PLoS ONE: transskriptionsprofilering af ikke-småcellet lungekræft Celler med Aktivering EGFR Somatisk Mutations

Abstrakt

Baggrund

Aktivering somatiske mutationer i

epidermal vækstfaktor receptor

(

EGFR

) giver unikke biologiske funktioner, ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler, men de transkriptionelle mediatorer af EGFR i denne undergruppe af NSCLC er ikke blevet fuldt belyst.

Metode /Principal resultaterne

Her brugte vi genetiske og farmakologiske metoder til at belyse transcriptomes af NSCLC cellelinjer. Vi transkriptionelt profileret et panel af

EGFR

-mutant og -Wild-typen NSCLC cellelinjer dyrket i nærvær eller fravær af en EGFR-tyrosinkinaseinhibitoren. Hierarkisk analyse afslørede, at cellelinierne adskilt på grundlag af

EGFR

mutationsstatus (mutant versus vildtype), og ekspressions underskrifter blev identificeret ved overvåget analyse, der adskiller de cellelinjer baseret på mutationsstatus (vildtype versus mutant) og type af mutation (L858R versus Δ746-750). Ved hjælp af en

EGFR

mutationsspecifikke udtryk signatur som en sonde, vi minerede genekspressionsprofilerne af to uafhængige kohorter af NSCLC patienter og fandt signaturen i en delmængde. EGFR tyrosinkinaseinhibitoren behandling reguleret ekspression af flere gener, og farmakologiske hæmning af protein produkter fra to af dem (

PTGS2

og

EphA2

) hæmmede forankringsuafhængig vækst i

EGFR

-mutant NSCLC celler.

konklusioner /betydning

Vi har belyst gener ikke tidligere er forbundet med

EGFR

-mutant NSCLC, hvoraf to forbedret clonogenicity af disse celler, idet der skelnes disse mediatorer fra andre tidligere vist at opretholde celleoverlevelse. Disse resultater har potentiel klinisk relevans givet tilgængeligheden af ​​farmakologiske værktøjer til at hæmme protein produkter af disse gener

Henvisning:. Choi K, Creighton CJ, Stivers D, Fujimoto N, Kurie JM (2007) transskriptionsprofilering af ikke -Små Cell Lung Cancer Cells med Aktivering

EGFR

somatiske mutationer. PLoS ONE 2 (11): E1226. doi: 10,1371 /journal.pone.0001226

Academic Redaktør: Janet Kelso, Max Planck Instituttet for Evolutionær Antropologi, Tyskland

Modtaget: September 6, 2007; Accepteret: November 1, 2007; Udgivet: November 21, 2007

Copyright: © 2007 Choi et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af National Cancer Institute giver P50 CA70907, P30 CA125123, og R01 CA117965

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Behandling med epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) tyrosinkinaseinhibitorer (TKI’er) fører til hurtig og vedvarende tumor krympning i en undergruppe af patienter med ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [1] – [3]. Tumorcellerne i disse patienter har somatiske mutationer i

EGFR

kinase domæne, der konstitutivt aktiverer EGFR [1] – [3]. De aktiverende mutationer identificeret hidtil klynge i regionen, som koder for kinasedomænet (exonerne 18-21) og er oftest enten Δ746-750 deletion eller L858R punktmutationer [1] – [3]. Musemodeller konstrueret til at undersøge onkogenicitetsstudie af mutant

EGFR

udvikle invasive lunge adenokarcinomer der relatere efter behandling med EGFR TKI’er [4; 5]. Immortaliserede humane bronkiale epitelceller erhverve maligne egenskaber efter transfektion med mutant

EGFR

[6]. Behandling med EGFR TKI’er inducerer apoptose af disse

EGFR

transficerede celler og NSCLC celler med somatiske mutationer i

EGFR

[7; 8]. Således beviser fra menneske, mus, og cellulære modeller viser, at mutant

EGFR

er onkogen og giver afhængighed af EGFR for NSCLC celle overlevelse.

Styrken af ​​mutant

EGFR

som et onkogen understøttes af beviser på, at dets biokemiske egenskaber afviger markant fra dem af vildtype EGFR. EGFR-kinase domæne konstitutivt aktiveret af de somatiske mutationer, og det viser forøget binding og følsomhed over for EGFR TKI’er [9] – [11].

EGFR

-mutant NSCLC celler udtrykker typisk høje EGFR og dets dimere partnere ErbB2 og ErbB3 og flere ErbB-ligander, som alle potenserer EGFR-afhængig signalering [8]. Flere signalveje er konstitutivt aktiveret i disse celler, hvoraf nogle har vist sig at fremme celle overlevelse. For eksempel EGFR danner et heterodimert kompleks med ErbB3, som binder til og direkte aktiverer phosphatidylinositol 3-kinase og opretholder cellens overlevelse gennem AKT-afhængige mekanismer [12]. Andre pro-overlevelse signaler medieres gennem Src familie kinaser, som konstitutivt aktiveret i

EGFR

-mutant NSCLC celler [13, 14].

I modsætning til fremskridtene inden belyse mediatorer af celle overlevelse, er blevet gjort mindre fremskridt i forståelsen af ​​de mekanismer, som mutant

EGFR

giver andre neoplastiske egenskaber, såsom evnen til at migrere, invadere, formere sig en ankerplads-uafhængig måde, og fremme angiogenese. Her søgte vi at identificere de mediatorer ved at forespørge de transcriptomes af et panel af NSCLC cellelinier, er blevet karakteriseret for tilstedeværelsen af ​​

EGFR

mutationer. Vi fandt en transkriptionel profil på

EGFR

-mutant NSCLC celler, der omfattede gener ikke tidligere har været kendt for at være EGFR-afhængig. Selvom rækken af ​​cellulære funktioner tilskrives disse gener er bred, er mange af dem forbundet gennem kendte eller forudsete protein-interaktion netværk. Konklusionen er, at transskriptionsprofilen identificeret i

EGFR

-mutant NSCLC celler har informeret os om biologiske processer og potentielle terapeutiske mål, der kunne være effektiv hos patienter med denne sygdom.

Resultater

Transkriptionel Analyse af NSCLC cellelinier

Vi anvendte et panel af otte NSCLC cellelinier (tabel 1), som var blevet karakteriseret for tilstedeværelsen eller fraværet af somatiske

EGFR

mutationer (fem cellelinier med sådanne mutationer og tre uden) og

Ras

mutationer (to cellelinjer med sådanne mutationer og seks uden). Af de fem

EGFR

-mutant cellelinjer, tre havde exon 19 deletionsmutationer (Δ746-750) (HCC827, HCC2279, H4006), en havde en exon 21 punktmutation (L858R) (H3255) og en havde L858R i kombination med T790M gatekeeper mutation, der giver resistens over for EGFR TKI’er (H1975). Af de tre

EGFR

-Wild-type cellelinjer, en havde en somatisk mutation i

N-ras

(H1299), og én havde en

K-ras

mutation (H460). RNA blev ekstraheret og fremstillet ud fra celler, efter at de var blevet dyrket i 2 timer ved 70% konfluens i nærvær eller fravær af EGFR TKI-gefitinib (1,0 uM). Denne varighed TKI behandling blev valgt for at identificere de tidligste transkriptionelle begivenheder induceret af EGFR inhibering og for at minimere detektering af genekspression ændringer som følge af apoptose. RNA blev udsat for Affymetrix genekspression profilering, og profilerne blev undersøgt for forskelle i genekspression ved baseline og efter TKI behandling.

Vi først undersøgte

EGFR

mutations status som klassifikator af de transskriptionelle profiler. Hierarkisk analyse viste gruppering af de cellelinjer baseret på mutationsstatus;

EGFR

-mutant cellelinjer klart adskilt fra de -Wild-type cellelinier (fig. 1). Der var dog ingen klar adskillelse mellem de to typer mutationer (L858R versus Δ746-750) (fig. 1). Ved overvåget analyse ved hjælp af specifikke kriterier (mindst 2,0 gange stigning eller et fald i 50%

EGFR

-mutant cellelinier i forhold til den for vildtype,

P

0,05) blev 194 unikke gener identificeret som adskiller den

EGFR-

mutant cellelinjer fra -Wild-type cellelinier. Disse gener er opført i File S1 og illustreret i et cluster varme kort i fig. 2

A

. Vi undersøgte 29 af de 194 gener ved kvantitativ PCR og valideret, at 19 (68%) af dem blev differentielt udtrykt mellem

EGFR

-mutant og -Wild-type cellelinier (File S2).

dendrogram der viser slægtskabet af ekspressionsprofiler fra cellelinier behandlet med (+) eller uden (-) gefitinib. Tilstedeværelsen eller fraværet af

EGFR

somatiske mutationer og typen af ​​mutationer, herunder L858R punktmutation (P) eller Δ746-750 deletionsmutation (D), er vist. WT, vildtype.

(A)

En 194-gen signatur, der adskiller

EGFR

-Wild-type (WT) fra -mutant NSCLC celle linjer (behandlet med [+] eller uden [-] gefitinibs) er på linje med de udtryk profiler fra

(B)

Michigan kohorten (86 patienter) og Harvard kohorten (84 patienter) og

( D)

MCF-7-celler transficeret med de viste gener. En liste over de gener, der overlappede i alle tre datasæt er angivet på den yderste højrefløj. (

C

) Antal patienter i Michigan og Harvard kohorter manifesterer mutant

EGFR

ekspressionsmønstre (

P

0,05, Pearsons korrelation), sammen med det antal manifesterer en tilfældigt genereret mønster (SD baseret på 100 simulationer). (

E

) Venn-diagram illustrerer overlap mellem underskrifter fra

EGFR

-mutant NSCLC celler og

EGFR

transficerede MCF-7 celler.

Identifikation af Mutant

EGFR

underskrift i grupper af patienter med NSCLC

Vi næste forespørges offentligt tilgængelige genekspression databaser tumor biopsi prøver stammer fra to uafhængige kohorter af patienter med NSCLC fra USA (15, 16) for at afgøre, om en delmængde af tumorer udtrykte denne genetiske signatur. Af de 194 gener, blev 102 (53%) repræsenteret i profilering platform, der anvendes i Harvard kohorte, og 65 (34%) var repræsenteret i Michigan kohorte. Baseret på en zonekort repræsentation af deres genekspressionsmønstre, de menneskelige lungetumorer var heterogene i deres ekspressionsmønstre; dog en delmængde af tumorer (9 af 84 [11%] i Harvard kohorte og 10 i 86 [12%] i Michigan kohorten) udviste et ekspressionsmønster svarende til den i

EGFR

-mutant NSCLC gen signatur (fig. 2

B

).

for at afgøre, om de observerede ved zonekort analyse ligheder nåede statistisk signifikans blev parametre skabt, defineret lighed som et positivt Pearsons korrelation af

P

0,05 (tosidet) mellem mutant

EGFR

signatur mønster og genekspressionen værdier tumoren, idet der tages hensyn til både de over- og under-udtrykte gener i signaturen. Med denne definition, vil tumorer manifesterer denne signatur rekapitulere de mønstre af over-og under-udtryk observeret i de

EGFR

-mutant cellelinjer. Forekomsten af ​​tumorer manifesterer signaturen var statistisk signifikant (

P

0,01 for hver kohorte). Baseret på simuleringer med 100 tilfældigt udvalgte gen underskrifter genereret fra hver af kohorter (. Figur 2C)

Selv om

EGFR

mutationsstatus af tumorer fra disse patientgrupper kohorter har, så vidt vi ved, ikke blevet rapporteret,

K-ras

(codon 12, 13, eller 61) er kendt for at muteres i 29% og 45% af tumorerne fra Harvard og Michigan kohorter, henholdsvis [15; 16]. Somatiske mutationer i

EGFR

K-ras

udelukker hinanden i NSCLC [17], hvilket har ført efterforskerne at hypotesen, at disse begivenheder er genetisk overflødige, og at en ændring i begge gener ikke giver en yderligere fordel, når disse begivenheder optræder sammen i den samme celle [17]. Vi postulerede, at hvis disse somatiske begivenheder er genetisk overflødige, så har de

K-ras

mutation vil giver mutant

EGFR

transkriptionel profil. I overensstemmelse med denne idé, vi bemærkede, at

K-ras

mutationsstatus korreleret, omend svagt, med mutant

EGFR

gen signatur (fig. 2

B, P

= 0,07 og

P

= 0.04 i Harvard og Michigan kohorter, henholdsvis ved Wilcoxon rank-sum test af kohorte profiler bestilt af gennemsnitlig ekspression af gener, der blev øget i

EGFR

-mutant celle linjer).

Mutant

EGFR

signatur Beriget med EGFR-afhængig gener

for at undersøge, om nogle af generne i den 194-genet signatur var reguleret i en EGFR-afhængige måde, vi forespørges en offentligt tilgængelig database over MCF-7 brystkræftceller, som var blevet stabilt transficeret med konstitutivt aktive kinaser (

Raf1

,

MEK1

,

ErbB2

) eller med vildtype

EGFR

, som blev aktiveret ved behandling kortvarig EGF [18]. Vi undersøgte overlap mellem gen underskrifter fra

EGFR

transficerede MCF-7 celler og

EGFR

-mutant NSCLC celler. Af de 194 gener i mutanten

EGFR

underskrift, 139 (72%) var repræsenteret på profilering platform for MCF-7 celletransfektanter (11079 gener i alle var repræsenteret i både MCF-7 og NSCLC datasæt ). Analyse af disse 139 gener viste, at delmængder af de gener, der blev forøget i MCF-7-celler på grund af MEK, Raf1, eller EGFR transfektion overlappede med dem i mutanten

EGFR

ekspressionssignatur i NSCLC-celler (fig. 2

D

).

af de 119 gener, der begge blev repræsenteret i MCF-7 datasæt og steg i

EGFR

-mutant NSCLC celler, 44 (31%) var øget med

P

0,05 i

EGFR

transficerede MCF-7 celler, som repræsenterede en meget betydelig overlapning (

P

1E-12, ensidig Fishers eksakte test, fig. 2

E

). Ved et tilfælde, ville 14 af de 119 gener forventes at overlappe, hvilket indikerer, at mængden af ​​overlap vi observeret oversteg, hvad man kunne forvente, hvis

EGFR

transficerede MCF-7 celler og

EGFR

-mutant NSCLC celler intet biologisk tilfælles med hinanden. Når vi brugte en strengere cut punkt

P

0,01 i stedet for

P

0,05 for at definere gener, der blev øget i

EGFR

transficerede MCF-7 celler (576 gener i alt), 28 overlappet med det mutante EGFR NSCLC signatur (chance forventes af syv gener,

P

1E-10, ensidet Fishers eksakte test). Vi konkluderede, at, baseret på sine fællestræk med signaturen fra

EGFR

transficerede MCF-7 celler, underskrift fra

EGFR

-mutant NSCLC celler beriget for gener transkriptionelt opreguleret af EGFR .

Identifikation af

PTGS2

som et gen der kræves for forankringsuafhængig vækst

De gener, der blev udtrykkes forskelligt i

EGFR

-mutant NSCLC cellelinjer faldt i en bred vifte af funktionelle grupper (kategoriseret i Gene ontologi Molecular funktioner, www.geneontology.org) (Filer S3 og S4). Kategorierne med højeste repræsentation var signaltransduktion, stofskifte, immunrespons, ion transport og cellecyklus og spredning. Gener i disse kategorier, der var højt udtrykte omfattede disse koder ErbB-ligander (

TGFa, AREG

, og

ereg

), cyclooxygenase-2 (

PTGS2

), en ligand for den CX3CR1 kemokinreceptor (

CX3CL1)

, intracellulære og transmembrane kinaser (

TRIB2, MET, MYLK, STK39, ACVR1, TAOK3, og IFIH1

), proteinphosphataser (

PTPN22, DUSP10 , PPAP2B, PTPRR

og

PTPRE

), en lipid fosfatase (

SGPP2

), adhæsionsmolekyler (

CEACAM6, ITGAV, PCDH7

og

THBS1

), og calcium-ion-bindende proteiner (

S100A14

S100A16

).

For at undersøge, om disse differentielt udtrykte gener, som har forskellige biologiske funktioner, var en del af en eller flere signaltransduktion netværk, vi analyserede deres positioner inden kendte eller forventede globale protein interaktion netværk (interactomes) ved hjælp af HiMAP software program (https://www.himap.org/index.jsp). Interactomes identificeret ved denne fremgangsmåde er organiseret i en serie af modulære strukturer karakteriseret ved centralt beliggende knudepunkter (kaldet hubs), der har flere forbindelser med andre proteiner [19]. Selv om denne fremgangsmåde er rent sonderende og bærer ingen statistisk vægt, resultater i gær, viser, at centrale i et protein interactome forudsiger et proteins biologiske betydning [20].

Af de 194 differentielt udtrykte gener, var 118 blevet kommenteret i Gene ontologi, hvoraf 102 blev inkluderet i HiMAP program (19). Af disse 102 gener, 52 kortlagt i et enkelt netværk (fig. 3). De knudepunkter i netværket med de højeste antal links (≥ 10) inkluderet

CD44, MET, IRS1, GRB10, ITGA2, PTGS2, og THBS1,

som alle blev stærkt udtrykt i

EGFR

-mutant NSCLC-celler, hvilket indikerer, at nogle af de differentielt udtrykte gener var på centrale positioner af denne signalering netværk.

Teoretisk protein-protein fysiske og funktionelle interaktion kort (interactome) blev udarbejdet under anvendelse HiMAP software. Gener fra signaturen er angivet med rødt.

I lyset af det centrale i den

PTGS2

gen i interactome netværket og den kendte betydningen af ​​dets genprodukt cyclooxygenase-2 (COX -2) i overlevelse og metastase af cancerceller og dens potentielle kliniske effekt givet tilgængeligheden af ​​farmakologiske værktøjer til at hæmme dets enzymatiske funktion [21], søgte vi at undersøge sin rolle i

EGFR

-mutant NSCLC celler. Vi undersøgte, om cyclooxygenase-2-inhibitor celecoxib modvirkede evnen af ​​disse celler til at proliferere i monolagskulturer og til at danne kolonier i blød agar. Brug af celecoxib ved lave doser (0,5 uM og 1,0 uM) for at minimere ikke-specifikke virkninger, kolonidannelse i blød agar faldt på en dosis-afhængig måde (Fig. 4), hvorimod proliferation i monolag ikke ændrede (data ikke vist).

Repræsentative billeder af kolonier af NSCLC cellelinier (øvre paneler) blev kvantificeret (lavere paneler) efter dyrkning af dem i blød agar i nærværelse eller fravær af celecoxib. Resultaterne er de hjælp af mindst tre uafhængige forsøg.

cellelinjer med

EGFR

sletninger og punktmutationer har forskellige Expression Profiles

Blandt patienter med

EGFR

-mutant NSCLC, forskelle i overlevelse varighed og lydhørhed til EGFR TKI behandling er blevet observeret, afhængigt af typen af ​​

EGFR

somatisk mutation (exon 21 punktmutationer versus exon 19 sletninger) [22; 23] , hvilket antyder, at disse to typer af somatiske mutationer giver distinkte biologiske egenskaber til NSCLC-celler. Støtte denne mulighed er bevis for, at disse to typer af somatiske mutationer giver distinkte biokemiske egenskaber til EGFR [9] – [11]. Selvom hierarkisk klyngedannelse ikke adskille de to typer af mutationer i to adskilte undergrupper (fig. 1), vi hypotese, at overvåget analyse ville afsløre transkriptionelle forskelle mellem de to typer mutationer. Faktisk blev der observeret klare transkriptionelle forskelle. Brug specifikke kriterier (

P

0,01, mindst to gange ændring), identificerede vi et 270-gen signatur i

EGFR

-mutant cellelinier (som ikke var til stede i

EGFR

-Wild-type cellelinier), som adskiller de to typer mutationer. Disse gener er opført i File S5 og illustreret i et cluster varme kort i fig. 5. Vi undersøgte 7 af de 270 gener ved kvantitativ PCR og valideret, at 4 (57%) differentielt blev udtrykt mellem cellelinier med L858R mutationer versus dem med Δ746-750 mutationer (File S6). Den 270-genet signatur blev analyseret for berigelse i bestemte gen-funktioner som defineret af Gene ontologi Signatur Database. L858R-mutant celler blev beriget for gener i cyklisk AMP-afhængige protein kinase, protein fosfatase-2ε-, Ras-familiemedlem RAB3D-, og phospholipase-Cβ1-afhængige veje, mens de Δ746-750 mutanter blev beriget for gener i CXC chemokin ligander (2 og 3) -, integrin α6-, guanylat bindende proteiner (1, 2, og 3) – og interleukin-7 og 10-afhængige pathways (File S7), hvilket viser, at de gensæt aktiveret af to mutation typer er funktionelt forskellige.

En 194-gen signatur til stede i

EGFR

-mutant men ikke EGFR-vildtype cellelinjer skelner L858R (PM [punkt mutation]) fra Δ746- 750 (tekst udgår). Celler blev behandlet med (+) eller uden (-) gefitinib. En delvis liste over de gener, der udtrykkes differentielt i de to grupper er angivet til højre.

Gener Reguleret af EGFR TKI behandling

For at identificere genekspression ændringer, der gik forud, og muligvis bidrog til, de biologiske virkninger af EGFR TKI behandling på

EGFR

-mutant NSCLC celler, cellerne blev udsat for kortvarig behandling med gefitinib. Som en negativ kontrol i dette forsøg anvendte vi de TKI-resistente H1975 celler, som har en T790M mutation, der blokerer binding til EGFR TKI [17]. Brug specifikke kriterier (

P

0,05), fandt vi, at 54 gener blev reguleret af TKI udelukkende i TKI-følsomme cellelinier (HCC827, H3255, og H4006) (File S8), hvoraf ingen har , så vidt vi ved, er rapporteret at være EGFR-afhængige gener. Blandt disse gener undersøgte vi 14 ved kvantitativ PCR og valideret, at 10 (71%) differentielt reguleret i TKI-sensitive og resistente celler (File S9). Gener, at øget reaktion på TKI inkluderet blandt andet cellecyklus regulatorer (

CCNG2, CDKN1B, ID2, og KNTC2

) og en ligand for EphA2 (EFNA1). Gener, der faldt omfatter

EphA2

receptortyrosinkinase, cytokiner (

LIF, CCL20,

IL17B

), transkriptionsfaktorer (

FOXD1

POU1F1

), og protein fosfataser (

DUSP4

DUSP6

).

gensidig forordning af EphA2 og EFNA1 er EGFR-afhængig

i betragtning af betydningen af ​​de EphA aksen i tumorigenese [24; 25], vi yderligere undersøgt virkningerne af TKI behandling på ekspressionen af ​​EphA2, andre EPHA familiemedlemmer og deres ligand EFNA1. Kvantitativ PCR og western analyse bekræftede, at gefitinib gensidigt reguleret ekspression af EphA2 og dens ligand EFNA1 i TKI-følsomme cellelinier (HCC827, H4006, og H3255), men ikke i TKI-resistente H1975 celler (Fig. 6

A- C

). EphA1, gjorde EphA5, og EphA6 ikke ændre sig med gefitinib behandling (Fig 7

A, E, og F

.); EphA4 faldt i kun en delmængde af TKI-sensitive celler (H4006 men ikke HCC827) (figur 7

C

.); og EphA3 blev hæmmet i en EGFR-uafhængig måde (angivet med TKI-induceret undertrykkelse i H1975 celler) (fig. 7

B

). Til mere fuldt ud at evaluere, om undertrykkelse af EphA2-ekspression blev EGFR-medieret, undersøgte vi effekten af ​​en anden EGFR TKI, erlotinib, og fandt, at det alt for hæmmede EphA2-ekspression i TKI-følsomme celler, i et omfang, der svarer til gefitinib (Fig . 7

F

).

Kvantitativ PCR-analyse

(A, B)

og western blotting

(C)

af EphA2

(A , C)

EFNA1

(B, C)

i cellelinjer behandlet i 6 timer med (+) eller uden (-) gefitinib. Kvantitative PCR-resultater repræsenterer hjælp af mindst tre uafhængige forsøg og blev normaliseret baseret på ekspression af housekeeping-genet L32. Tallene under bands er resultatet af densitometrisk analyse efter normalisering til indlæsning forskelle baseret på actin.

Celler blev behandlet i 6 timer med bil, 1 pM gefitinib (A-E), eller 1 pM erlotinib (F). RNA blev ekstraheret og underkastet kvantitativ PCR. Resultaterne repræsenterer hjælp af mindst tre uafhængige forsøg og blev normaliseret baseret på L32 udtryk.

EphA2 aktivering kræves for Anchorage-Uafhængig vækst

Vi postuleret, at EphA2 signalering opretholder neoplastiske funktioner af NSCLC-celler og testet denne hypotese ved behandling HCC827 celler med EphA2-Fc, et rekombinant peptid indeholdende EphA2 ekstracellulære domæne fusioneret til F

c fragment af IgG, hvilket forhindrer interaktionen af ​​ephrin a ligander med endogen EPHA, effektivt blokerer EPHA aktivering [26]. Forhold til den for kontrollen, EphA2-Fc-behandlede celler udviste nedsat kolonidannelse i blød agar (fig. 8), mens deres proliferation i monolagskulturer ikke ændrede (data ikke vist), hvilket indikerer, at EPHA var nødvendig for forankringsuafhængig proliferation af disse celler.

Repræsentative billeder af kolonier af NSCLC cellelinier (top) med kvantificering af kolonier (nederst) efter vækst i blød agar i nærværelse eller fravær af EphA2-Fc. Resultaterne er de hjælp af mindst tre uafhængige forsøg.

Diskussion

Her rapporterer vi, at NSCLC celler med somatiske

EGFR

mutationer har en unik transkriptionel profil, og at cellelinjer med de to mest almindelige typer af

EGFR

mutationer har klart transkriptionelle forskelle. Ved minedrift genekspression databaser under anvendelse af en mutant

EGFR

-specifik signatur som en probe, fandt vi at mange af generne i dette udtryk signatur var EGFR-afhængig, konvergeret til fælles net på grundlag af kendte eller forudsagte protein interactomes, og blev udtrykt i tumorer fra en undergruppe af patienter med NSCLC. To gener blev belyst,

EphA2

PTGS2

, der fremmet clonogenicity af

EGFR

-mutant NSCLC celler, som er af særlig interesse fra et klinisk synspunkt, fordi de kan hæmmes farmakologisk.

Gener i mutant

EGFR

genekspression signatur koder for proteiner med et bredt sæt af cellulære funktioner. Indflydelsen af ​​EGFR på denne signatur blev demonstreret ved dets overlapning med den af ​​EGFR-transficerede MCF-7 celler og tilstedeværelsen af ​​kendte EGFR transkriptionelle mål, herunder

PTGS2,

de ErbB-ligander

ereg

og

AREG

og

Met

, en receptor tyrosin kinase, der for nylig blev rapporteret til at blive aktiveret i

EGFR

-mutant NSCLC celler og fremme TKI modstand i disse celler [ ,,,0],8; 27-29]. Her viste vi, at genproduktet af

PTGS2

, cyclooxygenase-2, har en vigtig rolle, fremme forankringsuafhængig vækst. Denne signatur indeholdt mange gener, der ikke tidligere er kendt for at være stærkt udtrykt i

EGFR

-mutant NSCLC, herunder

LY96

CX3CL1

, der har kendt immunmodulerende funktioner.

LY96

koder MD2, et tilhørende molekyle er nødvendig for aktiveringen af ​​toll-like-receptor-4, som fremmer celleoverlevelse og inducerer sekretion af immunosuppressive molekyler, der fremmer tumor unddragelse fra immunovervågning [30].

CX3CL1

koder et udskilt protein kaldet fractalkin der rekrutterer CX3CR1 udtrykker naturlige dræberceller og T-lymfocytter til svulsten mikromiljø og dermed fremme naturlige dræberceller-afhængige antitumor svar

in vivo

[31]. På den anden side har fractalkin også demonstreret pro-metastatiske egenskaber baseret på beviser på, at det fremmer tumorcellemigration og forbedrer adhæsion af tumorceller til endotelceller [32; 33].

For at identificere gener reguleres i en EGFR -afhængig måde, vi behandlede

EGFR

-mutant NSCLC celler med gefitinib. To af de gener identificeret ved denne fremgangsmåde,

EphA2

og dens ligand

EFNA1

blev reguleret i en gensidig måde. Potentielt mediere denne virkning af gefitinib, mitogenaktiveret proteinkinase, en downstream effektor af EGFR, hæmmer

EFNA1

udtryk, og dermed aflaste EFNA1-induceret undertrykkelse af

EphA2

udtryk [25]. Desuden har vi fundet, at EphA2 /EFNA1 interaktioner påkrævet for forankringsuafhængig vækst af HCC827 celler, hvilket bekræfter resultaterne fra en tidligere undersøgelse påviser, at v-erbB-afhængig cellulær transformation dæmpes ved EphA2 ligandbindende [25]. Andre gener, vi fandt at være reguleret af gefitinib i TKI-sensitive celler omfatter

CCNG2, CDKN1B, ID2, og KNTC2

, som er komponenter af cellecyklus regulerende veje. I betragtning af, at deres udtryk ændret, før nogen biokemisk tegn på proliferativ anholdelse eller apoptose, kan disse gener være en del af en anti-proliferativ signalering program aktiveres af gefitinib. Endelig to af de gener, der faldt i overflod med gefitinib behandling (

CEACAM-6

og

DUSP6

) blev også stærkt til udtryk i

EGFR

-mutant celler, hvilket tyder på, at disse gener er potentielt vigtige EGFR transkriptionelle mål i disse celler.

sammenfattende har vi identificeret en transkriptom i NSCLC celler, der belyser mutant

EGFR

inducerede genekspression ændringer, og giver en transkriptionel grundlag for de biologiske forskelle observeret i NSCLC med de to mest almindeligt forekommende typer af

EGFR

mutationer. Yderligere analyse af disse gener kan informere os om biologiske processer, der kan bruges til at identificere intracellulære mål for potentiel terapeutisk fordel for patienter med denne sygdom.

Materialer og metoder

Reagenser

Gefitinib (Astra Zeneca Pharmaceuticals, Wilmington, DE) og erlotinib (OSI Pharmaceuticals, Melville, NY) var gaver. Vi købte en rekombinant murin EphA2-Fc-kimær (R GIBCO-BRL, MD), suppleret med 10% føtalt bovint serum (Hyclone, Logan, Utah).

genekspressionsprofilering

RNA’er blev isoleret ved anvendelse af RNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) og hybridiseret til Affimetrix U133 + 2,0 genekspression chips på MD Anderson Cancer center Microarray Core Facility (delvist understøttet af tilskud CA # 16672). dChip (https://www.dchip.org) (2005 udgave) blev anvendt til at ekstrahere ekspressionssystemer værdier for hver probe sæt. Kontrol probe sæt og probe sæt med suffikser “_s_at” og “_x_at” på deres id blev udelukket (fordi disse probe sæt kan målrette mere end en unik sekvens), efterlod 39.114 af 54.675 originale probe sæt til yderligere analyse.

Bestemmelse af differentielt udtrykte gener

To prøve

t

tests (ved hjælp af log-transformerede data) blev anvendt til at bestemme signifikante forskelle i genekspression mellem

EGFR

-mutant og -Wild-type NSCLC cellelinjer og mellem EGFR-transficeret og forældrenes MCF-7 celler (

P

værdier var to-sidet). Til analysen af ​​gefitinib behandlingseffekt, blev en parret forskel beregnes som loggen

2 (gefitinib-behandlet /køretøj-behandlet).

GO berigelse analyse

Funktionelle gen grupper som defineret