PLoS ONE: Heterogene effekten af ​​direkte Hypoxi Pathway Aktivering i Nyre Cancer

Abstrakt

Generelt aktivering af hypoxi-inducerbare faktor (HIF) veje er klassisk forbundet med negativ prognose i kræft og er blevet foreslået at bidrage til onkogen køre. I klart celle renal carcinoma (CCRC) HIF pathways opreguleres ved inaktivering af von Hippel-Lindau-tumorsuppressor. Men HIF-1α og HIF-2α har kontrasterende virkninger på eksperimentel tumor progression. For bedre at forstå dette paradoks, vi undersøgte pan-genomiske mønstre af HIF-DNA bindende og tilhørende genekspression som reaktion på manipulation af HIF-1α og HIF-2α og relaterede resultaterne til CCRC prognose. Vores resultater afslører særskilte pan-genom organisering af kanoniske og ikke-kanoniske HIF isoform-specifik DNA binding på tusindvis af sider. Overordnede associationer blev observeret mellem HIF-1α-specifik binding, og gener associeret med gunstig prognose og mellem HIF-2α-specifik binding og negative prognose. Men inden for hver isoform-specifikke sæt, individuelle gen foreninger var heterogene fortegn og størrelse, hvilket tyder på, at aktivering af hver HIF-α isoformen bidrager med en meget kompleks blanding af pro- og anti-tumorigene effekter

Henvisning:. Salama R, Masson N, Simpson P, Sciesielski LK, Sun M, Tian YM, et al. (2015) Heterogene Virkninger af direkte Hypoxi Pathway Aktivering i nyrekræft. PLoS ONE 10 (8): e0134645. doi: 10,1371 /journal.pone.0134645

Redaktør: Jörn Karhausen, Duke University Medical Center, UNITED STATES

Modtaget: Maj 27, 2015; Accepteret: 10. juli 2015; Udgivet: 11 August, 2015

Copyright: © 2015 Salama et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Data har været deponeret på NCBI Gene Expression Omnibus database (GSE67237, https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE67237)

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af en Cancer Research UK (tilskud nummer A16016) til RS, NM og DRM, Ludwig Institute for Cancer Research til PJR og MS, at finansiering af højere uddannelse Rådet for England til DRM, Wellcome Trust (tilskud nummer 078.333 /Z /05 /Z, WT091857MA) til PJR, YMT og PS, og den tyske Research Foundation (tilskud nummer SC132 /2-1) til LKS. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Hypoxi er stærkt forbundet med negativ prognose i kræft og hypoxi signalveje er almindeligt aktiveres under udviklingen af ​​kræft [1-4]. Dette eksemplificeres ved clear cell renal cancer (CCRC), hvori inaktivering af von Hippel-Lindau tumor suppressor (pVHL) er en almindelig og tidlig begivenhed [5-7]. pVHL er anerkendelsen komponent i en E3 ubiquitin ligase kompleks, der er målrettet hypoxi inducerbar faktor (HIF) a-underenheder til nedbrydning af ubiquitinproteasomvejen, og inaktivering af pVHL resulterer i konstitutiv aktivering af HIF transkriptionelle pathway [8]. HIF transkriptionelle mål omfatter mange med funktioner, der forbinder med fælles fænotypiske karakteristika for kræft (f.eks forbedret angiogenese, dysreguleret energi metabolisme, øget celle motilitet), og det er almindeligt antaget, at onkogenese er drevet af en sammenlægning af de positive virkninger af HIF aktivering på sådanne processer.

transkriptionel aktivering med HIF hovedsagelig medieret gennem binding af HIF α /p heterodimerer til en kerne-konsensussekvens (RCGTG) i hypoxi responselementer (hres) [9]. Selv om de to bedst karakteriserede HIF-a-underenheder, HIF-1a og HIF-2a, manifest lignende domæne arkitektur, og der ikke kan skelnes DNA-bindende sekvenser [10], de transaktivere tydelige mål og vise kontrasterende tumorigene roller [11,12]. Overraskende er stærk opregulering af HIF efter inaktivering af VHL i CCRC forbundet med en usædvanlig skævhed i HIF isoform-ekspression, i retning HIF-2α [13]. Adskillige undersøgelser viser, at dette er funktionelt vigtigt for udviklingen af ​​CCRC. Genome-wide forbindelsesundersøgelser identificeret polymorfe varianter, der påvirker modtagelighed for CCRC på HIF-2α, men ikke HIF-1α, locus og på steder inden for HIF-2α transkriptionel pathway [14]. Omvendt er HIF-1α gendosis almindeligvis reduceret i CCRC ved tab af kromosom 14q [15], og HIF-1α gen, men ikke HIF-2α-genet, er underlagt en lille, men signifikant overskud af inaktiverende mutationer [16] . Endvidere HIF-2α men ikke HIF-1α, kan over-ride tumorsuppressoraktivitet af pVHL i eksperimentelle tumorsystemer [17,18]. Specifikt, re-ekspressionen af ​​HIF-1α i CCRC linjer, der mangler vildtype HIF-1α bremser væksten, mens overekspression af HIF-2α accelererer væksten i tumorxenoplantater [11,15].

Disse observationer udfordre paradigme, generel aktivering af HIF signaling drev onkogenese gennem aktivering af et lille antal diskrete transkriptionelle mål, og foreslå en mere kompleks grænseflade. For eksempel, pan-genomiske analyser afslørede flere hundrede til tusinder af direkte HIF transkriptionelle mål [10,19-22]. Eftersom HIF-1α og HIF-2α potentielt kan konkurrere om bindingen til HIF-1β eller for belægning af hres, eller kan binde forskellige sæt transkriptionelle mål, er det uklart, hvordan isoformspecifik manipulation af HIF-a indvirkninger på transskription mønstre forbundet med CCRC.

for at studere denne vi udførte detaljerede chip-seq og RNA-seq analyse af HIF-α isoform bindingssted belægning og genekspression i pVHL-defekt CCRC 786-0 cellelinie, efter re-udtryk af HIF-1α eller overekspression af HIF-2α, og relaterede disse resultater til prognostisk tilknyttede mønstre af genekspression i humane CCRC tumorer [6]. Vores resultater viser et stort antal diskrete isoformspecifik HIF-a-bindingssteder, der manifesterer en isoform-specifik genomisk arkitektur, aktivere separate mønstre i genekspression og forbinder med kontrasterende prognostiske genekspressionsmønstre i klinisk CCRC. Men selv om der blev observeret klare overordnede associationer mellem HIF-1a-associerede gener og god klinisk prognose og mellem HIF-2α-associerede gener og dårlig klinisk prognose, denne modsætning var ufuldstændig. På de enkelte gener, virkningerne var heterogene i både tegn og størrelse af effekt, hvilket tyder på, at selv inden for denne definerede kontekst, hver HIF-α isoformen har potentielt både pro- og anti-tumorfremkaldende virkninger.

Materialer og metoder

Laboratorie metoder

Cell Culture.

786-O og HEK293T celler blev købt fra ATCC (https://www.lgcstandards-atcc.org) og dyrket i Dulbecco modificeret Eagle-medium suppleret med 10% føtalt kalveserum, 2 mM L-glutamin, 100 U penicillin og streptomycin 50 U /ml (v /v) (Sigma-Aldrich).

Produktion af 786-0 HIF -1α /HIF-2α celler.

HIF-1α og HIF-2α cDNA sekvenser [11] blev først klonet ind pRRL.IRES.EGFP (slags gave fra Kamil Kranc, Glasgow) til at generere bicistroniske vektorer. Disse blev derefter co-transficeret med pCMV-dR8.2 og pCMC-VSVG ind HEK293T celler og de resulterende viruspartikler blev isoleret ved centrifugering og ultrafiltrering. 786-0-celler (ATCC) blev derefter transduceret med enten kontrol (pRRL), HIF-1α (pRRL-HIF-1α) eller HIF-2α (pRRL-HIF-2α) ekspression virus.

chip-seq .

enkelt chip-seq analyser blev udført som tidligere beskrevet [19]. Chromatin blev immunpræcipiteret under anvendelse af kanin polyklonale antisera til HIF-1α (PM14), HIF-2α (PM9) [23], HIF-1β (NB-100-110, Novus Biologicals, UK) eller præ-immun serum som kontrol.

PolyA + selekteret RNA-seq

Totalt RNA blev fremstillet in triplo under anvendelse af Mirvana miRNA Isolation Kit. (Ambion; Life Technologies Ltd, Paisley, UK) og behandlet med DNasel (TURBO DNA-fri, Ambion ). PolyA + RNA biblioteker blev derefter fremstillet under anvendelse af ScriptSeq v2 RNA-Seq kit (Epicentre, Madison, WI, USA).

High-throughput sekventering.

Alle biblioteker blev fremstillet ifølge Illumina protokoller og sekventeret på HiSeq 2000 platform (Illumina, San Diego, CA, USA).

tiltrædelsespartnerskaber koder.

Chip-seq og RNA-seq data er tilgængelige fra Gene Expression Omnibus (GSE67237).

Bioinformatik analyse af chip-seq data

indledende analyse.

Illumina adapter sekvenser blev trimmet hjælp Trimgalore (0.3.3), og læser blev justeret til Genome reference Consortium GRCh37 ( hg19) ved hjælp af BWA (0.7.5a-R405). Lav kvalitet kortlægning blev fjernet (MapQ 15) ved hjælp af SAMtools (0.1.19) [24] og læser kortlægning til Duke Encode sort liste regioner (https://hgwdev.cse.ucsc.edu/cgi-bin/hgFileUi?db = hg19 g = wgEncodeMapability) blev udelukket ved hjælp BEDTools (2.17.0) [25]. Duplicate læser blev markeret til udelukkelse hjælp Picard værktøjer (1,106) (https://picard.sourceforge.net/). Læs tætheder blev normaliseret og udtrykt som læser pr kilobase per million læser (RPKM) [26]. En million tilfældige ikke-overlappende regioner udvalgt fra KODE DNase Cluster II toppe (https://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/hg19/encodeDCC/wgEncodeRegDnaseClustered/) blev anvendt som en kontrol.

Peak Calling .

Chip-seq toppe blev identificeret ved hjælp af T-PIC (Tree form Peak Identifikation for chip-Seq) [27] og MACS (Modelbaseret analyse af chip-Seq) [28] i kontrol tilstand. Peaks opdaget af både peak opkaldere blev filtreret kvantitativt ved hjælp af den samlede optælling af den top til kun at omfatte toppe, der lå over den 99.99th percentil af tilfældige baggrund regioner udvalgt fra KODE DNase II klynge (p-værdi 0,0001).

De-novo Motif Analysis.

Sekvenser flankerer hver top topmøde (± 150bp) var repeat-maskeret hjælp RepeatMasker 4.0.3 (https://www.repeatmasker.org). De-novo motiver blev identificeret ved hjælp af Meme-chip (4.9.1) [29] og matches ved hjælp af TomTom-modulet, til kendte transskription faktor motiver i 2009 Jaspar kerne databasen [30].

Principal Component Analysis (PCA).

bindingssteder for alle underenheder indgår i PCA blev lagt sammen til én bindende sæt. PCA blev udført ved hjælp af Singular Value Forrådnelse (Prcomp, R 3.1.1 -stats bibliotek, https://cran.r-project.org) for både individuelle bindingssteder og for hele af chip-seq signal for hver underenhed. Biplots blev genereret i R.

Heat maps

bindingssted varme kort blev genereret ved hjælp Ngsplot (2,08) [31] med parametrene:. FL = 50, MW = 5, RZ = 1 SC = 0-1, MQ = 15.

Motiv Sandsynlighed.

Hver HIF-α bindende region (topmøde ± 150bp) blev scannet for HRE (Jaspar /MA0259.1) og AP-1 (Jaspar /MA0491.1) bindende motiver hjælp position vægt matricer (PWM’er) hentet fra Jaspar Core-databasen 2009 [30]. Den normaliserede sandsynlighed ratio (NLR) for hvert motiv blev beregnet ifølge ligning 1. Det maksimale normaliserede sandsynlighed forholdet for hver bindende region blev rapporteret for både HRE og AP-1 motiv som afgivet ligning 2.

Ligning (1) ligning (2)

Hvor

j

er den position i toppen,

i

er tilfældet i motivet,

L

er længden af ​​motivet,

PWM (b

,

i)

er PWM værdi på

i

for den tilsvarende base,

b

,

b (b)

er baggrunden vægt for den tilsvarende base beregnet over en million tilfældige DNAse sites og

W

er toppens bredde.

Bioinformatik analyse af RNA-seq data

Initial Analyse.

Adapter sekvenser blev trimmet som ovenfor. Læser blev derefter justeret til GRCh37 hjælp Tophat 2.0.8b (https://ccb.jhu.edu/software/tophat/index.shtml) og bowtie 1.0.0 (https://bowtie-bio.sourceforge.net/index. shtml) og ikke-entydigt kortlægning fragmenter udelukket hjælp SAMtools (0.1.19) [24]. Total læse tæller for hver UCSC defineret gen blev udvundet ved hjælp HTSeq (0.5.4p3) [32] med ‘kryds-streng’ mode og markant regulerede gener blev identificeret ved hjælp af DESeq2 (ref. [33]).

Gene Set Enrichment Analysis (GSEA).

GSEA berigelse analyse anvendt 10000 permutationer, vægtet berigelse score og præ-ranking af gener [34]. Både differential udtryk betydning ifølge DESeq2 og fold-forskel mellem de to betingelser blev brugt til at rangere gener [35] (ligning 3).

Ligning 3

Hvor φ

i er den log2 fold-ændring og

pv

jeg

er p-værdien for gen

jeg

.

The Cancer Genome Atlas (TCGA) GSEA.

Kliniske og RNA-seq V2 data for Nyre Nedsat Clear celle karcinom (KIRC) patienter (https://tcga-data.nci.nih.gov/tcga/) [6] blev indsamlet. Patienter med manglende kliniske data eller flere RNA-seq datasæt blev udelukket. Normaliseret mRNA tæller blev anvendt som forudsat. Patienterne blev inddelt i to grupper ved hjælp af en prognostisk score, tilsætte 1 for hver af; alder over 60, patologisk stadie 3 eller 4, tilstedeværelse af metastase eller patient afdøde. God prognose patienter scorede 0 eller 1 og dårlig prognose patienter scorede 2, 3 eller 4. differential udtryk for hvert gen mellem de patientgrupper blev vurderet af Sandsynlighed Ratio Test for negative binomial monteret modeller ved hjælp glm.nb i R (3.1.1 ). Gener blev rangeret for GSEA baseret på kombineret betydning og fold-change som ovenfor.

Sygdom Annotation.

bindingssted berigelse blev beregnet ved hjælp -log10 af binomialtest FDR (q-værdi) af GREAT (genomiske regioner Berigelse af anmærkninger Tool [36]) 2.0.2. Kræft undertyper uden berigelse i enten chip-seq datasæt blev fjernet.

Binding Gene Predictor.

Gener inden for 10 kb af websteder med mindst 3-fold forskel mellem HIF-1α og HIF -2α binding blev udvalgt til at designe et gen prædiktor hjælp Overvåget principal komponent analyse (SPCA) [37,38]. Først HIF-bindende gener demonstrerer univariat signifikans (p 0,05) blev i forudsige patientens prognose (Cox proportional hazard model) valgt. For hvert sæt af gener (dem bindende genindført HIF-1α eller overudtrykt HIF-2α) Singular Value Decomposition (SVD) på tværs af alle TCGA patienter blev det tildele gen vægte [37,38]. Hvert gen prædiktor valideret ved anvendelse “leave-one-out” krydsvalidering, beskæftiger 414 patienter ad gangen for at generere genet prædiktor og derefter forudsige overlevelsen af ​​hver left out patient. Den endelige betydning og hazard ratio af patientens risiko prædiktor blev vurderet ligner univariate analyse.

Resultater

For det første at definere HIF isoformspecifik aktiviteter, der er forbundet med kontrasterende effekter på væksten i CCRC -afledte VHL-defekt 786-0 celler blev pools af celler inficeret med vira, der udtrykker tom vektor (VA), vildtype HIF-1α, eller vildtype HIF-2α og pan-genomiske mønstre af HIF-binding og gen ekspression blev analyseret ved chip-seq og RNA-seq. HIF-1α og HIF-2α infektioner opnået omtrent lige mRNA-niveauer, der var cirka 10 gange højere end det endogene HIF-2α mRNA-niveau (S1A Fig). Tilsvarende HIF-2a proteinniveauer var ca. 8 gange højere i HIF-2α inficerede celler end i kontrolcellerne, mens HIF-1α proteinniveauer blev 15-20 gange højere i HIF-1α inficerede celler end i en anden CCRC celle line (RCC4), som udtrykker fuldlængde HIF-1α (S1B fig). I kontrol celler, blev identificeret i alt 1719 toppe bindende endogene HIF-2α. Som forventet, disse sites viser et højt niveau af konkordans med HIF-1β signal, i overensstemmelse med binding af en HIF-2α /1β heterodimer (S2 Fig).

Vores RNA-seq analyse bekræftede tidligere fund [15] at selv 786-0 celler ikke udtrykker vildtype-HIF-1α, de udtrykker flere trunkerede og /eller fusionstranskripter omfatter HIF-1α exoner 1-9, men ikke mere distale sekvenser (S3 Fig), og forventes at være i stand til at kode for et transkriptionelt aktiv HIF-1α. Re-ekspressionen af ​​fuldlængde vildtype HIF-1α i 786-0 celler har en negativ effekt på væksten som tumorxenoplantater i mus. Vi begyndte derfor ved at undersøge pan-genomiske mønstre af DNA-binding til HIF-1α, HIF-1β og HIF-2α i sådanne celler, og sammenlignet disse med kontrol 786-0 celler.

Re-ekspressionen af ​​HIF- 1α ikke antagoniserer HIF-2α bindende

Siden HIF-1α og HIF-2α både dimerisere med HIF-1β, og anerkende en lignende konsensus DNA-sekvens, men har modsatrettede effekter i tumor xenograft vækst i 786-0, vi overvejet først den mulighed, at re-udtrykte HIF-1α kunne modvirke HIF-2α DNA-bindende, enten gennem direkte konkurrence om bindingssteder eller gennem konkurrence om HIF-1β. Noget overraskende viste genom-dækkende analyse, at HIF-2α binding blev lidt påvirket af re-ekspression af HIF-1α (Fig 1A, sammenlign I og III). I overensstemmelse med dette, principal component analysis (PCA) af HIF-2α bindende i HIF-1α re-udtrykkende celler viste stærk co-varians med HIF-2α bindende i kontrolceller (fig 1B, sammenlign vektorer HIF-2α (VA) og HIF -2α (1αRE)). Disse analyser tyder på, at HIF-2α binding er stort set upåvirket af HIF-1α re-udtryk. For at teste dette mere kvantitativt, vi sammenlignet den relative styrke af HIF-2 bindende signaler i HIF-1α re-udtrykkende, versus kontrol celler, på tværs af de 1719 endogene HIF-2a bindingssteder identificeret i kontrol celler. Denne analyse viste en stram sammenhæng centreret af egenkapitalen på bindende i de to cellelinjer, for både HIF-2α bindende og for HIF-1β binding (S4 Fig). Således under disse betingelser, HIF-1α re-ekspression synes ikke til globalt antagonisere HIF-2α ved at afbryde HIF-2α binding, enten gennem direkte konkurrence om bindingssteder, eller ved at konkurrere HIF-1 p væk fra HIF-2α.

(A) HIF-1α bindingssteder i HIF-1α re-udtrykkende celler blev identificeret ved peak kald og rangeret på den lodrette akse ifølge signalintensitet. Varme kort af disse sites (± 5 kb på den vandrette akse) viser chip-seq read densitet for de angivne HIF subunits blev frembragt for både kontrol- celler (i, ii) og HIF-1α re-udtrykkende celler med HIF-1α re- indføres i (iii-v). Mønsteret af HIF-2α binding påvirkes minimalt af genekspressionen af ​​fuldlængde HIF-1α (sammenlign I og III). Sites bindende re-udtrykte HIF-1α er stort set samtidig besat af HIF-1β (sammenlign iv og v). (B) Biplot viser Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signal intensitet (RPKM værdier) for både individuelle bindingssteder (prikker) og HIF-underenheder (vektorer) på tværs af alle HIF-bindingssteder identificeret i kontrol celler og i HIF- 1α re-udtrykkende celler. Steder bindende endogene HIF-2α i kontrol- celler er vist med blåt, mens sites bindende re-udtrykte HIF-1α er vist i rødt, websteder bindende både er farvet lilla og de resterende arealer er vist i gråt. PCA for hver underenhed viser høj co-varians mellem HIF-2α bindende i kontrolcellerne og i HIF-1α re-udtrykkende celler (sammenlign HIF2α (VA) og (HIF2α (1αRE)). Dette tyder kun minimal ændring i HIF -2α binding som følge af HIF-1α re-udtryk. Omvendt HIF-1β vektor ændringer dramatisk med HIF-1α re-udtryk (sammenlign HIF1β (VA) med HIF1β (1αRE)) og flugter tæt med vektoren for re-udtrykte HIF-1α (HIF1α (1αRE)). den enkelte bindingssteder i kontrol- og HIF-1a re-udtrykkende celler (blå og røde prikker) vender tæt sammen med deres respektive PCA vektorer. (C) Histogram af afstanden til nærmeste transkriptionsstartsitet (TSS) for HIF-1α bindingssteder i celler re udtrykker HIF-1α. (D) HIF-1α bindingssteder i de genindførte udtrykkende celler blev kategoriseret efter klassen (Ensemble) i den nærmeste genet. den relative hyppighed af hver klasse er show med cirkeldiagram. (E) sæt berigelse Gene analyse (GSEA) for sættet af gener nærmest til HIF-1α bindingssteder når gener rangeret efter folde-forandring og betydning i mRNA ekspression efter re -expression af HIF-1α (vandret akse).

Omfattende binding af re-udtrykte HIF-1α på nye funktionelle steder i

​​i modsætning til begrænsede effekter på eksisterende HIF-2 binding , re-ekspressionen af ​​HIF-1α førte til omfattende ny bindende i hele genomet, med særlig HIF-1α signal identificeret på 5147 lokaliteter. Mærket korrelation blev observeret mellem HIF-1α og HIF-1β binding i disse HIF-1α re-udtrykkende celler (Fig 1A, sammenlign iv og v). I tråd med dette, bekræftede PCA stærke kovariansen mellem HIF-1α og HIF-1β i HIF-1α re-udtrykkende celler, hvilket indikerer, at disse steder er stort set forskellige fra dem bindende endogene HIF-2α (Fig 1B, sammenligne vektorer HIF-1α ( 1αRE) og HIF-1β (1αRE) og kontrast med HIF-2α (VA) og HIF-1β (VA)). Tilsammen disse resultater viser, at efter re-udtryk HIF-1α binder sig til et stort antal lokaliteter adskilt fra endogene HIF-2a sites, sandsynligvis som en HIF-1α /HIF-1β heterodimer. Desuden samlede HIF-1β kromatin immunofældning signal (antal læser kortlægning til peak regioner) steg ca. 2-3 gange efter re-ekspressionen af ​​HIF-1α (se også S5 Fig). Dette antyder, at HIF-1β protein overflod ikke er begrænsende for endogen HIF bindende i VHL-defekt 786-0 celler, og at yderligere HIF-1β kan rekrutteres til DNA bindingssteder efter øget udtryk for en dimerisering partner.

Analyse af HIF-1α bindende tilkendegivet, at dens pan-genom fordeling var påfaldende ikke-tilfældige, bliver stærkt beriget tæt til bestemte klasser af gen-promotor (fig 1C og 1D) og ligner HIF-1a-specifikke mønstre af bindende i andre celletyper [10,20,22,39]. Annotation af HIF-1α ‘nærmeste-nabo’ promotorer, ifølge transkript klasse, afslørede, at 68% er forbundet med protein-kodende gener, hvor resten stort set forbundet med lange ikke-kodende RNA’er (lncRNAs) og antisense RNA’er (Fig 1D ); proportioner, der ligner dem, der er rapporteret for HIF-1α i MCF7 brystkræftceller [39].

Vi næste forsøgt at definere de funktionelle virkninger af denne nye HIF-1α bindende for genekspression. Pan-genomisk genekspression blev profileret i kontrol- og HIF-1a re-udtrykkende celler ved RNA-seq. Gener blev rangordnet efter en kombination af fold-ændring i udskrift niveau efter re-ekspressionen af ​​HIF-1α og betydningen af ​​denne ændring [35]. Brug af denne ranking, gensæt berigelse analyse (GSEA) [34] af den nærmeste gen til hver HIF-1α bindingssted viste en højsignifikant (p 0,001) associering mellem HIF-1α binding og positiv, men ikke negativ, regulering af disse transkripter (fig 1E). Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater, som HIF fungerer hovedsageligt som en transkriptionel aktivator [10,19]. Det viser også, at den nye HIF-1α binding er funktionel, og har direkte og stort set positive effekter på udtryk i store antal gener.

I modsætning hertil observerede vi nogle virkninger af HIF-1α re-udtryk på udskrift niveauer af (nærmeste nabo) HIF-2α bindende gener. GSEA viste en positiv, men ikke-signifikant (p = 0,15) effekt af HIF-1α re-udtryk på ekspressionen af ​​HIF-2a bindende gener (S6 Fig), formentlig som en direkte effekt af HIF-1α binding til nogle af disse sites (fig 3C). Vigtigere var der ingen tegn på stor skala nedregulering af HIF-2a bindende gener (dvs. ingen berigelse af HIF-2α bindende gener blandt de nedreguleret gener) som en konsekvens af HIF-1α re-ekspression i 786-O-celler. Dette bekræfter den konstatering, at re-udtrykte HIF-1α ikke væsentligt modvirker HIF-2α aktivitet på tværs genomet.

Overekspression af HIF-2a yderligere aktiverer sine endogene mål

Da overekspression af HIF- 2α i 786-O-celler har den modsatte effekt på tumor xenograft vækst til at re-ekspression af vildtype-HIF-1α [11], vi næste undersøgt virkningen af ​​stigende HIF-2α niveauer på HIF binding og genekspression. Vi først søgte at skelne, om binding af HIF-2α i VHL defekte 786-O celler er mættet eller om overekspression af HIF-2α ville øge binding på steder, der allerede er besat i kontrol celler. For at teste denne, vi korreleret styrken af ​​HIF-2α bindingssignaler i celler, der overudtrykker transficeret HIF-2α med den i kontrolceller. Dette afslørede en stigning i både HIF-2α signaler og HIF-1 p signaler ved størstedelen af ​​endogen HIF-2a bindingssteder efter HIF-2α overekspression (S7 Fig) at endogene niveauer af HIF-2α i 786-0 celler ikke er tilstrækkelige til fuldt ud at indlæse disse HIF-2α bindingssteder.

Omfattende ikke-kanonisk binding af overudtrykt HIF-2α

Bemærkelsesværdigt dog pan-genomisk analyse afslørede i alt 5283 diskret HIF-2a bindingssteder i de 786-0 celler overudtrykker HIF-2α. Disse steder omfatter mange af dem besat af endogen HIF-2α. I modsætning til resultaterne efter re-ekspressionen af ​​HIF-1α, zonekort analyse af HIF-2α og HIF-1β bindende viste, at mange af disse steder er udelukkende besat af HIF-2α, uden HIF-1β (figur 2A, sammenligne iii og iv). Overensstemmende med dette, afslørede PCA-analyse, at transficeret HIF-2α og HIF-1β bindende co-variere mindre udførligt i celler, der overudtrykker transficeret HIF-2α end i kontrolcellerne (figur 2B).

(A) HIF- 2a bindingssteder i HIF-2α overudtrykker celler blev identificeret ved peak kald og rangeret på den lodrette akse ifølge signalintensitet. Varme kort af disse sites (± 5 kb på vandrette akse) viser chip-seq read densitet for de angivne HIF subunits blev frembragt for både kontrol- celler (i, ii), og cellerne med HIF-2α overeksprimeres (III, IV). I modsætning til re-udtrykte HIF-1α, overudtrykt HIF-2α binder til et stort antal lokaliteter (sammenlign I og III), uden HIF-1β (sammenlign III og IV) og har ringe effekt på fordelingen af ​​HIF-1β ( sammenligne II og IV). (B) Biplot viser Principal Component Analysis (PCA) chip-seq signal intensitet (RPKM værdier) for både individuelle bindingssteder (prikker) og HIF-underenheder (vektorer) på tværs af alle HIF-bindingssteder identificeret i kontrol celler og i HIF- 2α overudtrykkende celler. Steder bindende endogene HIF-2α i kontrol- celler er vist med blåt, mens sites bindende re-udtrykte HIF-1α er vist i rødt, websteder bindende både er farvet lilla og de resterende arealer er farvet grå. PCA for HIF underenheder viser, at HIF-2α og HIF-1β co-variere mere i kontrol- celler (sammenligne HIF2α (VA) og HIF1β (VA)) end i de overekspression celler (sammenlign HIF2α (2αOE) og HIF1β (2αOE) ). (C) Histogram af afstanden til nærmeste transkriptionsstartstedet (TSS) for HIF-2α bindingssteder i celler, der overudtrykker HIF-2α. (D) HIF-2α bindingssteder i HIF-2a overudtrykker celler blev kategoriseret efter klassen (Ensemble) af den nærmeste genet. Den relative hyppighed af hver klasse fremgår af cirkeldiagrammet. sæt berigelse Gene analyse (GSEA) for sættet af gener nærmest (E) HIF-2a bindingssteder i kontrol- celler og (F) nyligt identificerede HIF-2α bindingssteder i overekspression celler, når generne er rangeret efter til mappe forandring og betydning i mRNA-ekspression efter overekspression af HIF-2α (vandret akse).

Som med HIF-1α binding i re-udtrykkende celler, fordelingen af ​​transficerede HIF-2a bindingssteder var påfaldende ikke Ensartede tværs genomet (fig 2C og 2D). Interessant, på trods af den store stigning i antallet af websteder, de var i overensstemmelse med et mønster, der svarer til den observeret for endogen HIF-2α i begge disse (S8 Fig) og ikke-CCRC (MCF7) celler [10,39], men adskiller sig fra, at der for HIF-1α. I modsætning til HIF-1α, var fordelingen mere promotor-distale (fig 2C). Endvidere som med de endogene HIF-2α bindende mønstre, annotation af ‘nærmeste nabo’ gener viste, at en væsentlig større andel var på ikke-kodende gen loci, end der blev observeret for re-indføres eller endogen HIF-1α (Fig 2D). Disse forskelle mellem HIF-a-isoformer, som blev observeret uanset celletype ekspressionsniveau eller antal lokaliteter bundet, tyder på, at evnen til at genkende promotor- fjern enhancere på ikke-kodende gen loci versus promotor proximale sites er en medfødt egenskab ved HIF- α isoformer.

Endelig har vi forsøgt at identificere, om øget belastning af eksisterende HIF-2α bindingssteder, eller binding af HIF-2α på nyligt fundne steder, eller begge, er forbundet med funktionelle virkninger på genekspression. Vi bruges GSEA at teste berigelse af HIF-bindende loci (nærmeste-nabo-gener) blandt gener, hvis ekspression blev ændret af HIF-2α overekspression (som målt ved RNA-seq). Vi udførte denne analyse for både de bindingssteder, der blev besat af endogen HIF-2α, og dem, der var nyligt observeret efter HIF-2α overekspression. En forening med positive, men ikke negativ, blev effekter på genekspression observeret for begge grupper af bindende loci (Fig 2E og 2F). Således konstitutiv aktivering af HIF-2α i 786-0 celler er submaksimal og stigende HIF-2α fører til både kvantitative og kvalitative effekter på HIF target genekspression.

Interessant, tæt inspektion af de tilsyneladende nye bindingssteder ofte afslørede lave niveauer af HIF binding på disse steder i kontrol- celler, som var under grænseværdien for identifikation af signifikant binding, men over dem, der observeres ved et sæt af kontrol regioner (S9A Fig). Dette antyder, at disse signaler er i virkeligheden ‘rigtige’ og afspejler ujævn belastning af potentielle HIF bindingssteder (S9B Fig).

Analyse af HIF-2α og HIF-1α bindende motiver

Da HIF -1 og HIF-2 er rapporteret at genkende en identisk kerne-DNA bindende sekvens [10], er det uklart, hvorfor binding af HIF-1α og HIF-2α er fordelt så forskelligt. For at løse dette startede vi ved at analysere de immunopræcipiterede sekvenser for transskriptionsfaktorbindende motiver under anvendelse MEME-chip. Som forventet, den kanoniske HRE motiv (Jaspar /MA0259.1) [40] blev beriget i alle sæt bindingssteder; der optages af endogen HIF-2α, overudtrykt HIF-2α og re-udtrykte HIF-1α og berigelse var positivt korreleret med styrken af ​​HIF-1β signal (Fig 3A og 3B og S8C Fig, blå linje). Den anden mest berigede motiv var en AP-1 (TRE) bindende motiv (Jaspar /MA0491.1) [40]. Interessant nok blev dette berigelse helt anderledes fordelt mellem HIF-1α og HIF-2α binding loci. Stærk berigelse blev observeret i sekvenser binder overudtrykt HIF-2α (Fig 3B). Men i skarp kontrast til HRE motiv, i bindingen sæt til overudtrykt HIF-2α, blev berigelse af AP-1 motiv omvendt korreleret med styrken af ​​HIF-1β-binding (figur 3B). Endvidere i sættet af HIF-1α binding loci, AP-1 bindende motiv blev signifikant depleteret (Fig 3A). Samlet den differentielle fordeling af denne AP-1-motivet mellem HIF-1α og HIF-2α bindende loci var stærkt signifikant (p 10

-16).