PLoS ONE: Deregulering af Rab og Rab Effekt Gener i Blære Cancer

Abstrakt

Voksende data viser, at Rab GTPaser, centrale regulatorer af intracellulær transport i eukaryote celler, spiller en vigtig rolle i cancer. Vi analyserede dereguleringen på transkriptionsniveauet af gener, der koder Rab proteiner og Rab-interagerende proteiner i blærekræft patogenese, idet der skelnes mellem de to vigtigste progression veje hidtil identificeret i blærekræft: Ta vej kendetegnet ved en høj frekvens af

FGFR3

mutation og karcinom

in situ

vej, hvor ingen eller sjælden

FGFR3

mutationer er blevet identificeret. En systematisk litteratursøgning identificeret 61 gener, der koder Rab proteiner og 223 gener, der koder Rab-interagerende proteiner. Transkriptom data blev opnået for normale urothelium prøver og for to uafhængige blærekræft datasæt, der svarer til 152 og 75 tumorer. Gene deregulering blev analyseret med SAM (signifikant analyse af microarray) test eller den binomialtest. Samlet, 30 gener blev nedreguleret, og 13 blev opreguleret i tumorprøverne. Fem af disse deregulerede gener (

LEPRE1

,

MICAL2

,

RAB23

,

STXBP1

,

SYTL1

) blev specifikt dereguleret i

FGFR3

non-muteret muskel-invasive tumorer. Nr gen kodende for et Rab eller Rab-interagerende protein blev fundet at være specifikt dereguleret i

FGFR3

-mutated tumorer. Cluster analyse viste, at

RAB27

genklynge (omfattende gener, der koder RAB27 og dets interagerende partnere) dereguleret, og at denne deregulering var forbundet med begge veje for blærekræft patogenese. Endelig fandt vi, at ekspressionen af ​​

KIF20A

og

ZWINT

var forbundet med den af ​​proliferationsmarkører og at ekspressionen af ​​

MLPH

,

MYO5B

,

RAB11A

,

RAB11FIP1

,

RAB20

SYTL2

var forbundet med den af ​​urothelial celle differentiering markører. Denne systematisk analyse af Rab og Rab effektor gen deregulering i blærekræft, idet relevante tumor undergrupper i betragtning, giver indblik i de mulige roller Rab proteiner og deres effektorer i blærekræft patogenese. Denne fremgangsmåde gælder for anden gruppe af gener og typer af kræft

Henvisning:. Ho JR, Chapeaublanc E, Kirkwood L, Nicolle R, Benhamou S, Lebret T, et al. (2012) Deregulering af Rab og Rab Effekt Gener i blærekræft. PLoS ONE 7 (6): e39469. doi: 10,1371 /journal.pone.0039469

Redaktør: Wanjin Hong, Institut for Molekylær og Cell Biology, Singapore

Modtaget: Januar 27, 2012; Accepteret: 21. maj 2012; Udgivet: 19 juni, 2012 |

Copyright: © 2012 Ho et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Arbejdet blev støttet af tilskud fra Centre national de Recherche Scientifique (CNRS) og Institut Curie. Den Molecular Oncology teamet understøttes af La Ligue Nationale Contre le Cancer ( “Equipe labellisée”). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Intracellulær handel er en vigtig proces i eukaryote celler. Den er afhængig af vesikulær eller rørformede transport luftfartsselskaber, der shuttle mellem celle kamre letter konstant udveksling af proteiner og lipider. Mange undersøgelser har fremhævet dens kompleksitet og førte til identifikation af et stort antal proteiner, der er involveret i de forskellige trin i intracellulær transport, dvs. dannelsen af ​​transport luftfartsselskaber fra donor membraner, deres bevægelse langs cytoskeletale spor og deres tethering /fusion med target membraner. Små GTPaser af Rab familien er dukket op som vigtige regulatorer af disse forskellige trin. Som med andre GTPaser, Rab proteiner cyklus mellem en inaktiv BNP (Guanosindifosfat) -bundet formular og en aktiv GTP (guanosintriphosphat) -bundet formular. Den aktive GTP-bundne form af det Rab er membranbundet henviser hydrolyse af GTP til GDP fører til dens dissociation i cytosolen. Disse to cykler styres af et komplekst regulatorisk netværk af proteiner, der omfatter guaninnukleotid exchange faktorer (GEFs), GTPase aktiverende proteiner (GAPS) og guanin nukleotid dissociation inhibitorer (GDI). I deres aktive form Rab GTPaser dialog med en bred vifte af effektor proteiner, såsom molekylære motorer, lipid kinaser, tøjre faktorer og stilladser proteiner (se [1] for anmeldelse).

Nylige undersøgelser har fundet en rolle for en række Rab proteiner i human cancer. Adskillige ekspressions- undersøgelser har antydet, at de kunne spille både en aktiverende og en inhiberende rolle i tumorudvikling.

RAB1A

er overudtrykt i tungen pladecellekræft [2].

Rab3a

udtrykkes i insulinoma, men ikke i normale pancreas ø-celler [3].

RAB11A

RAB20

udtryk øges under hudkræft [4] og i eksokrine pancreas adenocarcinomer [5] henholdsvis. Derimod

RAB37

nedreguleres i metastatiske tumorer i lungekræft [6]. Begge

RAB5A

RAB7

viste sig at være opreguleret i autonome skjoldbruskkirtlen adenomer, bliver sådan en opregulering korreleret med en accelereret thyroglobulin endocytose og hormon produktion [7].

Flere funktionelle undersøgelser har bekræftet rolle Rab proteiner i cancer progression. RAB5A, overudtrykt i hepatocellulære carcinomer, synes at være afgørende for leverkræft progression, som foreslået af den konstatering, at en dominant negativ form af RAB5A svækker EGF-medieret signalering og cellevandring af en human hepatom cellelinie [8]. Andre resultater har vist, at

RAB23

, forstærkes og overudtrykt i diffust-typen mavekræft, virker som en invasion mægler gen [9]. RAB25 spiller en rolle i udviklingen af ​​både ovarie- og brystcancer [10], [11]. Imidlertid har en modsat rolle

RAB25

også blevet dokumenteret, dvs. som et tumorsuppressorgen for tyktarmskræft [12]. Desuden har nogle proteiner involveret i Rab cyklus regulering også været impliceret i carcinogenese. F.eks

RIN1

, der koder for et RAB5 GEF, blev vist at være en bryst tumorsuppressorgen [13], hvorimod

TBC1D3B

, der koder for et RAB5 GAP, viste sig at være et onkogen forstærkes i prostatakræft [14].

Urinary blærekræft er den fjerde mest almindelige kræftform i både europæiske og amerikanske mænd. Hos kvinder er det den niende mest almindelige kræftform i USA og 14

th mest almindelige kræftform i Europa [15], [16]. Ifølge stadium, ved første præsentation, omkring 50% af blærecarcinom er Ta tumorer, som er generelt af lav kvalitet (Ta tumorer er papillære tumorer, som ikke invaderer ud over basalmembranen), 20% er T1 tumorer (tumorer, som invaderer ud over basalmembranen men ikke den underliggende muscularis propria) og 30% er muskel-invasive tumorer (T2-4). Carcinoma

in situ

(Cis) bestående af flad, high-grade læsioner ikke invaderende ud basalmembranen er sjældent findes i isolation. I stedet er Cis overvejende stødt med andre urothelial tumorer. Klinisk og molekylære beviser tyder på, at blæretumorer opstår og fremskridt ad to veje: den “Ta” sti og “karcinom

in situ

” sti. Ta tumorer vise en høj gentagelse sats (60%, [17]), men har en lav sandsynlighed (5-10%) af udvikler sig til T1 tumorer og derefter til muskel-invasive tumorer (T2-4). Derimod Cis ofte fremskridt (i omkring 50% af tilfældene), at T1 tumorer og derefter til muskel-invasive tumorer ([18] for gennemgang). Ta pathway er kendetegnet ved en høj frekvens af aktiverende mutationer af

FGFR3

genet (der koder for tyrosinkinase fibroblastvækstfaktorreceptor 3).

FGFR3

mutationer er til stede i 70-75% af Ta tumorer og fraværende fra Cis. Deres relativt lav frekvens i T1 (20%) og T2-4 tumorer (10-15%) er i overensstemmelse med den høje Cis progression og den lave Ta progression [19] – [24].

målet med dette arbejde var at foretage en systematisk undersøgelse for at identificere Rab proteiner og Rab-interagerende proteiner, hvis ekspression dereguleret under Ta og Cis veje for blære tumor patogenese på transkriptom niveau.

Resultater

for denne undersøgelse, vi anvendte den strategi præsenteres i figur 1 (flow chart). Kort: 1. en udtømmende liste over gener, der koder for Rab og Rab-interagerende blev oprettet fra offentlige databaser, 2. deregulerede gener (op- eller ned-reguleret i forhold til normal urothelium) i hver af de to veje (

FGFR3

-mutated tumor vej og

FGFR3

non-muteret tumor vej), blev identificeret fra to transkriptom datasæt, 3. deregulerede gener muligvis på grund af tumor stroma eller tumor – stroma interaktioner blev identificeret og derefter udeladt fra yderligere analyse (analyse af transkriptom data i blæren tumorcellelinier sammenlignet med normale celler i kultur (NHU)), 4. for hver dereguleret gen, en bestemt forening enten med

FGFR3

-mutated tumor gruppen eller ikke -mutated tumor gruppe blev undersøgt samt en forening med en differentiering eller proliferation fænotype. Derudover undersøgte vi for hver Rab klynge (bestående af en given Rab protein og dets interagerende partnere), om det kunne være forbundet med blærekræft patogenese.

Det første skridt er at identificere gennem offentlige databaser og ekspertviden om generne af interesse at undersøge, her Rabs og deres effektorer. Det andet trin består i at vælge undergrupper af tumorer og analysere ekspressionen af ​​de forskellige gener valgt i første trin i disse undergrupper i forhold til den normale urothelium. Den undergruppe her er blevet gjort under hensyntagen til

FGFR3

mutation status, scenen og karakteren, adskillelse af tumorer i to veje. En sammenligning af ekspressionen observeret i blæren cancercellelinier og i dyrkede normale humane urothelial cellerne lov kassation af gener, for hvilke ekspression kunne muligvis på grund af tilstedeværelsen af ​​stroma (i forhold til normale celler, opregulering i blæretumorer, men ikke i blæren tumorcellelinier). Forskellige typer af analyser blev derefter udført på de udvalgte liberaliserede gener: 1) en sammenligning af udtrykket i

FGFR3

-mutated tumorer og

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer tillod identifikation af gener specifikt dereguleret i en af ​​de to veje for blærekræft patogenese; 2) ved at gruppere gener i klynge af gener (her de Rab klynger), identificerede vi klynger med dereguleret udtryk; 3) ved at analysere den mulige sammenhæng mellem ekspressionen af ​​de deregulerede gener og ekspression af spredning eller differentiering markørgener, vi identificeret de deregulerede gener forbundet med proliferation eller differentiering.

De opnåede resultater på hvert trin af analyserne er opsummeret i figur 2.

resultaterne af hver analyse trin er vist i rutediagrammet vist i figur 1.

Definition af listen over gener, der skal analyseres

Den første del af dette arbejde bestod i udarbejdelse af en liste af gener, der koder for Rab proteiner og Rab-interagerende proteiner, herunder aktivering GEF og inaktivering GAP proteiner (figur 3). 61 menneskelige

RAB

gener blev fundet. Listen over Rab-interagerende proteiner blev etableret af en litteratursøgning for at samle papirer, der har rapporteret identifikation og /eller karakterisering af proteiner, der direkte interagerer med Rab GTPaser, ved hjælp af forskellige metoder (to-hybrid assays, GST-pull down, co-immunpræcipitationseksperimenter etc.). Denne liste omfattede 217 proteiner: 23 GEFs, 20 huller og 174 effektor proteiner. Vi har tilføjet til denne liste to gener, der koder for de to GDI (BNP Dissociation Inhibitor) proteiner (

GDI1

og

2

), der er fælles for alle Rab GTPaser. Vi inkluderede også fire gener, der koder for proteiner involveret i post-translationel modifikation og membran sammenslutning af alle nyligt syntetiserede Rabs:

CHM

og

CHML

koder for Rab escort proteiner (REP) og to isoformer af Rab geranylgeranyltransferase- (

RABGGT A

og

B

). Dette gjorde alt 284 Rabs og Rab-interagerende proteiner (figur 2).

Rab GTPaser cyklus mellem en aktiv GTP-bundne form, og en inaktiv BNP-bundet formular. Rab aktivering medieres af en guanin udveksling faktor (GEF). Hydrolysen af ​​bundet GTP katalyseres af en GTPase aktiverende protein (GAP), hvilket resulterer i inaktiveringen af ​​Rab proteinet. I sin aktive form er Rab forbundet med membraner og kan interagere med forskellige effektor proteiner. I sin inaktive form proteinet er cytosoliske og er i kompleks med et BNP dissociation inhibitor (GDI) protein.

Listen over gener analyseret i denne undersøgelse, og listen over de papirer, hvor de blev oprindeligt beskrevet er vist i tabel 1 og tabel S1. Figur 4 illustrerer klynge af proteiner vist sig at interagere med RAB27A /B (som eksempel) og figur S1 illustrerer alle Rab klynger analyseret; Rab proteiner er i gul, GEFs i grønne, huller i lyserøde og effektor proteiner i blåt.

Eksempel på Rab27 klynge. Den Rab27 klynge består af de to

RAB27

isoformer (

RAB27A

RAB27B

), GEF

MADD

, GAP

TBC1D10A

og 12 effektor proteiner. De andre Rab og Rab-interagerende proteiner er vist i supplerende Figur S1.

Model for blærekræft patogenese anvendt i denne undersøgelse

To vigtige progression veje har været hidtil identificeret i blærekræft, Ta vej kendetegnet ved en høj frekvens af

FGFR3

mutation og karcinom

in situ

(Cis) vej, hvor ingen eller sjælden

FGFR3

mutationer har blevet identificeret. I denne undersøgelse, vi fandt derfor to veje:

FGFR3

-mutated tumor vej og

FGFR3

non-muterede tumor-vejen (figur 5).

FGFR3

-mutated tumor vej omfattede TAG1 og tag2

FGFR3

-mutated tumorer, T1

FGFR3

-mutated tumorer og muskel-invasiv

FGFR3

-mutated tumorer (T2-4 tumorer). Vi analyserede to sæt blæretumorer (n = 152 i det første datasæt og n = 75 i det andet datasæt). Antallet af

FGFR3

-mutated TAG3 var for lille til at identificere dem som en særskilt gruppe (2 tumorer i det første datasæt og 1 tumor i andet datasæt), men de kunne ikke enten indgå i TAG1 /tAG2 gruppe på grund af deres forskellige kliniske og molekylære karakteristika, så de ikke blev anset for i analysen.

FGFR3

non-muterede tumor vej omfattede TAG3

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer, T1

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer og muskel-invasiv

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer. Transkriptom data fra Cis tumorer var ikke tilgængelige i vores serie. Vi brugte

FGFR3

-Ikke-muteret TAG3 tumorer i stedet for Cis. Disse tumorer deler flere ejendomme med Cis som de fremskridt til en invasiv fase [25] med en høj sandsynlighed (45%, [26]). Derudover begge læsioner er mikroskopisk meget ens på individuel celle undersøgelse. TAG1 /TAG2 tumorer ikke muteret til

FGFR3 Hotel (9 prøver i det første sæt af data, 2 prøver i det andet sæt af data) blev ikke behandlet i analysen, da de ikke passer i Cis-vejen: ja disse tumorer er af lav kvalitet og de sjældent videre til T1 og derefter til muskel-invasive tumorer [26].

Identifikation af op- eller ned-regulerede gener

for at identificere gener op – eller nedreguleres under blærekræft progression, de to veje i “FGFR3-model” blev analyseret separat. Vi brugte de tre grupper, TAG3, T1, og T2-4, der tidligere er defineret for

FGFR3

non-muteret vej og de tre grupper, TaG1G2, T1, og T2-4 for

FGFR –

muteret tumor-vejen (figur 5). For hver tumor gruppe blev ekspressionen af ​​Rab og Rab-interagerende protein-gener listet i tabel S1 sammenlignet med deres ekspression i normale urothelium (opnået uden stroma) gruppe ved hjælp af statistiske SAM testen. Resultaterne blev filtreret med følgende tærskelværdier: Fold Change (FC) 1,5 for opregulering (og 0,667 (= 1 /1,5) for nedregulering) og qValue 5%. Vi først analyseret en samling af prøver indeholdende 4 normal urothelium og 141 tumor prøver (se Materialer og Metoder) ved hjælp af Affymetrix HG U133 Plus 2,0 mikromatrice. 269 ​​af de 284 gener listet i tabel S1 var til stede i disse microarrays. På

FGFR3-

ikke-muterede tumor-vejen, blev fundet 19 gener, der skal nedreguleres og 12 gener opregulerede (tabel 2); for

FGFR-

muteret tumor vej, blev der fundet 21 gener, der skal nedreguleret og 4 gener up-reguleret (tabel 3) (resumé i figur 2).

“FGFR3 model “for blærekræft progression adskiller en

FGFR3

non-muterede tumor vej og en

FGFR3-

muteret tumor vej. Cis: Carcinoma

in situ

. Stages blev defineret af 1997 TNM klassificering og kvaliteter af 1973 World Health Organization klassifikation (se Materialer og Metoder til reference). Vejviser

Vi analyserede derefter et andet sæt af tumorer til verificere de opnåede resultater. Dette sæt, indsamles adskilt fra det første sæt, blev analyseret med Affymetrix HG U95A /U95Av2 mikromatrice og indeholdt 5 normal urothelium og 72 tumorprøver (se Materialer og fremgangsmåder). Kun 165 af de 284 gener listet i tabel S1 (58%) var til stede i disse microarrays. Blandt de 31 gener, viser sig at være op- eller nedreguleret i

FGFR3-

ikke-muterede tumor-vejen (Tabel 2), 17 var til stede på Affymetrix HG U95A /U95Av2 mikromatrice:

CASP1

,

CAV1

,

CD2AP

,

EEA1

,

ICA1

,

ITGA5

,

MICAL2

,

PIGR

,

RAB11A

,

RAB14

,

RAB31

,

RAB4A

,

RABAC1

,

STXBP1

,

TBC1D30

,

TBC1D4

ZWINT

. Blandt de 25 gener, viser sig at være op- eller nedreguleret i

FGFR3-

muteret tumor-vejen (tabel 3), 14 var til stede på Affymetrix U95A /U95Av2 mikromatrice:

CAV1

,

EEA1

,

ICA1

,

ITGA5

,

PIGR

,

RAB11FIP2

,

RAB14

,

RAB27A

,

RAB27B

,

RAB9A

,

RABGAP1L

,

SDC1

,

TBC1D30

og

UNC13B

. For disse gener, blev 56% af de opnåede resultater med det første sæt data valideres med det andet sæt af data med mindst én tærskel bestået: FC 1,5 (eller 0,667) og /eller qValue 5% (tabel S2). De andre resultater var ikke signifikant. Notatet blev der ikke uharmonisk resultat mellem de to sæt data fundet.

Expression analyser af opreguleret gener in vitro

En tumor er sammensat af både tumor og stromale celler. Som det transkriptomisk analyse udføres med denne blanding af celler, kan opregulering af et givet gen så være på grund af tilstedeværelsen af ​​stroma (gener opregulerede i stroma eller i tumorcellerne grund stromal celle – tumorcelle interaktion) .

For at løse dette problem, vi analyserede i normalt humant urotelial (Nhu) celler dyrket i kultur under regenerere og differentiere betingelser [27], [28], og i 7 etablerede blærekræft cellelinjer (uden stromale celler) ekspression af de 13 gener fundet at være opreguleret i

FGFR3-

ikke-muteret og muterede tumor veje:

CAV1

,

ITGA5

,

KIF20A

,

LEPRE1

,

MICAL1

,

MICAL2

,

RAB23

,

RAB31

,

RABAC1

,

SDC1

,

STXBP1

,

TMEM22

og

ZWINT

(tabel 2 og tabel 3). For de fleste af de gener, vi fandt i det mindste en cancer cellelinje, hvor dets ekspression var mindst to gange højere end i dyrkede normale urothelial celler. Dette var ikke tilfældet for

MICAL1

,

RABAC1

SDC1

(figur 6). Overekspressionen af ​​

MICAL1 Salg og

RABAC1

skyldes sandsynligvis tilstedeværelsen af ​​stromale celler i tumoren som

MICAL1

udtrykkes kraftigt i forskellige typer af hæmatopoietiske celler (dendritiske celler , mastceller og NK-celler) og

RABAC1

i mastceller (data ikke vist). Overekspressionen af ​​

SDC1

kunne skyldes stromal-epitel interaktion.

MICAL1

,

RABAC1

SDC1

blev udelukket til yderligere analyse (se oversigt i figur 2).

ekspressionen af ​​13 opreguleret gener (Tabel 2 og 3) (

CAV1

,

ITGA5

,

KIF20A

,

LEPRE1

,

MICAL1

,

MICAL2

,

RAB23

,

RAB31

,

RABAC1

,

SDC1

,

STXBP1

,

TMEM22

ZWINT

) blev målt ved Affymetrix array i 7 blære kræft cellelinier (KK47, MGHU3, RT112, RT4, scaber, SD48 og T24) og normale menneskelige urotelial (NHU) celler dyrket i kultur. Tærsklen for gener skal betragtes som opreguleret i tumorcellelinier (2 gange udtrykket målt i Nhu celler) er repræsenteret ved en sort streg.

Gener specifikt op- eller nedreguleret i hver vej

Blandt generne viser sig at være dereguleret under blærekræft progression (tabel 2 og tabel 3), 13 var fælles for begge veje, 10 nedreguleret:

EEA1

,

ICA1

,

MLPH

,

MYO5B

,

MYO5C

,

PIGR

,

RAB14

,

RPH3AL

,

SYTL2

,

TBC1D30

3 opreguleret:

CAV1

,

ITGA5

,

MICAL1

. For at søge efter gener specifikt liberaliseret i hvert vej, vi fortsatte i to trin. 1. Vi har valgt de gener, fundet signifikant op- eller ned- reguleres kun inden for

FGFR3-

ikke-muterede tumor vej eller inden for

FGFR3

-mutated tumor vej. 9 nedreguleret og 8 up-regulerede gener blev udvalgt til

FGFR3

non-muterede tumor vej og 11 ned-regulerede gener blev udvalgt til

FGFR3-

muteret tumor vej (tabel S3, venstre spalte). 2. Vi bruges statistiske SAM test til at sammenligne ekspressionen af ​​de udvalgte gener i tumoren gruppe med samme fase, men med modsat

FGFR3

mutation status (tabel S3, højre spalte).

SYTL1

var signifikant nedreguleret i T2-4 (

FGFR3

non-muterede) tumor gruppe hvorimod

LEPRE1

,

MICAL2

,

RAB23

STXBP1

var signifikant opreguleret i samme tumor-gruppen (tabel 4 og figur 7, se oversigt i figur 2). Ingen gen viste sig at være specielt dereguleret for

FGFR3-

muterede tumorer.

Angivelse af

SYTL1

,

LEPRE1

,

MICAL2

,

RAB23

STXBP1

målt ved Affymetrix array i normale prøver (n = 4) og

FGFR3

-mutated tumor prøver (TaG1G2, n = 28; T1 , n = 13; T2-4, n = 9), og

FGFR3-

ikke-muterede prøver (tAG3, n = 3; T1, n = 25, og T2-4, n = 63). Er repræsenteret det 10. percentil (under bar), den 25. percentil (rubrik nederst), median (bar i boksen), den 75

percentil (rubrik øverst) og den 90

percentil (øverste bar) . Punkterne repræsenterer vildskuddet prøver.

SYTL1

nedreguleres i

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer, mens

LEPRE1

,

MICAL2

,

RAB23

STXBP1

er opreguleret.

Analyse af klynger af gener

i den tidligere del af denne undersøgelse, vi brugte den statistiske SAM test analysere særskilt ekspressionen af ​​hvert gen under blærekræft progression. For at undersøge om en Rab klynge (bestående af en given Rab protein og dets interagerende partnere, se figur 4 og figur S1) kunne specifikt forbundet med blærecancer progression, anvendte vi den statistiske binomialtest at afgøre, om procentdelen af ​​gener dereguleret i en givet Rab klynge var signifikant større end procentdelen opnået ved at analysere alle Rab og Rab-interagerende protein-gener. Denne test blev anvendt for hver Rab klynge inden for hver tumor gruppe, og resultaterne blev filtreret med tærsklen p-værdi 1%. Interessant, Rab27 klyngen passerede denne tærskel for T2-4 tumor grupper af både den

FGFR3-

ikke-muteret og muterede tumor veje (tabel 5 og tabel S4, se oversigt i figur 2). Ud over

RAB27A

RAB27B

, generne nedreguleret i denne klynge omfatter

GCC2

,

MLPH

,

RPH3AL

,

SYTL1

SYTL2

.

gener forbundet med spredning

for at vurdere en mulig sammenslutning af de deregulerede gener, der er anført i tabel 2 og tabel 3 med celleproliferation, vi beregnet en Pearson korrelation mellem deres udtryk og den for spredning markørgenet:

MKI67

[29]. Til denne analyse, blandt de 6 grupper, der med dette studie, arbejdede vi med de to homogene tumor grupper med højere antal prøver: Ta G1 /G2 (

FGFR3

-mutated) tumor gruppe (28 prøver) og scenen T2-4 (

FGFR3

non-muterede) tumor gruppe (63 prøver). Vi først bemærket, som forventet, at ekspressionen af ​​

MKI67

var signifikant højere i T2-4 (

FGFR3

ikke-muterede) gruppen end i Ta G1 /G2 (

FGFR3

-mutated) gruppe (ca. 3 fold; Student test, p = 8.8E-10). Vi valgte at filtrere Pearson korrelationsværdier med tærsklen: | r | 0,479 (PVAL 1%) for den Ta G1 /G2 (

FGFR3

-mutated) tumor gruppe og | r | 0,323 (PVAL 1%) for den T2-4 (

FGFR3

non-muterede) tumor gruppe. Ekspressionen af ​​et gen blev anset for at være korreleret med ekspressionen af ​​

MKI67

hvis p-værdi 1% med begge tumor grupper. Udtrykket af

KIF20A

og

ZWINT

blev korreleret, mens ekspressionen af ​​

MYO5C

blev omvendt korreleret med ekspressionen af ​​

MKI67

(figur 8 og tabel S5, se oversigt i figur 2)

Pearson korrelationskoefficient (r) mellem ekspressionen af ​​de deregulerede gener og ekspression af spredning markørgen,

MKI67

, blev beregnet for.

FGFR3

-mutated tumorer i TaG1G2 gruppen (n = 28), og for

FGFR3

-Ikke-muterede tumorer i T2-4 (n = 63). Udtrykket af de deregulerede gener som en funktion af

MKI67

udtryk vises i TaG1G2

FGFR3

-mutated tumorer (øverste tal) og i T2-4 ikke-muterede tumorer (lavere tal). Kun grunde til de korrelerede gener præsenteres (p 1%, hvilket svarer til en korrelationskoefficient, | r | over 0,479 til

FGFR3

-mutated tumor gruppe og over 0,323 for

FGFR3

non-muteret tumor gruppe).

gener forbundet med differentiering

den samme analyse blev udført for at vurdere sammenslutning af deregulerede gener med differentiering processen med urothelial celler. De uroplakin gener

UPK1A

,

UPK1B

,

UPK2

,

UPK3A

og

UPK3B

, kodning for urothelium-specifikke markører [ ,,,0],30] – [33], og de to gener

GRHL3

[34] og

FOXA1

[28], som koder for transkriptionsfaktorer, blev brugt som markører for urotelial differentiering. Vi brugte de samme to tumor grupper som ovenfor. Resultaterne af Pearson korrelation blev filtreret med samme tærskler som ovenfor, og vi fandt, at ekspressionen af ​​et gen er korreleret med ekspressionen af ​​et andet gen, hvis p-værdi var mindre end 1% for begge tumor grupper. Resultaterne er vist i tabel 6 og tabel S6. Syv gener viste sig at være korreleret med mindst en urotelial differentiering markør:

ANKRD27

,

MLPH

,

MYO5B

,

RAB11A

,

RAB11FIP1

,

RAB20

SYTL2

. To gener viste sig at være omvendt korreleret med mindst en urotelial differentiering markør:.

CASP1

og

RAB27A

(se oversigt i figur 2)

Gen-ekspression i Nhu celler i kultur

Normale humane urothelial celler (Nhu celler) kan vokse i kultur i et endeligt antal passager, indtil de træder i ældning. Før ældning, kan differentiering induceres ved at dyrke dem i specifikke medier. Her Nhu celler, efter passage blev enten dyrket i ikke-differentierende betingelser (kontrol) eller til differentiering betingelser (i nærvær af en EGFR (epidermal vækstfaktor receptor) inhibitor og en aktivator af PPARγααμμ (peroxisomproliferatoraktiveret receptor gamma)) [28]. I kontrol- betingelser, celler flyder sammen og blive kontakt-hæmmede, mens de i differentierende betingelser også stoppe voksende, men begynde at udtrykke markører for urotelial terminal differentiering, såsom uroplakins (UPKs).

Vi brugte Affymetrix data Nhu celler i forskellige forhold til at se på ekspressionen af ​​generne tidligere fundet at være forbundet i tumorer med spredning eller differentieringsmarkører. De Nhu ekspressions data blev opnået på forskellige tidspunkter efter passage: 6 timer, 1 dag, 3 dage og 6 dage med eller uden differentiering medium. Som vist i figur 9, ekspressionen af ​​

KIF20A

og

ZWINT

faldt i kulturer behandlet med differentierende medium, såvel som i kontrolkulturer efter at have nået konfluens, indikerer et link af disse to gener med proliferation. I denne model,

MYO5C

blev ikke knyttet til spredning, som observeret i tumor udtryk data, men med differentiering (øget udtryk i differentierende medium, men ikke i kontrolgruppen medium). Blandt de 7 gener positivt korreleret med differentiering markører i tumorerne, blev seks faktisk fremkaldt af den differentierende medium (

MLPH

,

MYO5B

,

RAB11A

,

RAB11FIP1

,

RAB20

SYTL2

), men ikke

ANKDR27

. Ingen af ​​de to gener omvendt korreleret med differentiering (

CASP1

og

RAB27A

) blev nedreguleret ved differentiering i Nhu celler.

ekspression af generne sig at være forbundet med proliferation eller differentiering i tumorer blev målt i normale urothelial celler (Nhu) i kultur ved fire forskellige tidspunkter efter passage: 6 timer, 1 dag, 3 dage og 6 dage i differentierende betingelser (i nærvær af en inhibitor af EGFR og en aktivator af PPARγααμμ i NHU medium) eller i ikke-differentierende forhold (NHU medium kun).

diskussion

Voksende data viser, at Rab proteiner og deres effektorer er involveret i kræft progression både som hæmmende og fremmende faktorer. Men så vidt vi ved ingen systematisk undersøgelse har behandlet deres deregulering under kræft progression. I denne undersøgelse har vi identificeret en række gener, der koder for Rabs og Rab-interagerende proteiner, hvis ekspression dereguleret under blærekræft patogenese.

Relevansen af ​​to veje model

Baseret på klinisk og molekylær beviser