFNy. Konfokal mikroskopi. Aktiv caspase 3 i grønt og propidiumiodid i rødt. (Forstørrelse 320x). Billeder repræsentative for tre uafhængige forsøg.

Cell død blev vurderet ved flowcytometri PI farvning. PC-3-celler behandlet med TWEAK /TNFa /IFNy i 24 timer udviste høje niveauer af celledød, og dette blev signifikant reduceret med anti-TWEAK neutraliserende antistof eller med pan-caspaseinhibitor zVAD. PI pletter sent apoptotiske og nekrotiske celler. Middel (± SD) af tre uafhængige forsøg. * P 0,005 vs kontrol; # P. 0,02 vs TWEAK /TNF /IFNy alene

Immunfarvning

Celler belagt på Labtek ™ slides blev fikseret i 4% paraformaldehyd og permeabiliseret i 0,2% Triton X-100 /PBS, vasket i PBS og inkuberet med kanin polyklonalt anti-aktiv caspase 3 (1:100, Cell Signaling) eller anti-cytochrom C (1:500, BDPharmigen) efterfulgt af Alexa-488 eller Alexa-633 konjugeret sekundært antistof henholdsvis (1 :300, Invitrogen). Kerner blev modfarvet med propidiumiodid eller DAPI henholdsvis.

Immunhistokemi

FN14 immunohistokemi blev udført i 5 biopsier fra patienter diagnosticeret med prostata adenocarcinom, alderen 65 til 77 år. Det etiske udvalg af Fundacion Jimenez Diaz godkendt undersøgelsen og informeret samtykke blev opnået fra hver emne. Den antigene epitopgenfinding blev udført i 3 um tykke sektioner af paraffinindlejret væv under anvendelse af en PTlink indretning (med en høj pH-opløsning, 95 ° C, 20 min). De væv Objektglassene blev inkuberet i 30 minutter ved stuetemperatur med det primære antistof, kanin-polyklonalt anti-FN14 (1:100, Cell Signaling). Til immunhistokemisk farvning blev anvendt EnvisionFLEX + visualisering systemet, i en DAKO Autostainerplus platform. Vævssnittene blev efterfølgende modfarvet med hematoxylin. Samme sektioner blev inkuberet uden det primære antistof som negative kontroller.

Statistik Salg

Statistisk analyse blev udført under anvendelse af SPSS 11.0 statistisk software. Resultater udtrykkes som middel ± SEM for protein- og mRNA-ekspression eksperimenter og som gennemsnit ± SD for flowcytometri eksperimenter. Betydning på p 0,05 niveau blev vurderet ved Student’st test for to grupper af data og ANOVA for tre af flere grupper

Resultater

Expression af FN14 i prostatakræft

prostataadenocarcinom biopsier viste et lignende mønster af FN14 ekspression (figur 1). FN14 udtryk var negativ i normal prostata epitel, mildt positiv i høj kvalitet prostata intraepitelialneoplasi (PIN) foci og meget positivt i prostata adenokarcinom. Dette antyder, at cellekultur observation, at prostata karcinom cellelinjer udtrykker FN14 er klinisk relevant og er overensstemmende med tidligere rapporter [35].

konstituerende FN14 og nappe Expression i Human prostatacancerceller

Første , studerede vi ekspressionen af ​​tWEAK og FN14, tweak receptoren, i to forskellige humane prostatakræft-cellelinier, PC-3 og LNCaP. PC-3 er en androgen-uafhængig cellelinje, mens LNCaP er en androgen-sensitive cellelinie. Begge cellelinier udtrykte konstitutivt FN14 på mRNA (figur 2.A) og proteinniveauer (Figur 2.b). Selv, basal FN14 udtryk, enten mRNA-niveauer eller proteinniveauer, var signifikant højere i PC-3-celler sammenlignet med LNCaP-celler. Desuden basale niveauer af TWEAK også var højere i PC-3-celler sammenlignet med LNCaP-celler, som bedømt ved RT-PCR (figur 2.A).

FN14 ekspression blev tydeligt forøget med føtalt bovint serum (FBS) i PC3-celler og, svagt i LNCaP-celler (Figur 2.b). Disse resultater svarer til dem beskrevet af Huang et al [35], og tyder på, at FN14 kan have en rolle i prostatacancer fordi udtrykkes meget i de mere aggressive maligne celler. Endelig har vi påvist ved flowcytometri, at PC-3 celler udtrykt FN14 i celleoverfladen (figur 2.C).

nappe Øget FN14 og MCP-1 ekspression i Prostata Cancer Cells

TWEAK er en multifunktionel cytokin, som kan inducere inflammatorisk molekyle produktion i talrige celletyper [40]. Vi stimulerede prostatacancerceller med TWEAK og målt FN14 og MCP-1 mRNA-niveauer ved hjælp af RT-PCR. Vi observerede, TWEAK øget FN14 og MCP-1 ekspression i begge cellelinier, hvilket viser, at de to celletyper har funktionelle TWEAK receptor (figur 3). Men tidsforløbet afveg mellem de to cellelinjer, er mere forbigående LNCaP celler, der i PC-3 celler.

Regulering af FN14 Expression i PC-3 Cells

I forskellige celletyper FN14-ekspression er afhængig af mikromiljøet [33], [34], [43], [44]. FBS, som er rig på vækst- og overlevelsesfaktorer, forøget FN14 ekspression i PC-3-celler ved mRNA’et, som vurderet ved RT-PCR (figur 4.A) og proteinniveauer, som målt ved Western blot (fig 4.B, E).

De inflammatoriske cytokiner TNFa- og IFNy også opreguleret FN14 mRNA (figur 4.C) og udtryk i PC-3 celler protein (figur 4.D, E). Tidsforløbet for FN14 opregulering som reaktion på TNFa /IFNy blev forsinket i forhold til observationer i andre celletyper [33].

Lethal Effekt af TWEAK i human prostatacancer Celler

TWEAK kan inducere apoptose, overlevelse eller endda proliferation i forskellige tumorcellelinjer og andre celler [27], [33], [34]. Vi studerede den letale virkning af TWEAK løbet prostata cancercellelinjer. TWEAK (100 ng /ml) inducerede apoptose i PC-3 dyrkes i fravær af FBS. Den dødelige effekt blev forhindret af FBS (figur 5.A). I nogle tilfælde, TWEAK-induceret celledød kræver samtidig inkubation med sensibilisatorer, såsom inflammatoriske cytokiner TNFa og IFNy [19], [33]. I denne henseende co-inkubering af TWEAK med TNFa /IFNy stærkt forøget apoptose i PC-3-celler (figur 5.A). Hverken TNFa eller IFNy, alene eller sammen, induceret apoptose i PC-3-celler (data ikke vist). Desværre fik TWEAK ikke inducere apoptose i serum forarmet LNCaP-celler, hverken alene eller i kombination med TNFa /IFNy (fig 5.B). Disse resultater er overensstemmende med den virkning, TWEAK observeret i renale tubulære celler, hvor, TWEAK inducerer proliferation i ikke-stressede celler, men inducerer apoptose i nærværelse af inflammatoriske cytokiner [33], [34]. TWEAK-induceret apoptose i PC-3-celler er TWEAK dosisafhængig (fig 5.C) og observeres fra 18 timer (fig 5.D).

FN14 medierer dødelige Virkning af TWEAK Over PC-3 celler

Mens FN14 er den eneste kendetegnet TWEAK receptor, der er bevis for en anden TWEAK receptor, og TWEAK kan binde til CD163 [45], [46]. Derfor undersøgte vi, om TWEAK inducerer apoptose i PC-3-celler gennem FN14 aktivering. Forudgående behandling med neutraliserende anti-FN14 (ITEM-2) eller anti-Tweak antistoffer forhindrede TWEAK- (figur 6.A) eller nappe /TNF /IFNy-induceret apoptose (Figur 6.B-C). Disse resultater antyder, TWEAK inducerer apoptose i PC-3-celler gennem FN14 aktivering. Dog kan TWEAK inducere apoptose gennem rekruttering af endogene TNF /TNF-receptor 1 (TNFR1) [47]. For at udelukke denne mekanisme, vi pre-stimulerede PC-3-celler med et anti-TNF-neutraliserende antistof. Anti-TNF-behandling forhindrede ikke TWEAK-induceret apoptose i PC-3 celler (Figur 6.A).

Karakterisering af TWEAK-induceret apoptose i PC-3 Celler

TWEAK-induceret apoptose i PC-3-celler blev vurderet både ved tilstedeværelsen af ​​hypodiploid celler målt ved flowcytometri og ved den typiske morfologi (nuklear krympning, kondensation og fragmentering samt nedsat cellestørrelse) (figur 7.A-B). I Annexin V /PI assays, TWEAK steg procentdelen af ​​apoptotiske celler i PC-3-celler dyrket in fravær af serum, og dette var mere tydelig i celler behandlet med TWEAK /TNFa /IFNy. Men hverken nappe eller nappe /TNFa /IFNy øgede antallet af apoptotiske celler i nærvær af serum (figur 7.C). Desuden har TWEAK ikke øge Annexin V /PI-positive celler i LNCaP-cellelinien (data ikke vist). Vi studerede derefter niveauerne af proteiner af Bcl2 familien. Tweak og nappe /TNF /IFNy øget proapoptotiske Bax niveauer (Figur 8.a), nedreguleret antiapoptotiske BclxL niveauer (Figur 8.b), og øget den endelige Bax /BclxL forhold (Figur 8.C). Disse resultater indikerer, at TWEAK modulerer proteiner af Bcl2 familien at favorisere apoptose celledød. Desuden er en Bax inhibitor peptid (P5) dosisafhængigt reduceret nappe-induceret apoptose i PC3-celler, hvilket yderligere antyder rekruttering af Bax og det mitokondrielle pathway (fig 8.D). For at bekræfte involveringen af ​​det mitokondrielle apoptose pathway udførte vi immunfluorescens af cytochrom C (Cyt C). Ikke-stimulerede celler viste mitokondrie Cyt C farvning, der henviser til, tilstedeværelse af Tweak /TNFa- /IFNy nogle celler viste Cyt C udgivelse, hvilket indikerer, at denne vej er aktiveret (figur 9).

TWEAK-induceret apoptose i PC-3 celler er Caspase Dependent

Dernæst undersøgte vi mekanismerne i TWEAK-induceret apoptose i PC-3-celler. Forbehandling med en pan-caspaseinhibitor, zVAD, forhindret TWEAK /TNFa /IFNy-induceret apoptose i PC-3-celler, hvilket viser, at apoptose er caspase-afhængig (figur 10.A). Western blot viste behandling af pro-caspase 3, hvilket gav aktiv caspasa-3 i nærværelse af TWEAK på 6 timer. Denne virkning var stærkere og tidligere i nærvær af TWEAK /TNFa /IFNy (fig 10.B). I nærvær af 10% FBS tweak /TNFa /IFNy kombination næppe aktiveret caspase 3 (fig 10.C). Immunofluorescens anvendelse af et anti-aktiv caspase-3-antistof bekræftet caspase-3-aktivering (figur 10.D). I nogle celler stimuleret med TNFSF cytokiner, Caspaser inhibering forhindrer apoptotisk celledød, men inducerer nekrotisk celledød [33]. I celledødsassays farvning med PI, zVAD beskyttet mod celledød induceret af TWEAK /TNFa /IFNy på samme niveau, at anti-TWEAK antistof. Dette resultat indikerer, at caspase hæmning ikke inducerer nekrose i PC-3 celler stimuleret med TWEAK (figur 11).

Diskussion

Den vigtigste konklusion er, at celle dyrkningsbetingelser og eventuelt in vivo mikromiljø kan manipuleres til at sensibilisere androgen-uafhængige prostatacancerceller at nappe-induceret apoptose. Inflammatoriske cytokiner og serum regulerer både ekspressionen af ​​FN14 i human cancercellelinie PC-3, samt cellens følsomhed over for den letale virkning af TWEAK. Interessant nok PC-3 androgenuafhængig cellelinie var følsom over for den letale virkning af TWEAK når de dyrkes i fravær af overlevelse og mitogene faktorer indeholdt i serum. Desuden er en inflammatorisk miljø sammensat af kombinationen af ​​TNFa /IFNy steg den letale virkning af TWEAK løbet af disse celler. Dette giver nye potentielle terapeutiske muligheder for androgen-uafhængig prostatacancer.

Vi undersøgte TWEAK /FN14-system i androgen-sensitive LNCaP-celler og i androgen-uafhængige PC3-celler.