PLoS ONE: Den p53-Genaktivering Lille Molecule RITA inducerer Ældning i hoved- og halscancer Cells

Abstrakte

TP53 er det mest almindeligt muterede gen i hoved- og halscancer (HNSCC), med mutationer er associeret med resistens over for konventionel behandling. Genoprettelse af normal p53 funktion er tidligere blevet undersøgt ved brug af RITA (reaktivering af p53 og fremkaldelse af tumor celle apoptose), et lille molekyle, der inducerer en konformationel ændring i p53, hvilket fører til aktivering af dens downstream mål. I den aktuelle undersøgelse fandt vi, at RITA faktisk udøver væsentlige virkninger med HNSCC celler. i denne model, fandt vi, at en betydelig resultat af RITA behandling blev fremskyndet ældning. RITA-induceret fremadskridende alderdom i en række forskellige p53 baggrund, herunder p53 nul-celler. Også, inhibering af p53-ekspression ikke at signifikant at hæmme RITA-induceret senescens. Således synes dette fænomen til at være delvist p53-uafhængig. Derudover vises RITA-induceret senescens at blive delvis medieret af aktivering af DNA-skade respons og SIRT1 (Silent information regulator T1) inhibering, med en synergistisk virkning set ved at kombinere enten ioniserende stråling eller SIRT1 inhibering med RITA behandling. Disse data peger i retning af en ny mekanisme for RITA funktion samt antydning af dens terapeutisk fordel i HNSCC

Henvisning:. Chuang HC, Yang LP, Fitzgerald AL, Osman A, Woo SH, Myers JN, et al . (2014) Den p53-Genaktivering Lille Molecule RITA inducerer Ældning i hoved- og halscancer Cells. PLoS ONE 9 (8): e104821. doi: 10,1371 /journal.pone.0104821

Redaktør: Arianna L. Kim, Columbia University Medical Center, USA

Modtaget: April 2, 2014 Accepteret: 16. juli 2014 Udgivet: 13 August, 2014

Copyright: © 2014 Chuang et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Det forfattere bekræfter, at alle data, der ligger til grund resultaterne er fuldt tilgængelige uden restriktioner. Alle relevante data er inden papiret

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af The University of Texas MD Anderson hoved- og halscancer SPORE Career Development Award (HS). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Mutationer i

TP53

er en fælles genetisk ændring til stede i mange typer af fast tumor, herunder hoved og hals pladecellekræft (HNSCC) [1], [2]. Vores gruppe og andre har vist, at

TP53

mutationer er forbundet med øget resistens mod stråling og kemoterapi i HNSCC cellelinjer

in vitro

med dårlige resultater hos patienter med HNSCC [3] – [5 ]. Desværre, terapeutiske strategier for at genindføre vildtype (wt) p53 i tumorer har været logistisk udfordrende [6], og dermed strategier udforskes til terapeutisk genaktivering af endogen p53 i stedet [7] – [10]. En forbindelse af interesse, RITA (reaktivering af p53 og fremkaldelse af tumor celle apoptose), er et lille molekyle, der binder til den N-terminale ende af p53-proteinet og inducerer en konformationel ændring, der kan føre til genoprettelse af normal p53 funktion [11] , [12]. RITA kan aktivere p53 downstream mål i både p53 vægt- [13], [14] og p53 mutant (mt) celler [15] i en række forskellige modeller.

RITA menes at virke primært via induktion af apoptose , og faktisk RITA, alene eller i kombination med cisplatin, kan inducere apoptose i mange HNSCC cellelinjer [16], [17]. Men denne effekt ikke er universel. Cellelinier, som udtrykker vildtype p53, men ikke undergår apoptose som respons på RITA behandlingen omfatte HNSCC cellelinien JHU-028 [17], den humane osteosarcomcellelinie SJSA og den humane koloncarcinomcellelinie RKO [18].

Apoptose er ikke den eneste cellulære skæbne efter p53-aktivering. Talrige undersøgelser har vist, at aktivering af p53 som respons på en række stimuli i cancerceller fører til accelereret ældning [7]. Selv om det endelige resultat af cellen efter aftalens ældning er uklart, har flere undersøgelser knyttet induktion af ældning med respons på terapeutiske midler. Vi har observeret, at stråling [3] og cisplatin [4] inhiberede cellevækst ved at inducere senescens i vildtype p53 HNSCC celler. I overensstemmelse med denne observation blev HNSCC celler, der udtrykker mt p53 sig at være resistente over for stråling eller cisplatin, hovedsageligt på grund af manglen på en ældning respons. Vi bemærkede endvidere, at mange af disse samme cellelinier er også resistente over for behandling apoptose [3], [4]. Således, i hvert fald i denne model, induktion af degeneration synes at afspejle en gunstig behandling udfald.

Formålet med denne undersøgelse var at bestemme virkningen af ​​RITA på overlevelse, proliferation og induktion af degeneration i flere menneskelige HNSCC cellelinier. Vi yderligere forsøgt at forstå de mekanismer, hvormed disse effekter forekomme.

Materialer og metoder

Cellelinjer

De HNSCC cellelinjer anvendt i denne undersøgelse var generøse gaver fra Dr. Jeffrey Myers (The University of Texas MD Anderson Cancer center og er tidligere blevet karakteriseret [19]. HN30 og HN31 cellelinjer blev afledt fra en primær tumor og lymfe nodal metastase af pharyngeal pladecellecarcinom henholdsvis. hele exome af disse to cellelinier er blevet sekventeret for et separat projekt og, med undtagelse af TP53, ingen andre diskordante mutationer mellem de to cellelinjer blev observeret. PCI-13 cellelinien blev afledt fra en mundhule pladecellekarcinom. Alle cellelinjer blev opretholdt i Dulbecco modificeret Eagle medium indeholdende 10% kalvefosterserum, penicillin /streptomycin, glutamin, natriumpyruvat, ikke-essentielle aminosyrer og vitaminer. Teknikker til stabilt vælte p53 i HN30-celler (som har wt p53) og HN31-celler (som har mt p53) er beskrevet andetsteds [3]. PCI-13-celler, som ikke har nogen endogen p53, blev manipuleret til at udtrykke

TP53

overekspression konstruktioner (wt p53, A161S, G245D), der blev genereret og indført i en pBabe retroviral vektor indeholdende en puromycin-resistens insertion ( pBabe-puro; Addgene) ved anvendelse af standard kloningsteknikker. HN31-celler blev transficeret med korte hårnål RNA (shRNA) specifikt for SIRT-1 (Silent information regulator T1) eller kontrol krypteret shRNA via lentivirale vektorer indeholdende puromycin-resistens genet fra Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, CA), ifølge producentens anvisninger. Lentiviral-transficerede kontrolceller (HN31-C2) og deres shRNA, stabil SIRT-1-knockdown modstykke (HN31-S19) blev isoleret ved immunoblotting efter kloner blev screenet. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol.

Antistoffer og immunblotting

Protein og phosphorylerede protein ekspressionsniveauer blev vurderet ved immunoblotting af hel-cellelysater fra celler behandlet eller ikke behandlet med RITA. De følgende primære antistoffer blev anvendt: p53 (DO-1) og phospho-serin 15 p53 fra Santa Cruz Biotechnology; p21 fra Calbiochem; p-p53 (Ser-15), p53-opreguleret modulator af apoptose (PUMA), murine dobbelt minute2 (MDM2), checkpoint kinase 2 (Chk2), phosphoryleret Chk2 (p-Chk2, Thr68), SIRT1, og β-actin fra Cell Signaling Technology (Danvers, MA). Ged anti-mus og anti-kanin-sekundære antistoffer konjugeret til peberrodsperoxidase blev indkøbt fra Cell Signaling og Santa Cruz Biotechnology, henholdsvis.

Reagenser

RITA blev købt fra Cayman Chemical (Ann Arbor, MI ) og proteinkinaseinhibitoren staurosporin blev indkøbt fra Sigma (St. Louis, MO). Den SIRT1 inhibitoren Tenovin-6 blev opnået fra Santa Cruz Biotechnology (Dallas, TX). RITA blev opløst i 100% dimethylsulfoxid (DMSO) til en stamkoncentration på 50 mM og opbevaret som portioner indtil anvendelse. Staurosporin og Tenovin-6 blev opløst i 100% DMSO og vand henholdsvis stock koncentrationer på 1 M og opbevaret som portioner indtil anvendelse.

vækstsuppression assays

Cellelevedygtigheden assay er blevet tidligere beskrevet [20]. Kort fortalt, 2000 celler /brønd blev udpladet i plader med 96 brønde, behandlet med forskellige koncentrationer af RITA i op til 72 timer, og levedygtighed blev vurderet med en MTT assay. For koloni-dannelse assay [3], blev HNSCC celler udsået i 6-brønds plader i 24 timer, behandlet med RITA, og dyrket i 10-14 dage. Celler blev fikseret i en 3% krystalviolet /10% formalin løsning og kolonier, der indeholder mere end 50 celler blev talt med ImageJ software.

Ældning-associated- β-galactosidase farvning

Ældning-associeret p-galactosidase (SA-β-gal) farvning blev udført ifølge producentens instruktioner (Cell Signaling Technology). Kort beskrevet blev HNSCC celler udpladet i 6-brønds plader og behandlet med RITA i forskellige koncentrationer i forskellige tidsrum (typisk 5 dage), hvorefter cellerne blev fikseret i 10 minutter og farvet for SA-β-gal-aktivitet natten over ved 37 ° C. Fladtrykt og blå-farvning celler blev scoret som aldrende og rapporteres som en procentdel af alle celler observeret pr high-power felt.

statistiske analyser

Data blev samlet til analyse fra flere uafhængige forsøg, og cellebaserede assays blev udført tre gange. To-halet Students

t

tests blev anvendt til at vurdere forskelle i senescens og for andre uparrede gruppesammenligninger. For alle sammenligninger,

P

0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekter af RITA på p53 og p53-associerede proteiner

Vi brugte. et par isogene HNSCC cellelinjer, den ene med wt p53 (HN30) og den anden med mt p53 (HN31), for at teste virkningen af ​​RITA på ekspressionen og phosphorylering af p53 og andre beslægtede proteiner. RITA stærkt inducerede phosphorylering af p53 og p21 efter 12 timer i HN30-celler, og efter 24 timer i HN31-celler (Fig. 1A). PUMA proteinniveauer blev også forhøjet efter 24 timers eksponering for RITA i begge cellelinier. Stigningerne i p53-ekspression, p53 phosphorylering, og PUMA ekspression ved 24 timer var alle dosisafhængige (fig. 1B). Disse resultater indikerer, at RITA kan aktivere nedstrøms mål af p53-signalering i disse isogene cellelinier med wt eller mt p53.

(A og B) HN30 (vildtype p53) og HN31 (muteret p53) hoved og hals cancerceller blev behandlet med RITA for de angivne tidspunkter (A) og doser (B) og ekspressionen af ​​p53 og dets mål blev evalueret ved immunblotting. (C) Celler blev behandlet med RITA (0,1 uM-20 uM) i 72 timer og vurderet via MTT assay. Data er udtrykt som middelværdier ± S.E. fra tre forsøg. (D) HN30 og HN31 celler blev behandlet med RITA i de angivne doser i 10-14 dage, hvorefter kolonier blev fikseret, farvet, og kvantificerbare. Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. Kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± S.E. fra tre forsøg. * – Angiver p 0,05 versus ubehandlede kontrol

RITA hæmmer væksten af ​​hoved og halscancer cellelinjer

Flere undersøgelser har at RITA kan fremkalde tumor celledød [15], [. ,,,0],18]. Oprindeligt testede vi, om RITA kan undertrykke væksten af ​​HN30 og HN31 celler. Ved hjælp af en kortsigtet celleproliferationsassay, fandt vi, at RITA, ved koncentrationer over 5 uM, induceret beskeden vækst undertrykkelse i både HN30 og HN31 celler efter 72 timers uafbrudt behandling (Fig. 1C). I en mere langsigtet kolonidannelse assay blev RITA sig at reducere antallet af kolonier dannet af begge cellelinier på alle testede doser (p 0,05). (. Figur 1D)

RITA inducerer ældning i head og halscancer cellelinier

Vi har tidligere vist, at den dominerende reaktion på enten fysiologisk relevante koncentrationer af cisplatin [4] eller standard doser af stråling [3] i p53 vildtype HNSCC cellelinjer er ikke apoptose. Ligeledes, i den nuværende model, var minimal caspase og PARP spaltning observeret følgende eksponering for RITA (Fig. 2A). For således at afprøve den hypotese, at den observerede anti-proliferative respons af HN30 og HN31 celler til RITA var i det mindste delvis på grund af induktion af senescens, analyserede vi SA-β-gal-aktivitet, en markør for cellulær ældning. Vi fandt, at RITA påvirkede celle morfologi og signifikant forøget SA-β-gal-farvning på en dosis-afhængig måde i begge cellelinier (p 0,05;. Figur 2B), hvilket indikerer, at RITA behandling førte til accelereret ældning i disse isogene cellelinier.

(A) PARP og caspase 3 spaltning blev undersøgt via Western blotting efter eksponering af celler for RITA ved 1 uM for de angivne perioder. P, staurosporin (1 uM i 8 timer) blev anvendt som en positiv kontrol. (B) HN30 og HN31 celler udsået i 6-brønds vævskulturplader blev behandlet med de angivne koncentrationer af RITA i 5 dage, hvorefter cellerne blev fikseret og farvet for senescens-associerede -β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet . Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. I hver behandlet og ubehandlet brønd blev fem tilfældige field valgte indstillinger og antallet af celler med aldrende morfologi og med blåfarvning blev talt under 20X forstørrelse (Olympus IX71). * – Angiver p 0,05 versus ubehandlede kontrol

p53 status og RITA-medieret væksthæmning i HNSCC cellelinjer

Dernæst at undersøge, om RITA-induceret aldring afhænger p53 status. behandlede vi de stabile-p53-knockdown cellelinjer HN30-shp53 og HN31-shp53 med RITA og fandt, at knockdown af p53 protein-ekspression markant reduceret både udtryk og fosforylering af p53 (fig. 3). Men baseline p21-ekspression var uændret i de HN30 (vægt p53) celler (Fig. 3A). Vi fandt endvidere, at p53-inhibering havde kun en delvis redning virkning på RITA-induceret vækstinhibering og kolonidannelse i HN30-celler, og det havde ingen signifikant virkning på redning HN31 celler (Fig. 3B). Desuden har p53 knockdown ikke påvirke RITA-induceret aldring i begge typer af p53-knockdown celler (fig. 3C).

(A) Niveauer af total og phosphoryleret p53 og p21 blev målt i HN30 og HN31 lentiviral- transficerede kontrolceller og deres korte hårnål RNA, p53-stabil-knockdown modstykker efter behandling med 1 uM RITA i 72 timer. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (B) HN30 og HN31 lentivirale-transficerede kontrolceller og deres p53-stabil-knockdown modstykker blev behandlet med RITA i de angivne doser i 10-14 dage, hvorefter kolonier blev fikseret, farvet, og kvantificerbare. Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. Kvantitative data er udtrykt som middelværdi ± S.E. fra tre forsøg. I alle cellelinier (kontrol og sh53), RITA behandling medførte signifikant (p 0,05) faldt kolonidannelse ved alle testede doser. (C) HN30 og HN31 lentivirale-transficerede kontrolceller og deres p53-stabil-knockdown modstykker blev podet i 6-brønds vævskulturplader og behandlet med de angivne koncentrationer af RITA i 5 dage, hvorefter cellerne blev fikseret og farvet for senescence- associeret -β-galactosidase (SA-β-gal). Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. Med undtagelse af 0,1 uM i HN30-shp53, alle doser af RITA i alle cellelinjer medførte signifikant (p 0,05) øget SA-β-gal sammenlignet med ubehandlet kontrol. blev ikke observeret nogen signifikante forskelle mellem kontrol og shp53 i nogen cellelinje.

Dernæst testede vi, om rekonstitution af wt p53 og mt p53 i p53-nul PCI-13 celler ville give modtagelighed for RITA. Til disse eksperimenter pBabe (vektorkontrol), wt p53, og A161S og G245D mutant p53-konstruktioner blev genindsat i PCI-13 celler til at producere de PCI-13-pBABE, PCI-13-WT, PCI-13-A161S og PCI-13-G245D cellelinier. I modsætning til p53-positive celler, p53 og phosphoryleret p53 ikke blev påvist i PCI-13 pBabe kontrolceller (fig. 4A). Også, p21 blev kun udtrykt ved vægt udtrykkende celler og ved en af ​​de mt p53-udtrykkende celler (PCI-13-A161S).

(A) PCI-13 (p53 null) celler der udtrykker vektorkontrol eller de angivne p53 konstruktioner blev behandlet med RITA 2,5 uM i 72 timer, hvorefter proteinlysater blev forberedt og niveauer af total og phosphoryleret p53 og p21 blev vurderet af western blotting. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (B) PCI-13 celler, der udtrykker de angivne konstruktioner blev podet på plader med 6 brønde, behandlet med RITA i de angivne koncentrationer, og talt i en klongenicitetsassayet. Med undtagelse af pBabe celler behandlet ved 0,25 uM, alle cellelinier ved alle testede koncentrationer af RITA udviste signifikant nedsat kolonidannelse i sammenligning med ubehandlede kontrol (p 0,05). (C) PCI-13 celler, der udtrykker de angivne konstruktioner blev podet i 6-brønds vævskulturplader og behandlet med 0,25 uM RITA hvorefter cellerne blev fikseret og farvet for senescens-associerede -β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet . Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. Alle cellelinjer udviste signifikant forøget SA-β-gal farvning sammenlignet med ubehandlede kontrol (p 0,05).

En langsigtet kolonidannelse assay (. Figur 4B) og SA-β-gal farvning (. figur 4C) viste, at RITA signifikant inhiberede cellevækst og induceret senescens i alle PCI-13 cellelinjer uanset p53-status, herunder p53-nul-parentale linje (p 0,05). Således er tilstedeværelsen af ​​p53-protein synes ikke at være nødvendig for RITA at udøve dets virkning.

RITA-induceret DNA-beskadigelse respons i HNSCC cellelinjer er forbundet med SIRT1 nedregulering

RITA er også kendt for at inducere DNA-skade respons [21], [22]. Checkpoint kinase 2 (Chk2) er en vigtig nedstrømsmål af DNA beskadigelse respons og fører til standsning af cellecyklus, apoptose, eller ældning. Især kan aktiveres Chk2 fremkalde p53-uafhængig alderdom i cancerceller [23], [24]. Disse resultater, med vores fund, at RITA hæmmer HNSCC cellevækst og kan fremkalde degeneration selv i fravær af p53, førte os til at undersøge effekten af ​​RITA på Chk2 udtryk og fosforylering status. Vi fandt, at Chk2 protein blev phosphoryleret ved dets aktiveringssted, Thr68, efter udsættelse for RITA i HN30, HN31 og PCI-13-celler, uanset p53-status (fig. 5A).

(A) HN30 eller HN31 celler transficeret med lentiviral kontrol eller kort hårnål RNA, p53-stabil-knockdown konstruktioner blev behandlet med 1 pM RITA 1 i 72 timer, hvorefter proteinlysater blev fremstillet og niveauer af total og phosphoryleret Chk2 vurderet ved immunblotting. Højre: PCI-13 celler transficeret med de viste konstruktioner blev behandlet med 2,5 pM RITA i forskellige perioder, hvorefter proteinlysater blev fremstillet og niveauer af total og phosphoryleret Chk2 blev vurderet. (B) HN30, HN31, og PCI-13-celler med de angivne p53-konstruktioner blev behandlet med RITA for de angivne perioder, og lysater blev vurderet for SIRT1 proteinekspression ved western blotting. β-actin blev anvendt som en intern loading kontrol. (C) HN31-celler stabilt transduceret med lentivirale styrevektorer (C) eller SIRT1 shRNA (S) blev indledningsvis undersøgt for inhibering af SIRT-1-ekspression. Repræsentative kloner blev derefter behandlet med 2,5 pM RITA i 72 timer, hvorefter de angivne proteiner blev ekstraheret og analyseret ved western blotting. (D) HN31-celler stabilt transduceret med lentivirale styrevektorer (C2) eller SIRT1 shRNA (S19) blev podet i 6-brønds vævskulturplader og behandlet med de angivne koncentrationer af RITA i 5 dage, hvorefter cellerne blev fikseret og farvet for degeneration associeret -β-galactosidase (SA-β-gal) aktivitet. Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. * – Indikerer signifikant forøget i forhold til at styre vektor på det angivne dosis (p 0,05). (E) HN31-celler blev podet på plader med 6 brønde og behandlet med RITA (0,25 M) med eller uden Tenovin 6 (0,125 eller 0,25 uM) i 10 dage, hvorefter kolonier blev fikseret, farvet, og kvantificerbare. * – Indikerer faldet betydeligt i forhold til Tenovin 6 alene gruppen på den angivne dosis. Data er normaliseret til enten køretøj-only eller RITA behandling betingelser. Repræsentative billeder fra tre eksperimenter med lignende resultater er vist. Data er udtrykt som middelværdi ± SE fra tre forsøg.

Dernæst fordi Chk2 synes at aktivere cellulær senescens ved at hæmme SIRT1 [25], og fordi knockdown eller inhibering af SIRT1 aktivitet også kan inducere senescens-lignende vækststandsning i fravær af funktionel p53 [26] – [28], evalueret vi SIRT1 ekspression og fundet, at RITA førte til nedsat SIRT1 ekspression i alle cellelinjer evaluerede, uanset p53-status (fig 5B.)

for at teste denne effekt yderligere, vi vurderet, om udtømning af SIRT1 af shRNA ville øge den biologiske effekt af RITA. Vi fandt, at shRNA-medieret inhibering af SIRT1 faldt SIRT1 proteinniveauer og øget phosphorylerede Chk2 niveauer efter udsættelse for RITA (fig. 5C). Desuden RITA behandling væsentligt forbedret SA-β-gal farvning i HN31-S19 (SIRT1-knockdown) celler sammenlignet med HN31-C2 (kontrol-transficerede) celler (Fig. 5D). Endelig kombinationen af ​​RITA og SIRT1 inhibitoren Tenovin 6 frembragte en synergistisk cellevækstinhibering virkning (fig. 5E). Kollektivt, disse resultater tyder på, at RITA kan hæmme SIRT1 udtryk og at denne effekt bidrager til RITA-induceret ældning.

RITA øger radiosensitivitet af mutant p53-udtryk HNSCC

På baggrund af vores tidligere fund at radiosensitivitet i HNSCC celler er stærkt relateret til deres evne til at undergå ældning efter bestråling, udtrykkeligt, at HN31 mt p53 celler er radioresistente og har lave niveauer af stråling-induceret ældning, og vores nuværende resultater, som RITA faldt levedygtighed og øget ældning i HN31 celler, vi undersøgt, om RITA kunne fungere som en strålingssensibilisator. Vi fandt, at forbehandling af HN31-celler med RITA i 24 timer efterfulgt af bestråling resulterede i synergistisk inhibering af cellevækst, når man sammenligner IC80 (fig. 6A). Specifikt blev gensidigt ikke-eksklusive kombinatorisk indeks (Cl) beregnet under anvendelse af fremgangsmåden ifølge Chou Talalay [29]. Kombinationen af ​​RITA og stråling resulterede i en CI på 0,50, med en CI på mindre end 1 indikerer synergi.

(A) HN31-celler blev udpladet med 1000 celler /brønd i plader med 6 brønde, behandlet med RITA i 24 timer, og behandles med 2 Gy stråling. Antal kolonier blev talt og anvendt til at beregne den overlevende fraktion. Resultaterne er præsenteret som en standard isobologram, med den fuldt optrukne linie repræsenterer en additiv virkning, og de punkter, der repræsenterer den dosis, der resulterede i 80% inhibering (IC80) (B) Foreslået virkningsmekanisme af RITA i forbindelse med forskellige p53 mutation status.

diskussion

Vi fandt i nærværende undersøgelse, at RITA kunne hæmme væksten og inducere ældning i HNSCC celler, selv i fravær af p53 eller i forbindelse med udtømning af p53-ekspression, og at dette fænomen var forbundet med øget Chk2 aktivering og afhænger i det mindste delvist på SIRT1. Disse resultater står i modsætning til tidligere undersøgelser, der viser, at RITA fungerer primært via induktion af apoptose via aktivering af p53 signalering; snarere, vores resultater viser, at RITA kan føre til senescens i HNSCC celler blandt andre virkninger, og er ikke helt afhængig af p53-ekspression.

Selvom mange af de involverede i senescens pathways medieres af p53, navnlig i forbindelse med p53 phosphorylering, kan ældning også forekomme i fravær af dette protein, hvilket antyder, at p53-uafhængige mekanismer kan også mægle terapi-induceret aldring af tumorceller [30] – [34]. For eksempel blev doxorubicin vist at inducere en aldrende fænotype i p53-nul-Saos-2-celler, i SW480 og U251 celler, som udtrykker mutant p53, og i HeLa og Hep-2-cellelinjer, i hvilke p53-funktion er blevet hæmmet [35 ].

Andre grupper har rapporteret, at RITA ikke kun kan fremkalde p53, men også fremkalde en samtidig DNA skade responset [21], [22]. DNA beskadigelse respons involverer to store signalveje, sensoren kinaser ataksi telangiectasia muteret (ATM) og ataksi telangiectasia og Rad3-relateret (ATR). Disse kinaser aktiverer nedstrøms effektor kinaser Chk2 og Chk1. Chk2 kan udløse replikativ senescens via p53 /p21 eller andre veje som reaktion på telomer dysfunktion og DNA-beskadigelse [36]. For nylig, Chk2 blev vist at modulere cellulære respons på RITA [22]. Vores resultater som RITA behandling bedt en stigning i Chk2 fosforylering uanset p53 status er i overensstemmelse med denne observation (fig. 5).

Under betingelser for cellulær stress eller DNA-skader, kan Chk2 aktivering føre til en reduktion i SIRT1 udtryk og aldring [25]. SIRT1 er et højt konserveret histondeacetylase der er kendt for at mægle cellulær metabolisme, aldring, og reaktion på stress [37]. Overekspression af SIRT1 er blevet vist at inhibere cellulær senescens i en række forskellige maligniteter [38]. Desuden er SIRT1 overudtrykt i kemoresistent celler, og inhibering af SIRT1 kan undertrykke tumorvækst i nogle modeller [27], [38] – [40]. I den aktuelle undersøgelse fandt vi faktisk, at RITA inhiberede SIRT1 ekspression i alle testede cellelinier, uanset p53-status (fig. 5B). Desuden behandling med en SIRT1 hæmmer eller SIRT1-specifikke shRNA førte til fald i væksten og stigninger i degeneration i forbindelse med RITA behandling. Selvom hæmning af SIRT1 menes at inducere senescens primært ved at interagere med p53, har mindst en gruppe vist, at doxorubicin kan inducere senescens i SCC celler, som mangler p53 via hæmning af SIRT1 [26]. Derudover har en gruppe rapporteret at inhibering af SIRT1 kan inducere senescens i H1299 (p53 null) via nedsat aktivitet i Ras /MAPK signalering. Disse observationer kan give et link til de observerede effekter af RITA, selv i HNSCC celler mangler p53 protein. På baggrund af vores resultater fra den aktuelle undersøgelse, samt andres arbejde, foreslår vi, at RITA inducerer vækst anholdelse og ældning af mindst to forskellige veje (fig. 6B). I p53-kompetente celler, RITA sandsynligvis virker primært via kanoniske p53-mål, som er den dominerende virkning af lægemidlet. Det endelige resultat af denne aktivering kan være enten apoptose eller senescens afhængigt af konteksten. Omvendt er en mindre, men stadig signifikant virkning på cellelevedygtighed set i p53 defekte cellelinier. i mangel af funktionel p53 eller p53 protein, RITA synes imidlertid at øve det mindste nogle af dens virkninger via aktivering af DNA-skade responset og hæmme SIRT1 udtryk. Den nøjagtige natur af denne dobbelte funktion kræver yderligere undersøgelse.

Vi har tidligere forbundet respons på cisplatin og strålebehandling med induktion af senescens, der viser, at celler, som er mere resistente over for disse lægemidler er også modstandsdygtige over for ældning induktion [3 ], [4]. Selvom ønskeligheden af ​​terapi-induceret ældning som en reaktion på klinisk anvendte terapier er et spørgsmål om væsentlig debat [41], for celletyper, som er meget resistente over for andre former for celledød eller standsning, kan aldring være en alternativ terapeutisk resultat. Vores fund, at lave doser af RITA (0,1-0,5) selektivt kunne sensibilisere stærkt resistente HNSCC celler til behandling in vitro [3], at tilsætningen af ​​RITA kan vise sig at være en levedygtig strategi for sensibiliserende tumorer for stråling, det mest almindeligt anvendte behandling for HNSCC.

tak

Vi vil gerne takke Mei Zhao for hendes værdifulde teknisk bistand.