PLoS ONE: antitumoraktivitet af Yuanhuacine ved Regulering AMPK /mTOR signalvejen og actincytoskelettet Organization i ikke-småcellet lungekræft Cells

Abstrakt

Yuanhuacine (YC), en daphnane diterpenoid fra blomsterne af

Daphne genkwa

, udstillet en potentiel væksthæmmende aktivitet mod human ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) celler. YC undertrykte også invasionen og migration af lungekræft celler. Men den præcise molekylære mekanismer fortsat, ikke belyst. I den foreliggende undersøgelse rapporterer vi at YC signifikant aktiverede AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) signalvejen og undertrykt mTORC2-medieret nedstrøms signaleringsvej i H1993 humane NSCLC-celler. AMPK spiller en vigtig rolle i stofskiftet energi og cancer biologi. Derfor kan aktivatorer af AMPK signalveje være anvendelig til behandling af cancer. YC forøgede ekspression af p-AMPKα. Samtidig behandling af YC og sammensatte C (en AMPK inhibitor) eller metformin (et AMPK aktivator) også bekræftet, at YC øger p-AMPKα. YC undertrykte også aktiveringen af ​​pattedyr mål for rapamycin (mTOR) udtryk, en downstream mål for AMPK. Yderligere undersøgelser afslørede, at YC modulerer mTORC2-associeret nedstrøms signalveje med en nedsat udtryk for p-Akt, p-proteinkinase C-alpha (PKCa), p-ras-relaterede C3 botulinustoksin substratet 1 (Rac1) og filamentøs actin (F- actin), som vides at aktivere cellevækst og organisere aktincytoskelettet. Desuden YC inhiberede tumorvækst i H1993 celle-implanterede xenotransplantat nøgen musemodel. Disse data tyder på YC kunne være en potentiel kandidat til cancer kemoterapeutika stammer fra naturlige produkter ved at regulere AMPK /mTORC2 signalvejen og aktincytoskelettet organisation

Henvisning:. Kang JI, Hong JY, Lee HJ, Bae SY, Jung C, Park HJ, et al. (2015) antitumoraktivitet af Yuanhuacine ved Regulering AMPK /mTOR signalvejen og actincytoskelettet Organization i ikke-småcellet lungekræft Cells. PLoS ONE 10 (12): e0144368. doi: 10,1371 /journal.pone.0144368

Redaktør: Cong Cao, Suzhou Universitet, KINA

Modtaget: 10. februar, 2015; Accepteret: November 17, 2015; Udgivet: 11. december 2015

Copyright: © 2015 Kang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Basic Science Research Program gennem National Research Foundation Korea (NRF), finansieret af Undervisningsministeriet, Science and Technology (2013R1A1A2012389 og nr 20100024361) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Lungekræft er en af ​​de mest almindelige sygdomme i verden, og den førende årsag til cancer-relaterede dødsfald [1]. Der er to primære former af sygdommen, småcellet lungekræft (SCLC) og ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), hvor NSCLC er ca. 85% af alle tilfælde af lungekræft. Sammen med kirurgi og strålebehandling, kemoterapi er en af ​​de mest almindelige behandlinger for lungekræft terapi. Men kemoterapi er stadig ikke effektive nok til patienter med fremskreden NSCLC med en median overlevelse på ca. et år [2, 3]. Derfor er udvikling af nye potente anticancer midler stadig behov for at behandle sygdommen.

Daphne genkwa

(Dafne-familien) er en velkendt traditionel lægeplante fordelt primært i Korea og Kina, og dens blomst er blevet rapporteret at udvise abortfremkaldende, anti-cancer, hostestillende, vanddrivende, og slimløsende aktiviteter [4]. Adskillige forbindelser, herunder daphnane-typen diterpener er blevet isoleret fra

D

.

genkwa

[5]. Daphane-type diterpenoider viste forskellige biologiske virkninger, herunder anti-cancer, forbigående receptor potentielle kation kanal underfamilie V medlem 1 (TRPV1) aktivering, anti-frugtbarhed, pesticider, neurotrofisk, kolesterolsænkende, anti-hyperglykæmiske, lokalirriterende, tumor-fremmende, og anti-humane immundefektvirus (HIV) aktiviteter [6]. Yuanhuacine (YC) er en vigtig del af daphnane-typen diterpenoider isoleret fra blomsterknopper, af

Daphne genkwa

. YC viste anti-cancer aktivitet i forskellige cancercellelinier

in vitro

[7]. Vi rapporterede også, at YC udviser relativt selektiv vækstinhiberende aktivitet mod humane A549 lungecancerceller forhold til MRC-5 normale lungeepitelceller [8]. Imidlertid har den underliggende molekylære mekanisme YC i humane lungecancerceller ikke blevet belyst endnu.

AMP-aktiveret protein kinase (AMPK) er en allestedsnærværende serin /threoninproteinkinase bestående af en katalytisk α underenhed og to regulator underenheder (p og y) [9], og er kendt for at regulere cellulær energimetabolisme [10, 11]. Aktivering af AMPK er forårsaget af cellulært stress, såsom oxidativt stress, hypoxi, og hypoglykæmi, og det fører til forøget forhold mellem cellulær adenosinmonophosphat (AMP) og adenosintriphosphat (ATP). AMPK styrer også cellevækst, proliferation og autophagy gennem modulation af pattedyr mål for rapamycin (mTOR) aktivitet, som er konsekvent dereguleret i kræftceller [12]. Der er to typer af mTOR, mTORC1 og mTORC2, der strukturelt og funktionelt forskellige multi-protein-komplekser [13]. Generelt mTORC1 kontrollerer cellevækst i respons på næringsstof tilgængelighed og vækstregulerende midler. I modsætning hertil mTORC2 er en vigtig regulator af actin cytoskeleton, der er korreleret med cancermetastase, og styrer phosphoryleringen af ​​Akt ved Ser-473 gennem interaktionen mellem rapamycin-ufølsomme companion af mTOR (Rictor) og mTOR [14, 15].

i nærværende undersøgelse blev den anti-tumor aktivitet af YC og dens underliggende molekylære virkningsmekanismer undersøgt både i humane H1993 lunge kræftceller

in vitro

kultur og i H1993-implanterede xenograft nøgen mus model

in vivo

.

Materialer og metoder

Reagenser

dimethylsulfoxid (DMSO), bicinchoninsyre (BCA), trichloreddikesyre (TCA), sulforhodamin B (SRB), og katalase blev indkøbt fra Sigma-Aldrich, Inc. (St. Louis, MO, USA), Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 medium, føtalt bovint serum (FBS), trypsin-EDTA-opløsning (1X ) blev antibiotisk-antimycotisk opløsning (100X) og phosphatbufret saltvand (PBS) (1X) indkøbt fra HyClone Laboratories, Inc. (South Logan, UT, USA). Anti-p-AMPKα, anti-AMPKα, anti-p-ACC, anti-ACC, anti-p-mTOR, anti-mTOR, anti-p-4EBP1, anti-4EBP1, anti-p-eIF4E, anti-eIF4E, anti-p-P70S6K1, anti-P70S6K1, anti-p-RPS6, anti-RPS6, anti-Rictor, anti-p-Akt, anti-Akt, og anti-E-cadherin blev indkøbt fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA , USA). Anti-PKC-α, anti-p-Rac1, anti-Rac1, anti-PCNA, anti-β-actin, og alle sekundære antistoffer blev købt hos Santa Cruz Biotechnology. (Santa Cruz, CA, USA). Anti-p-Rictor blev erhvervet fra Millipore (Temecula, CA, USA). Anti-p-PKC-α, anti-F-actin, og anti-Ki-67 blev indkøbt fra Abcam (Cambridge, MA, USA). Gefitinib blev købt fra Selleckchem (Houston, TX, USA) og rapamycin blev købt fra Tocris Bioscience (Bristol, UK).

Compound

Yuanhuacine (YC, Fig 1A) blev isoleret og identificeret fra blomsterne af

Daphne genkwa

som tidligere beskrevet [8]. Forbindelsen blev opløst i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) og fortyndet med medium til prøveforberedelse.

(A) Den kemiske struktur af YC. (B) H1993-celler blev behandlet med de angivne koncentrationer af YC og gefitinib i 72 timer. Celleproliferation blev målt ved SRB-assay. (C) H1993-celler blev behandlet med forskellige koncentrationer af YC i de angivne tidsrum, og celleproliferation blev bestemt med SRB-assayet. (D) blev observeret morfologiske ændringer medieret af behandlingen af ​​YC i 24 timer under fasekontrastmikroskop.

Cell Culture

De humane NSCLC cellelinjer (H358, H460, Calu-1, H1299, A549, og H1993-celler) blev indkøbt fra American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA). Cellerne blev dyrket i RPMI1640 tilsat 10% FBS og antibiotika-antimykotika (PSA; 100 enheder /ml penicillin G natrium, 100 ug /ml streptomycin og 250 ng /mL amphothericin B) i en 37 ° C befugtet inkubator med 5% CO

2.

Cell proliferation Assay

effekten af ​​YC på celledeling blev evalueret ved SRB cellulære protein-farvning metode. Cellerne blev podet i plader med 96 brønde med forskellige koncentrationer af prøver og inkuberet ved 37 ° C i en fugtig inkubator med 5% CO

2. Efter 72 timers inkubation blev cellerne fikseret med 10% TCA-opløsning i 30 minutter og farves cellulære proteiner med 0,4% SRB i 1% eddikesyre-opløsning i 1 time. De farvede celler blev opløst i 10 mM Tris-buffer (pH 10,0). Virkningen af ​​prøver på cellelevedygtighed blev beregnet som en procentdel i forhold til opløsningsmiddel-behandlede kontrol. IC

50 værdier blev beregnet ved ikke-lineær regressionsanalyse ved anvendelse af tabel Curve 2D v5.01 software (Systat Software Inc., Richmond, CA, USA).

Western Blot og immunpræcipitationsanalyse

til Western blot-analyse, blev cellerne eksponeret for forskellige koncentrationer af prøver lyseret og proteinkoncentrationer blev bestemt ved BCA-metoden. Totale proteiner (40 ug) i hver cellelysat blev udsat for beslutning om forskellige koncentrationer (6-15%) af natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og elektro-overført til PVDF-membraner. Membranerne blev inkuberet med blokeringsbuffer (5% bovint serumalbumin (BSA) i Tris-bufret saltvand og Tween 20 (TBST) i 1 time ved stuetemperatur og derefter yderligere inkuberet med specifikke antistoffer fortyndet i 2,5% BSA i TBST natten over ved 4 ° C. efter vask med TBST blev membranerne inkuberet med peberrodsperoxidase (HRP) -konjugeret sekundære antistoffer i 2 timer ved stuetemperatur og visualiseret ved HRP-kemiluminescerende detektion kit (Lab Frontier, Seoul, Korea) under anvendelse LAS-4000 Imager ( Fuji Film Corp., Japan).

i immunfældning af det dyrkede medium, cellesupernatanten blev filtreret gennem et 0,2 um filter, og protease- og phosphataseinhibitorer (Roche Applied Science, Penzberg, Tyskland) blev derefter tilsat . for immunpræcipitering af de dyrkede celler, blev cellerne lyseret i IP lysepuffer (50 mM Tris-HCI pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA og 0,5% NP-40) indeholdende protease og phosphataseinhibitorer. Det filtrerede dyrkede medium eller samme mængde cellelysater blev klaret i 30 minutter ved 4 ° C med protein G Sepharose 4FastFlow (GE Healthcare, Little Chalfront, UK). Efter fjernelse af perler (10 min, 12.000 rpm, 4 ° C) blev supernatanten inkuberet med den angivne antistof natten over ved 4 ° C. Immunokomplekset blev opsamlet med perler ved 4 ° C i 2 timer. Perlerne blev vasket fire gange med IP lysepuffer, og de bundne proteiner blev elueret med 2 x Laemmli-prøvepuffer ved 95 ° C i 10 min. De opsamlede proteinprøver blev underkastet western blot-analyse.

Immuncytokemi.

H1993-celler blev sub-dyrket på dækglas overtrukket med poly-L-lysin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA) i en 12-brønds dyrkningsplade. De behandlede celler blev vasket tre gange med kold PBS, og blev fikseret i 2% paraformaldehyd i 15 minutter, efterfulgt af permeabilisering med 0,5% Triton X-100 i PBS i 5 min. Cellerne blev derefter vasket med 0,1% Triton X-100 i PBS (PBS-T) og inkuberet i blokerende opløsning (3% BSA og 1% normalt gedeserum i PBS-T) i 1 time. Primære antistoffer blev tilsat til blokeringsopløsningen, og cellerne blev inkuberet i 1 time ved 37 ° C. Efter vask med PBS-T tre gange blev cellerne inkuberet med passende sekundære antistoffer i blokeringsopløsning i 45 minutter ved stuetemperatur. De mærkede celler blev vasket med PBS-T for seks gange og blev monteret med monterings opløsning [100 mg /mL 1, 4-diazabicyclo [2.2.2] octan (DABCO) i 90% glycerol]. Glassene blev observeret med en LSM710 laser scanning konfokal mikroskop (Carl Zeiss, Tyskland).

cellemigrationsassay

For at vurdere effekten af ​​YC på celle migration, en sårheling assay blev udført som tidligere beskrevet [16]. Kort fortalt blev H1993 celler podet i seks-brønds plader og inkuberet i 48 timer, indtil de nåede 80-90% Confluences. En sammenflydende monolag af H1993-celler blev kunstigt såret med en mikropipettespids, og de løsnede celler blev vasket med serumfrit RPMI1640 og behandlet med testforbindelser i vækstmedium i 24 timer. Cellerne blev vasket to gange med PBS. Billeder af sårene blev fotograferet ved 0 og 24 timer under et omvendt mikroskop (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan).

Cell Invasion Assay

Effekten af ​​YC på celle invasion blev udført ved hjælp af de H1993-celler som beskrevet tidligere [17]. Cellerne blev podet i de øverste kamre i en 24-brønds Matrigelcoatede polyethylenterephthalat membran skær med 8 uM porer (Millipore, Billerica, MA, USA). Pladerne blev overtrukket med 10 pi type I kammer i Matrigelcoatede transwell insert. Mediet af de nedre kamre blev også indeholdt 0,1 mg /ml bovint serumalbumin som en kemoattraktant. Cellerne blev inkuberet i 48 timer ved 37 ° C. De celler, der havde invaderet den ydre overflade af membranen blev fikseret med methanol og farvet med hematoxylin og eosin, og fotograferet (CKX41, Olympus, Tokyo, Japan).

Analyse af lægemiddelkombinationen

cellerne (5 x 10

4 celler /brønd) blev udpladet i plader med 96 brønde med forskellige koncentrationer af YC og rapamyacin eller gefitinib. Efter 48 timers inkubation blev celleproliferation bestemt ved anvendelse af SRB-assayet. Kombinationen effekt blev vurderet ved at beregne kombinationen index (CI) værdier som følger: CI = D

1 /(D

x)

1 + D

2 /(D

x)

2, hvor D

1 og D

2 er koncentrationerne af de kombinerede testforbindelser, der opnår den forventede effekt, og (D

x)

1 og (D

x )

2 er de koncentrationer, der opnås tilsvarende virkninger, når testforbindelserne anvendes alene. I denne undersøgelse blev 50% inhibering tages som den effektive niveau. De Cl-værdier blev sammenlignet med referenceværdierne rapporteret af Chou [18].

In vivo tumor xenograft Study

Kvindelige nøgne mus [5 uger gamle, BALB /c-nu (nu /nu )] blev indkøbt fra Central Laboratory Animal, Inc (Korea) og opretholdt i patogenfrie betingelser. Alle dyreforsøg og pleje blev udført på en måde i overensstemmelse med retningslinjerne fra Animal Care og brug Udvalg Ewha Womans Universitet. Protokollen blev godkendt af Udvalget for den etiske af dyreforsøg i Ewha Womans University. H1993-celler blev injiceret subkutant i kolberne af mus (1 x 10

7-celler i 200 pi medium), og tumorer fik lov at vokse. Når tumoren volumen nåede ca. 90 mm

3 blev medicinsk behandling påbegyndes. Musene blev randomiseret i køretøjet kontrol- og behandlingsgrupper på fem dyr pr hver. YC (0,5 eller 1,0 mg /kg legemsvægt) eller gefitinib (10 mg /kg legemsvægt) opløst i et volumen på 100 pi opløsning (ethanol-Tween 80-H

2O, 1: 1: 98) blev administreret oralt en gang om dagen i 21 dage. Kontrolgruppen blev behandlet med et tilsvarende volumen af ​​køretøjet DMSO. Tumorvolumen blev overvåget i 21 dage hver 4. ~ 6 dage ved hjælp skydelære, og tumorvolumen blev estimeret ifølge den følgende formel: tumorvolumen (mm

3) = 3,14 x L x B x H /6, hvor L er længde, W er bredden, og H er højden.

Immunhistokemi af tumorer

Udskårne tumorvæv blev fikseret i 4% paraformaldehyd (PFA) og indlejret i paraffin. Serielle sektioner af de indlejrede prøver blev deparaffineret, rehydreret, og underkastet antigen-genvinding. Objektglassene blev inkuberet med antistoffer, som blev påvist under anvendelse af LSAB + System-HRP kit (Dako, Glostrup, Danmark) og modfarvet med hematoxylin. Farvede snit blev observeret og fotograferet under et inverteret fasekontrastmikroskop.

Ex vivo biokemisk analyse af tumorer.

En del af de frosne tumorer udskåret fra nøgne mus blev optøet på is og homogeniseret anvendelse af en homogenisator i komplet Lysis Buffer (Active Motif, Carlsbad, CA, USA). Tumorlysater blev underkastet protein koncentrationsbestemmelse assays og portioner blev opbevaret ved -80 ° C.

Statistical Analysis

Data blev udtrykt som middelværdi ± standardafvigelse (S.D.). Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Students

t-

test. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant på

* p

0,05,

** p

. 0,01

Resultater

væksthæmmende effekter af YC i dyrkede H1993 celler

Vores tidligere undersøgelser har vist, at YC har en relativt selektiv vækstinhiberende aktivitet mod humane lungecancerceller sammenlignet med normale lungeepitelceller [8]. Derfor, i den foreliggende undersøgelse, vi udvidet til at evaluere anti-proliferative aktivitet af YC i forskellige NSCLC cellelinier. YC udviste en potentiel vækstinhiberende aktivitet i dyrkede humane NSCLC-celler (tabel 1). Navnlig blev H1993 cellelinien vist sig at være det mest følsomme med IC

50 værdi på 9 nM, efter 72 h inkubation, og YC syntes at være mere potent end gefitinib, et anticancer lægemiddel til behandling af NSCLC-patienter i klinik, under de samme forsøgsbetingelser tilstand (fig 1B). Ved behandling med forskellige koncentrationer af YC i adskillige tidspunkter (24, 48 og 72 h), YC inhiberede proliferationen af ​​H1993-celler i en koncentrations- og tidsafhængig måde (Fig 1C). Fordi H1993 cellelinie var den mest følsomme celle til YC blev mekanismen handling undersøgelse for anti-proliferative aktivitet af YC gennemføres under de H1993 celler.

De morfologiske ændringer af YC-behandlede celler blev observeret under fasekontrastmikroskop efter 24 timers inkubation. De celleantal blev reduceret i en koncentrationsafhængig måde, og den polygonale form af kontrolceller blev ændret til indsnævrede og uregelmæssig dendrit-formen af ​​celler (Fig 1D).

Virkninger af YC på AMPK signalvejen

for yderligere at belyse den anti-proliferative mekanisme YC, regulering af et cellulært signaltransduktionsvej forbundet med kræft cellevækst blev analyseret ved hjælp af Western blot. AMPK betragtes som et vigtigt molekyle, der styrer cellevækst, proliferation og autofagi. Efter 24 timer behandling med YC, proteinniveauet af p-AMPK blev signifikant forøget, og niveauet af p-acetyl-CoA-carboxylase (ACC), en nedstrøms mål for AMPK, blev efterfølgende faldt i en koncentrationsafhængig måde (Fig 2A ). Da AMPK aktivering er en meget tidlig begivenhed [19, 20], blev aktiveringen af ​​AMPK ved YC også overvåges under en kort tidsperiode. P-AMPK-niveauet blev målt op til 8 timer efter behandling af YC (1 uM). Proteinet niveau af p-AMPK blev forøget signifikant efter 2 timers inkubation i en tidsafhængig måde i dyrkede YC-behandlede H1993 celler (Fig 2B). Aktiveringen af ​​AMPK ved YC blev yderligere bekræftet med forbehandlingen af ​​forbindelse C (en specifik inhibitor af AMPK) eller metformin (et AMPK aktivator). De H1993-celler blev forbehandlet med forbindelse C (20 uM) eller metformin (10 mM) i 1 time og derefter co-behandlet med YC (1 uM) i yderligere 2 timer. Forbindelse C undertrykt ekspression af aktiveret AMPK (p-AMPK), men co-behandling af YC genvundet AMPK aktivering. Tilsvarende YC også signifikant forbedret metformin-medieret aktivering af AMPK (fig 2C). Desuden YC effektivt aktiveret p-AMPK niveau i forskellige NSCLC cellelinjer (Fig 2D). Disse resultater antyder, at AMPK kan være et målprotein i anti-proliferative aktivitet af YC i humane NSCLC-celler.

(A) H1993-celler blev behandlet i 24 timer med de angivne koncentrationer af YC og proteinet udtryk var målt ved Western blot-analyse. (B) H1993-celler blev behandlet i forskellige korte tidspunkter med 1 uM af YC og proteinet udtryk blev målt ved Western blot-analyse. (C) H1993-celler blev forbehandlet i 1 time med 20 uM af forbindelse C, som er en velkendt for AMPK inhibitor eller 10 mM af metformin, der er en AMPK aktivator. Derefter, 1 uM YC blev behandlet eller co-behandlet i 2 timer og proteinet udtryk blev målt ved Western blot-analyse. (D) H358, H460, Calu-1, H1299, A549 og H1993-celler blev behandlet i 2 timer med 1 uM af YC og proteinet udtryk blev målt ved Western blot-analyse.

Virkninger af YC på mTOR signalvejen

det er velkendt, at AMPK negativt regulerer mTOR-signalvejen. Da AMPK blev aktiveret af YC i H1993 celler, vi yderligere undersøgt, om YC påvirker også mTOR-signalvejen. Vi fandt, at YC nedreguleret aktiveringen af ​​mTOR (p-mTOR (Ser2448)). Derfor blev mTOR-associeret nedstrøms protein udtryk yderligere bestemt. Da YC ikke modulere niveauerne af mTORC1-relaterede proteiner, såsom 4E-bindende protein 1 (4EBP1), eukaryot translationsinitiering faktor 4E (eIF4E), p70S6 kinase 1 (p70S6K1), og ribosomale protein S6 (RPS6) (Fig 3A) , YC blev yderligere analyseret for effekt for et andet mTOR komplekset, mTORC2, en modulator af actin cytoskeleton organisation. Som et resultat, YC undertrykt mTOR autophosphorylering ved Ser2481, en molekylær biomarkør for mTORC2 aktivitet (figur 3B). For at undersøge om YC hæmmede mTORC2 aktivitet ved at påvirke sammenslutning af mTOR med Rictor blev Rictor immunpræcipiteret fra YC-behandlede celler, og mTOR og Rictor antistoffer blev påvist ved immunblotting hhv. Som vist i fig 3C, YC forstyrret associering af mTOR og Rictor, og disse hændelser efterfølgende undertrykt aktiveringen af ​​mTORC2-associerede downstream mål herunder Akt, proteinkinase C alpha (PKC-α), ras-relaterede C3 botulinustoksin substratet 1 (Rac1), og filamentøse actin (F-actin) ved YC behandling (fig 3B). YC aktiveret også ekspressionen af ​​et celleadhæsionsmolekyle E-cadherin, en negativ regulator af F-actin i H1993 celler (Fig 3B). Den undertrykkende virkning af YC på ekspressionen af ​​F-actin blev også bekræftet af immuncytokemisk analyse (fig 3D), hvilket antyder, at YC effektivt inhiberer cytoskelettet organisering af NSCLC-celler. Disse resultater er i overensstemmelse med observationen af ​​celle morfologiske ændringer med behandlingen af ​​YC i H1993 celler.

(A) H1993 celler blev behandlet i 24 timer med angivne koncentrationer af YC og udtryk for mTORC1 signalering-relaterede proteiner blev målt ved Western blot-analyse. (B) H1993-celler blev behandlet i 24 timer med angivne koncentrationer af YC og udtrykkene for mTORC2 signalering-beslægtede proteiner blev målt ved Western blot-analyse. (C) Interaktionen mellem mTOR og Rictor er blevet analyseret ved immunopræcipitation af Rictor med følgende immunblots af cellelysater (nederste panel) og immunpræcipitater (øvre panel) med de angivne antistoffer. IP: immunopræcipitation. (D) H1993-celler blev behandlet i 24 timer med de angivne koncentrationer af YC og F-actin-ekspression blev målt ved immunocytokemi.

Virkninger af YC om invasion og migration

Det er velkendt, at den asymmetriske akkumulering af F-actin er forbundet med celleinvasion og migration. YC undertrykt ekspressionen af ​​F-actin i NSCLC-celler. Derfor vi yderligere evalueret effekten af ​​YC på kræftcellen invasion og migration. Behandlingen af ​​YC i 24 timer inhiberede migration af cancerceller i en sårhelende assay i en koncentrationsafhængig måde (figur 4A). Desuden blev Matrigel invasion assay udført for at undersøge, om YC påvirker invasivitet af maligne cancerceller. YC forhindret kræftceller i at bevæge sig ind i en Matrigel kammer i en koncentrationsafhængig måde (figur 4B). Disse data antyder, at YC effektivt inhiberede migration og invasion af cancerceller som til dels er forbundet med undertrykkelse af actincytoskelettet organisation via nedregulering af F-actin og opregulering af E-cadherin ekspression.

(A) H1993-celler blev inkuberet i en 12-brønds plade i 24 timer, sårede med en gul spids, og behandlet med de angivne koncentrationer af YC. Efter inkubation i 24 timer blev cellerne fotograferet under anvendelse af et fasekontrastmikroskop. (B) H1993-celler blev behandlet i 48 timer med de angivne koncentrationer af YC. Cellen invasion assay blev udført i en Matrigel-coatede kammer-system som beskrevet i Materialer og Metoder.

Anti-proliferative virkninger med kombination af kemoterapeutiske cancermidler

Vi undersøgte yderligere effekten af YC i kombination med gefitinib eller rapamycin på H1993 celleproliferation. Flere undersøgelser har rapporteret de gavnlige virkninger af en kombination af gefitinib, en EGFR-inhibitor, med mTOR-hæmmere i præklinisk model. I denne undersøgelse var kombinationen af ​​YC med gefitinib vises de betydelige synergistiske inhibitoriske virkninger på de H1993 celler (Fig 5A). Desuden er kombinationen af ​​rapamycin (et mTORC1 inhibitor) og YC inhiberede effektivt celleproliferation af H1993-celler sammenlignet med rapamycin alene (Fig 5B). Det er kendt, at rapamycin blokerer mTORC1 og hæmmer ikke mTORC2. mTORC1 inhibering uden at undertrykke mTORC2 kan aktivere PI3K /Akt og fremme tumor overlevelse. Derfor er denne resultat antyder, at vækstinhibering af YC kombination med rapamycin kan skyldes nedreguleringen af ​​mTORC2 af YC.

Cellerne blev behandlet med YC alene eller i kombination med gefitinib eller rapamycin i 48 timer . Celleproliferationen blev målt ved anvendelse af et SRB-assay. (A) YC i kombination med gefitinib (B) YC i kombination med rapamycin.

hæmmende virkning af tumorvækst ved YC i H1993 celler implanterede xenograft musemodel

anti- tumoraktivitet af YC blev evalueret under anvendelse en

in vivo Salg nøgne mus xenograft model bærende H1993 celler. Når tumorvolumen nåede ca. 90 mm

3 efter implanteret med H1993 celler blev YC (0,5 eller 1 mg /kg af YC) eller gefitinib (10 mg /kg) indgivet oralt til mus en gang om dagen i 21 dage. Tumorvolumenet i den vehikel-behandlede kontrolgruppe var ca. 750 mm

3 i 30 dage efter cellerne blev subkutant implanteret i den højre flanke region på hver mus. Sammenlignet med de vehikelbehandlede kontrolgrupper, YC inhiberede signifikant tumorvækst ved 33,4% og 38,8% ved 0,5 mg /kg og 1,0 mg /kg henholdsvis ved afslutningen af ​​forsøgene (fig 6A). Tumorvægte blev også signifikant inhiberet af behandlingen af ​​YC (Fig 6B). Lignende resultater blev observeret ved behandling af gefitinib (10 mg /kg). Ingen kropsvægt ændringer og åbenlys toksicitet blev fundet i

in vivo

eksperimenter med YC (Fig 6C).

(A) H1993 celler blev injiceret subkutant i flankerne af nøgne mus og tumorer, og fik lov til at udvikle sig i 21 dage. Da de nåede ca. 90 mm

3, de angivne koncentrationer af YC blev indledt. Forsøgsmedarbejderne medikamenter blev givet oralt en gang dagligt i 21 dage. Tumorstørrelser blev overvåget hver 4 ~ 6 dage. (B) Mængden og vægten af ​​hver tumor xenograft blev målt ved afslutning af forsøget på dag 21. (C) Dyr i kontrolgruppen og behandlede grupper blev vejet hver 4 ~ 6 dage. Den gennemsnitlige legemsvægt af hver gruppe er præsenteret.

Desuden er en biokemisk analyse af tumorvæv bekræftede også aktiveringen af ​​AMPK ved behandlingen af ​​YC anvendelse af Western blot (Fig 7A) og immunhistokemisk analyse (fig 7B) på en dosis-afhængig måde. YC udviste også inhibering af ekspressionen af ​​spredning biomarkører Ki-67 (Fig 7C) og prolifererende cellekerneantigen (PCNA) (Fig 7D) i tumorvæv. Disse data antydede, at YC undertrykkes effektivt tumorvækst af H1993 celler

in vivo

, og dens antitumoraktivitet kan delvis være forbundet med aktiveringen af ​​AMPK-signalvejen.

Proteinet ekstrakter blev afledt fra tumorvæv af H1993 xenograft model. (A) AMPK udtryk blev målt ved Western blot-analyse. (B) p-AMPK ekspression blev målt ved immunohistokemi. (C) The Ki-67-ekspression blev målt ved immunohistokemi. (D) Den PCNA udtryk blev målt ved immunhistokemi.

Diskussion

Naturlige produkter er blevet spillet en vigtig rolle i lægemiddelforskning og udvikling [21]. Især har plante-baserede terrestriske naturlige produkter været værdifulde kilder til terapeutiske midler. Yuanhuacine (YC), en daphnane diterpenoid, er et princip komponent af blomster af

Daphne genkwa

. Nylige undersøgelser fra vores gruppe og andre rapporterede de stærke anti-proliferative virkninger af YC mod forskellige cancer cellelinjer [8, 22-24]. En plausibel mekanisme omfatter målretningen af ​​topoisomerase-DNA-komplekser, og YC betragtes som en DNA-beskadigende middel [25]. YC viste også induktion af G2 /M-fase cellecyklusstop i humane blære- og coloncancer-celler [26]. Men den præcise molekylære mekanisme YC i anticancer aktivitet af humane lungecancerceller især NSCLC cellevækst tilbage, at blive belyst. Denne undersøgelse viser, at YC regulerer AMPK /mTOR signalvejen og hæmmer aktincytoskelettet organisation i human lunge H1993 kræftceller.

Nylige undersøgelser viste, at AMPK /mTOR signalveje er stærkt forbundet i reguleringen af ​​kræft cellevækst, spredning og overlevelse. Især aktiveringen af ​​AMPK regulerer negativt cancercellevækst gennem downstream mTOR signaleringsveje [26]. Faktisk mange naturlige produkter-afledte forbindelser, herunder galegine fra

Galega officinalis

[27], resveratrol fra røde druer, quercetin stede i mange frugter og grøntsager, ginsenoside fra

Panax ginseng

, curcumin fra

Curcuma longa

, Berberin fra

Coptis chinensis

, epigallocatechingallat fra grøn te, theaflavin fra sort te [28], og hispidulin fra sne lotus [29] har udstillet anticancer aktivitet ved aktivering af AMPK pathways. I den foreliggende undersøgelse, vi fandt også, at YC effektivt aktiverer AMPK og nedregulerer de mTORC2-associerede signalveje. Aktiveringen af ​​AMPK ved YC viste sig at være indtrådt i en tidlig begivenhed i H1993-celler og aktivering af AMPK blev også bekræftet ved co-behandling med en AMPK inhibitor (forbindelse C) eller en aktivator (metformin). Disse resultater antyder, at den antiproliferative aktivitet af YC er delvist forbundet med aktiveringen af ​​AMPK i de humane NSCLC-celler.

AMPK viser mange nedstrømsmål såsom ACC, mTOR, p-p53, og COX 2 i cancerceller.