PLoS ONE: rolle Stem Cell-Associated Intermediate Filament Nestin i malignt spredning af ikke-småcellet Cancer

Abstrakt

Baggrund

Nestin er forbundet med neoplastisk transformation, men de mekanismer hvorved nestin bidrager til invasion og malignitet af lungecancer er stadig ukendte. I betragtning af at proliferation er nødvendig for malign adfærd, undersøgte vi den mekanisme af nestin indsats i forbindelse med de proliferative egenskaber af ikke-småcellet lungekræft (NSCLC).

Metoder

Nestin ekspression blev undersøgt i NSCLC prøver og cellelinjer. Foreninger med klinisk-patologiske funktioner, herunder prognose og proliferative markører, blev evalueret. Effekter af nestin knockdown på spredning, og de signalveje involverede blev yderligere undersøgt.

Resultater

Nestin blev udtrykt i de fleste kræft prøver og alle tumorcellelinjer analyseret. Høj nestin udtryk i malignt væv var forbundet med høje Ki-67 eller PCNA niveauer og fattige patientresultater. Omvendt knockdown af nestin ekspression medførte signifikant inhibering af tumorcelleproliferation, nedsat kolonidannende evne, og cellecyklus G1 arrest. Endvidere nestin knockdown resulterede i inhibering af Akt og GSK3p-aktivering.

Konklusioner

Vores data viser, at nestin ekspression i NSCLC-celler er associeret med dårlig prognose for patienter og tumorcelleproliferation pathway. Nedregulering af nestin effektivt inhiberede lungekræft celleproliferation, som kan være gennem at påvirke cellecyklusstandsning og Akt-GSK3p-Rb-signalvejen

Henvisning:. Chen Z, Wang J, Cai L, Zhong B, Luo H, Hao Y, et al. (2014) rolle Stem Cell-Associated Intermediate Filament Nestin i malignt spredning af ikke-småcellet lungekræft. PLoS ONE 9 (2): e85584. doi: 10,1371 /journal.pone.0085584

Redaktør: Vladimir V. Kalinichenko, Cincinnati Children ‘s Hospital Medical Center, USA

Modtaget: Maj 29, 2013; Accepteret: November 29, 2013; Publiceret: 3 feb 2014

Copyright: © 2014 Chen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af tilskud fra National Basic Research Program Kina (nr 2009CB522100 og 2010CB945400), National Natural Science Foundation of China (nr 30.971.675, 30.900.729, og 31.171.398), og de centrale videnskabelige og teknologiske projekter af Guangdong-provinsen (Nej . 2007A032100003). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er nu den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald på verdensplan. I ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), som tegner sig for 80% af alle tilfælde af lungekræft, fjernmetastaser udvikle sig i op til 70% af patienter med tidlig-stadie sygdom [1], [2]. Trods indførelsen af ​​nye kemoterapeutiske midler og forbedrede kirurgiske teknikker, NSCLC fortsat en betydelig terapeutisk udfordring. Den overlevelse er i øjeblikket fattige, med kun 15% patient overlevelse ved 5 år efter diagnosen [3]. Ondartede funktioner i NSCLC involverer flere vigtige begivenheder, herunder proliferation og invasion af primær tumor, vedvarende angiogenese, og unddragelse af apoptose. Proliferation af primær tumor er en integreret del af molekylær og cellulær patogenese, udvikling og metastase af lungecancer [4].

Nestin, et medlem af den mellemliggende filamenter (IF) familie, er blevet identificeret som en potentiel proliferative og multipotency indikator i adskillige progenitorceller [5] – [10]. De seneste rapporter understøtter en sammenhæng mellem nestin og maligne egenskaber [11] – [19], og foreslå, at rigelige nestin udtryk er korreleret med større malignitet og dårligere prognose i forskellige kræftformer [11], [18] – [21]. Men den specifikke funktion nestin i invasive og metastatiske adfærd lungekræft celler fortsat uklart. Resultaterne at nestin knockdown reducerer dyrkede neuroblastom og astrocytoma cellevækst mens dens overekspression har en cytobeskyttende virkning mod H

2O

2 skade foreslå en rolle i at fremme celle overlevelse og spredning [22] – [24]. I modsætning hertil viste en anden undersøgelse, at nestin nedregulering ikke ændrer

in vitro

eller

in vivo

vækst karakteristika af to forskellige bugspytkirtelkræft cellelinjer [25]. Således kan nestin ikke blot fungere som et strukturelt protein, men kan deltage aktivt i bekæmpelse af vigtige cellulære processer. Imidlertid er de præcise mekanismer for nestin handling i proliferation kræver yderligere udredning.

Vores tidligere undersøgelse bekræftede nestin udtryk i NSCLC vævsprøver, som syntes at korrelere med den nyfødte lymfe kanal induceret af tumorceller [21]. På den anden side havde Ryuge S beskrevne nestin udtryk er en prognostisk indikator for dårligere overlevelse sandsynlighed for patienter med reseceret NSCLC [26]. Forholdet mellem nestin ekspression og proliferativ adfærd NSCLC-celler er ikke blevet direkte undersøgt til dato. I betragtning af den begrænsede tilgængelige data om patofysiologiske rolle nestin i NSCLC celler [21], [26], har vi ikke kun bekræftet, at ekspressionen af ​​nestin i NSCLC prøver syntes at korrelere med kliniske målinger af tumor malignitet, men også undersøgt foreningen af nestin udtryk med proliferative egenskaber af lungekræft celler og dets funktionelle rolle i tumorcelleproliferation i den aktuelle undersøgelse.

Materialer og Metoder

vævsprøver

i alt 71 NSCLC prøver og tumor-tilstødende væv (længst kant af resektion fra tumoren) blev tilfældigt udvalgt fra vores væv database. Prøver blev opnået fra patienter behandlet på Institut for Thoracic Surgery fra First Affiliated Sygehus af Sun Yat-sen University mellem maj 2003 og juli 2004. Ingen af ​​patienterne havde fået neoadjuverende kemoterapi eller strålebehandling. Klinisk information blev opnået ved at gennemgå præoperative og perioperative journaler eller via telefon eller skriftlig korrespondance. Sager blev iscenesat baseret på tumor-node-metastaser (TNM) klassifikation af Den Internationale Union Against Cancer, revideret i 2002 [27], [28]. Brugen af ​​menneskelige materialer blev godkendt af Medical Etisk Komité The First Affiliated Sygehus, Sun Yat-sen University (fulde navn bestyrelsen /udvalg:. Medical Etisk Komité The First Affiliated Sygehus, Sun Yat-sen University No. 2008-7). Vi bekræfter, at skriftligt informeret samtykke fra donor eller de pårørende blev opnået for brug af denne prøve i forskningen. Kliniske karakteristika af patienter er vist i tabel 1.

cellelinier

Ikke-småcellet lungecancer cellelinier, A549, H1299 og H460, blev opnået fra Cell Bank for Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina), og dyrkes i henhold til den specifikke Cell Bank-protokol.

immunhistokemisk farvning

den immunhistokemiske procedure svarede til tidligere rapporterede protokoller [21], [29] . Anti-nestin (AB5922, Millipore, Temecula, Californien, 1:500 fortynding) og anti-Ki-67 (sc-15402, Santa Cruz, Californien, USA; 1:200 fortynding). Blev anvendt som de primære antistoffer

plasmider

for knockdown af nestin udtryk, retrovirus vektorer (pSM2) koder korte hårnål RNA (shRNAs), betegnet shRNA1 (5′-TGC TGT TGA CAG TGA GCG AGG CAG ACA TCA TTG GTG TTA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAA CAC CAA TGA TGT CTG CCC TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ‘) og shRNA2 (5’-TGC TGT TGA CAG TGA GCG CGG CTA GTC FTT GCC TGA ATA ATA GTG AAG CCA CAG ATG TAT TAT TCA GGC AGG GAC TAG CCA TGC CTA CTG CCT CGG A-3 ‘), blev indkøbt fra Open Biosystems (Huntsville, AL, USA). Disse retrovirus eller en konstruktion indeholdende en kodet shRNA sekvens (kontrol shRNA, Open Biosystems) blev stabilt transduceres ind tumorceller gennem antibiotisk selektion.

immunfluorescensfarvning

Celler blev inkuberet med primære anti-nestin ( AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 fortynding), anti-Ki-67 (Santa Cruz, 1:200 fortynding) eller anti-PCNA-antistof (2586, Cell Signaling Tech, Beverly, MA; 1:2000 fortynding). Prøver blev monteret med Vectashield indeholdende Hoechst 33342, og observeret under et fluorescensmikroskop

RT-PCR-analyse

Totalt RNA blev ekstraheret, og de følgende primersekvenser arbejdskraft:. Nestin, 5-GAG GAC CAG AGT ATT GTG AGA C-3 og 5-CAC AGT GGT GCT TGA GTT TC-3 (368 bp) og β-actin (intern kontrol), 5-GTG GGG CGC CCC AGG CAC CA-3 og 5-CTC CTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3 (540 bp).

immunblotting Analyse

Proteiner blev separeret, elektrooverført, blokeret med en opløsning af TBS /0,1% Tween-20, inkuberet med muse anti- nestin antistof (AB5922; Millipore, Temecula, CA; 1:500 fortynding) natten over, og påvist med et peberrodsperoxidase-konjugeret anti-muse-sekundært antistof (Cell Signaling Tech, Beverly, MA, USA). GAPDH (SC-81.545, Santa Cruz, Californien, USA) blev anvendt som en intern kontrol og billedet-Pro Express (MediaCybernrtics, USA) blev anvendt systemet

Colony Dannelse og CCK-8 Cell Proliferation Analyser

Cell kolonidannelse blev bestemt ved anvendelse af krystalviolet farvning. Celleproliferation blev analyseret med celle Counting Kit (CCK) -8 (Dojindo, Kumamoto, Japan), og bestemt ved måling af absorbans ved 450 nm.

Vurdering af DNA Synthesis via edu Inkorporering

celler blev mærket med 5-ethynyl-2′-deoxyuridin (edu). Nuklear inkorporering blev analyseret ved påvisning af Alexa Fluor 488 brug af klik-iT edu Imaging Kit (Invitrogen).

Flowcytometri

Efter vask med PBS, halvtreds tusinde celler blev analyseret under anvendelse af et FACS Calibur instrument (BD Biosciences, San Jose, CA) udstyret med CellQuest 3.3 software. ModFit LT 3.1 retssag cellecyklus analyse software blev anvendt til at bestemme de procentdele af celler i forskellige faser af cellecyklus

Angivelse af cellecyklusproteiner

For immunoblotting, anvendes følgende antistoffer:. Kanin anti-Akt (# 9272), anti-GSK3p (# 9332), anti-phospho (Ser21 /9) -GSK3β (# 9331), anti-phospho (Ser780) -Rb (# 9307), anti-phospho (Ser795) -Rb (# 9301), anti-phospho (Ser870 /811) -Rb (# 9308), muse-anti-phospho (Ser473) -Akt (# 4051) og anti-retinoblastoma (Rb) protein (# 9309), samt HRP-konjugeret-anti-kanin sekundært antistof. Alle antistoffer blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Beverly, MA, USA). For kvantitative analyser, alle data blev normaliseret til GAPDH udtryk.

Statistisk analyse

Alle beregninger blev udført ved hjælp af SPSS V.14.0 statistisk software (Chicago, IL, USA). Spearmans korrelationskoefficient, Chi-square test, og ANOVA blev anvendt som passende. Samlet overlevelse (OS) blev beregnet fra tidspunktet for operationen indtil datoen for den sidste opfølgning, og sammenslutningen af ​​nestin udtryk med OS præsenteres som Kaplan-Meier plot. Univariate og multivariate analyser blev udført ved hjælp af Cox proportionel risiko regressions at bestemme de prognostiske virkninger af nestin udtryk og potentielle kliniske variabler på OS.

Resultater

Basic Clinical Information og opfølgende undersøgelser

i alt blev 51 mandlige og 20 kvindelige patienter med NSCLC udsat for helbredende kirurgisk resektion indskrevet i undersøgelsen. Gennemsnitsalderen for patienterne var 57,6 ± 9,8 år (spændvidde, 35 til 77 år). Vi undersøgte 35 lungeadenocarcinom, 34 pladecellecarcinom og to store celle carcinom tilfælde. Sager blev klassificeret som fase I (n = 32), fase II (n = 17), fase III (n = 15) og trin IV (n = 7).

27, 28 Stage IV sager omfattede T

1-2 N

0 og reseceret ensomme hjernemetastaser. Patient data blev analyseret efter 5 års opfølgning, og oplysninger opnået for 95,8% (68 af 71) af patienterne. Den mediane samlede overlevelse var 25,2 ± 1,9 måneder (95% CI: 21.4-29.0 måneder) og betyder samlet overlevelse var 24,0 ± 2,3 måneder (95% CI: 19.4-28.6 måneder).

Foreningen af ​​Nestin Expression med dårlig prognose hos patienter med NSCLC Salg

baseline karakteristika af den undersøgte population med hensyn til nestinfænotypen og resultater af multivariate analyser er vist i tabel 1 og 2, henholdsvis. Nestin blev udtrykt i 88,7% (63/71) tilfælde, med næsten ingen ekspression i alveolære og bronchiale epitelceller i tumor tilstødende væv (figur 1A, B). Nestin status blev korreleret med dårligt differentieret fænotype (

χ

2 = 17,776,

P =

0,006), histologiske cancer vævstype (

χ

2 = 8,215,

P =

0,002), N klassifikation (

χ

2 = 12,093,

P =

0,001), og vital status (

χ

2 = 9,003,

P =

0,003). Vi observerede en signifikant forskel i overlevelse estimater mellem patienter med og uden nestinfænotypen (figur 1D). Forhøjet nestin udtryk (ved hjælp af en cut-off værdi baseret på medianen nestin histoscore) var forbundet med kortere kumulativ overlevelse (30,8 ± 3,3

vs

20,2 ± 1,7 måneder hazard ratio 3,366;

P =

0,006).

Stærk nestin farvning var tydelig i NSCLC væv, mens farvning i tumor tilstødende væv var svag (A, B). Nestin blev desuden påvist i dårligt differentieret adenocarcinom og pladecellecarcinom væv (C). En Kaplan-Meier plot der viser forskellene i overlevelse mellem høje og lave nestin udtryksgrupper, dikotomiseret baseret på medianværdien af ​​nestin ekspression i tumorbyrde (D). Scale Bar, 100 um; *

s

0,01; ANOVA.

Foreningen af ​​Nestin med Tumor celleproliferative Markers

Nestin udtryk var signifikant associeret med de af de proliferative markører, Ki-67 (r = 0,795,

P

0,001; Figur 2A, B og C) og PCNA (r = 0,764,

P

0,001; Figur S1A og B), der indikerer en rolle i tumorcelleproliferation.

Farvning af nestin og Ki-67 i NSCLC prøver. (A) IHC farvning af nestin og Ki-67 i NSCLC væv. (B) Signifikant korrelation af nestin og Ki-67 niveauer (r = 0,795;

P

0,001). Hvert punkt repræsenterer en NSCLC eksemplar. (C) Ki-67 histoscores blev forhøjet i adnocarcinoma (Adeno) og pladecellekræft (SCC) med højere nestin udtryk. Scale Bar, 100 um; *

s

0,01, ved hjælp af ANOVA

Nestin Expression i NSCLC cellelinier

For at tydeliggøre udtryk status nestin i NSCLC, vi undersøgte sit udtryk. mønstre i NSCLC-cellelinjer, A549 og H460. Især blev nestin mRNA og protein fundet i alle cellelinjer (figur 3). Ekspressionen af ​​nestin protein mellem tumorceller og normale celler blev også blevet vist ved hjælp af laser capture microdissection (figur S2).

Nestin ekspression blev detekteret i A549, H1299and H460 celler under anvendelse immunfluorescensfarvning (A), RT-PCR (B) og immunoblotanalyse (C). β-actin eller GAPDH blev anvendt som en loading kontrol. Skala Bar, 100 um.

Rolle Nestin i tumorcelleproliferation

For at vurdere, om nestin spiller en rolle i lungekræft celleproliferation, vi stabilt transficeret A549 og H460 celler med plasmider koder shRNAs rettet mod nestin afskrift eller med scrambled shRNA kontrol plasmider, og målte ændringer i spredningsrelaterede attributter. Immunofluorescens-farvning og immunoblotting viste, at to nestin shRNA sekvenser (shRNA1 og shRNA2) dramatisk reduceret ekspression af nestin protein (figur 4A). Som vist i figur 4B, nestin knockdown i tumorceller resulterede i fremtrædende fald i kolonidannende evne (fra 23% til 11,8% og 12,3% for shRNA1 og shRNA2 i A549-celler, og fra 39,6% til 20,9% og 22,8% for shRNA1 og shRNA2 i A549-celler, henholdsvis). Den spredning sats blev også markant nedsat i hver nestin-knockdown celler sammenlignet med kontrol vektor celler, målt som et fald i levedygtige celler (Figur 4C). I overensstemmelse med forholdet mellem forhøjede nestin ekspression og Ki-67 eller PCNA-ekspression i NSCLC tumorprøver, nestin knockdown i tumorceller resulterede i et signifikant fald i antallet af Ki-67-positive celler sammenlignet med kontrolgruppen tumorceller (figur 4D). Endvidere DNA-syntese i nestin Knockdown tumorceller var signifikant inhiberet sammenlignet med den i kontrol tumorceller (figur 5A).

(A) A549 eller H460 celler, der stabilt udtrykker shRNA mod nestin (shRNA1, shRNA2) blev etableret og nestin knockdown, sammenlignet med A549 eller H460 celler transficeret med en kodet shRNA sekvens (styrevektor) bekræftet med immunfluorescensfarvning (venstre panel) og immunoblotting (højre panel). Forskellene mellem nestin knockdown og kontrol A549 eller H460 celler i form af celle kolonidannelse blev påvist i repræsentative mikrografier med krystalviolet farvning (B, venstre panel) og kvantificering af celle kolonier (B, højre panel). Undertrykkelse af cellevækst som et resultat af nestin knockdown blev etableret med CCK-8 kit assay (C). Immunofluorescens-farvning (D) viste positiv immunreaktivitet for Ki-67-antistof (rød), og kerner blev modfarvet med Hoechst 33342 (blå). Scale Bar, 100 um; *

s

. 0,01, ved hjælp af ANOVA

Forskelle i DNA-syntese satserne mellem nestin knockdown og kontrol A549 eller H460 celler blev bestemt ved hjælp af Edu inkorporering assays (A). Flowcytometri blev anvendt til at analysere cellecyklus i nestin knockdown og kontrol A549 eller H460 celler (B). Scale Bar, 100 um; *

s

. 0,01, ved hjælp af ANOVA

Nestin shRNA Clones Display cellecyklusstop ved G1 /S Fase

For at bestemme, om tumor celle proliferativ hæmning er relateret til cellecyklus regulering, undersøgte vi effekten af ​​nestin knockdown på cellecyklusprogression i kræftceller. Navnlig blev antallet af celler i S-fasen af ​​cellecyklussen væsentligt reduceret efter nestin knockdown (figur 5B).

Nestin shRNA Clones Display Formindsket Phosphorylering af Akt ved Ser 473 og GSK3α /β ved Ser 21 /9

Dernæst vi bestemt signal- profiler af nestin shRNA kloner. Da overgangen fra G1 til S-fasen er et vigtigt kontrolpunkt under celleproliferation, vi yderligere bekræftet signalvejene involveret i G1 til S progression. Nestin knockdown vises relativt formindsket phosphorylering af centrale proteiner involveret i proliferation og metastase, herunder Akt ved Ser 473, GSK3α /β ved Ser 21/9, og Rb ved Ser 780, 795, og 807/811 (figur 6A). Kvantitativ analyse endvidere beskrevet, at faldet i phospho-Akt og phospho-GSK3α /p-proteiner især blev markeret i tumorceller transduceret med den shRNA2 sekvensen, hvorimod phospho-Rb ekspression blev mere signifikant reduceret i tumorceller transduceret med den shRNA1 sekvensen (figur 6B -F). Derfor de store phosphoryleringsbegivenheder ændret ved nestin nedregulering er dem af de centrale mediatorer i phosphatidylinositol 3-kinase pathway.

(A) ekspressionsmønstre for en række cellecyklus-relaterede proteiner i nestin knockdown og kontrol A549 celler. (B-D) Kvantitativ analyse af Rb og phospho-Rb, (B) AKT og phospho (Ser473) -Akt (C), og GSK3p og phospho-GSK3α /β (D). *

s

0,01; ANOVA.

Diskussion

Nestin udtrykkes i en bred vifte af embryonale og voksne progenitor cellepopulationer, og betragtes som en markør til at skelne precursorceller fra andre differentierede celler [30], [ ,,,0],31]. Nylige rapporter har vist, at ekspression af nestin i bryst-, prostata- og bugspytkirtelkræft er positivt korreleret med tumor malignitet [16] – [18]. Disse observationer har bedt øget forskning interesse i udtrykket mønstre af nestin i forskellige tumorer og dets forhold til proliferative og metastatiske egenskaber.

I den foreliggende undersøgelse, viste vi, at nestin udtryk er signifikant associeret med maligne funktioner i NSCLC væv specifikt dårligt differentieret fænotype og histologi klassifikation. Derudover blev nestin mRNA og protein udtrykt i alle NSCLC cell undersøgte linjer. Statistiske analyser afslørede en signifikant stigning i hazard ratio (risiko for at dø) hos patienter med forhøjet nestin ekspression, sammenlignet med dem, der udtrykker lave niveauer af nestin. Høj nestin udtryk i NSCLC væv blev hyppigst associeret med sygdom tilbagefald og død. Vores resultater yderligere bekræfter tidligere rapporter om en positiv sammenhæng mellem nestin udtryk og tumor malignitet [11], [18] – [21].

Selvom tidligere undersøgelser har rapporteret, at knockdown af nestin af siRNA effektivt reducerer spredning og væksten af ​​C6 astrocytomceller [23] og dets nedregulering aktiverer cdk5 /p35-afhængige apoptotiske veje [24], [32], den præcise rolle nestin i tumor metastasering er uklar på nuværende tidspunkt. Her observerede vi en positiv sammenhæng mellem nestin og Ki-67-ekspression i NSCLC væv og celler. Den iagttagelse, at Ki-67-proteinet udtrykkes i alle de aktive faser af cellecyklus (G1, S, G2, og mitose), men fraværende fra hvilende celler, støtter yderligere den teori, at nestin kan være forbundet med tumorcelleproliferation. I betragtning af sammenhængen mellem høj nestin udtryk og forhøjet farvning for de proliferative cellemarkører, Ki-67 og PCNA fokuserede vi på den rolle, nestin i tumorcelleproliferation hjælp retrovirus til at introducere shRNA vektorer med nestin-targeting (eller kontrol) sekvenser i NSCLC celler. Betydeligt, proliferative egenskaber, såsom kolonidannende evne og cellevæksthastigheden, blev reduceret i nestin shRNA kloner. Vores resultater giver foreløbige beviser for en rolle nestin i lungekræft celleproliferation.

En mulig mekanisme til at redegøre for sammenhængen mellem nestin udtryk og spredning foreslås på baggrund af resultaterne af vores analyse af cellecyklus regulering i tumorceller. Specifikt størrelsen af ​​S-fasen cellepopulation blev dramatisk reduceret i nestin knockdown-celler. I overensstemmelse med denne konstatering, DNA-syntese, der opstår under S-fasen, blev reduceret i nestin shRNA kloner. Overgangen fra G1 til S-fasen er et vigtigt kontrolpunkt i cellecyklussen. Vores undersøgelse af de vigtigste proteiner, der regulerer dette kontrolpunkt, såsom Rb-proteinet, forudsat yderligere støtte til en rolle for nestin i proliferation via modulering af cellecyklussen. Interaktioner af Rb med cyklin D-CDK4 /6 og cyklin E-CDK2-komplekser fremmer Rb phosphorylering og ekspression af gener, der er nødvendige for at komme ind i S-fasen [33], [34]. Vores forsøg viste, at nestin shRNA kloner vise mindskede relative niveauer af fosforylering på flere steder af Rb. Derfor foreslår vi, at fremme af Rb-phosphorylering er en af ​​de molekylære mekanismer gennem hvilke nestin fremkalder tumorcelleproliferation. Vi har desuden undersøgt specifikke proteiner af Akt signalvejen. Abnormiteter i serin /threoninproteinkinase, Akt, er tæt forbundet med den proliferative status af celler og inducerer phosphorylering af GSK3p [35], [36]. I sin aktiverede dephosphoryleret form GSK3p fremmer nedbrydningen af ​​cyclin D, og ​​ikke-phosphoryleret GSK3p undertrykker Rb-phosphorylering og forhindrer cellecyklusprogression [37], [38]. Data fra den foreliggende undersøgelse viser, at suppression af celleproliferation i nestin shRNA kloner afhænger nedregulering af Akt-GSK3p-Rb-signalvejen. I forlængelse heraf disse data antyder, at forhøjede nestin niveauer i lungecancerceller stimulere proliferation og metastase ved forøgelse af aktiviteten af ​​denne vej. Et antal forskere mener, at nestin har primært en cytoskelet funktion, hvilket giver en reaktion site for forskellige signalveje [39], [40], og således cytoskelettet forventes ændringer at påvirke kinaser relateret til invasion og metastase. Endnu vigtigere, fordi A549 og H460 cellelinier er p53 vildtype og p53-regulerede MDM2 protein er et kendt regulator af RB-funktion, krydstale mellem nestin og p53 pathway synes at blive taget i betragtning, og inhibering af mTOR aktivitet ved p53, som igen regulerer phospho-Akt-S473-niveau, kan også give mulig forbindelse mellem p53 og nestin [41], [42]. Derfor er forbindelsen mellem nestin udtryk og regulering af Rb proteinniveau skal være yderligere behandlet.

Sammenligning med tidligere rapporter om for nestin udtryk i lungekræft [21], [26], vores resultater ikke kun bekræftet at ekspressionen af ​​nestin i NSCLC prøver viste sig at korrelere med kliniske målinger af tumor malignitet og dårlig histologisk klassificering, men også foreslået, at nestin kan bidrage til den proliferative og invasive opførsel af NSCLC-celler. Desuden er vores arbejde også først undersøgt det biologiske forhold mellem nestin høj ekspression og maligne træk ved NSCLC anvendelse af RNA knockdown teknikker, cellecyklusanalyse, og evaluering af en serie af cellecyklus-associerede proteiner på lungekræft cellelinje modeller. Baseret på disse resultater, ville vi forudsat den første demonstration af, at nestinfænotypen udviste forbedret proliferative egenskaber, og forklares videnskabeligt de vigtigste spørgsmål i potentiel mekanisme af nestin indsats tumorcelleproliferation. Således de fænomener, der nestin-udtrykkende tumorceller er vigtige for proliferation, migration og metastase i lungekræft.

Mens vores resultater indikerer, at nestin handlinger gennem Akt-GSK3p-Rb-signalvejen til at bidrage til spredning i lungecancerceller, andre aspekter af tumor malignitet, såsom angiogenese, lymfangiogenese og tumor metabolisme, er endnu ikke direkte undersøgt. I betragtning af disse resultater, har brug for rollen som nestin, der skal overvejes i igangværende kliniske diagnose eller som et nyt mål for kræftbehandling.

Konklusioner

Vi observerede nestin-positive tumorceller i størstedelen af ​​NSCLC prøver og signifikant association af nestin udtryk med den delmængde af NSCLC-patienter udviser dårlige resultater og høje niveauer af proliferative markører. Desuden nestin knockdown hæmmede celledeling og G1 /S anholdelse i humane NSCLC celler, eventuelt via nedregulering af AKT-GSK 3β-cyclin D signalering. Vores data kollektivt tyder på, at tumorceller, der udtrykker nestin fremmer proliferation i NSCLC, som kan udgøre en vigtig mekanisme for nestin-medieret malignitet i lungerne kræftceller. Målrettet regulering af nestin kan således have terapeutiske anvendelser i human lungekræft behandling.

Støtte Information

figur S1.

Farvning af nestin og PCNA i NSCLC prøver. (A) IHC farvning af nestin og PCNA i NSCLC væv. (B) PCNA histoscores blev forhøjet i adnocarcinoma (Adeno) og pladecellekræft (SCC) med højere nestin udtryk. Scale Bar, 100 um; *

P

0,01, ved hjælp af ANOVA

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085584.s001

(TIF)

Figur S2.

Ekspressionen af ​​nestin protein mellem tumorceller og normale celler under anvendelse laser capture microdissection. (A) Laser capture microdissection af tumorceller og normale celler. H & E-farvede celler sektion viser tumorceller (a) og normale celler (d) før mikrodissektion. Samme afsnit viser tumorceller (b) og normale celler (e) efter mikrodissektion. Tumorceller (c) og normale celler (f) følgende mikrodissektion på hætten. (B) Resultaterne af western blotting af to par mikrodissekeret tumorceller og normale celler. Skala Bar, 100 um

doi:. 10,1371 /journal.pone.0085584.s002

(TIF)

Tak

Denne forskning er blevet præsenteret på 2

nd europæiske Lung Cancer Conference (2010, Genève).