PLoS ONE: Rosiglitazon og AS601245 Fald Cell Adhesion og migration gennem Modulation af specifik genekspression i Human Colon Cancer Cells

Abstrakte

PPAR’erne er nukleare receptorer aktiveres af ligander. Aktivering af PPARy fører til en reduktion af friktion og motilitet i nogle kræftmodeller. PPARy transkriptionel aktivitet kan reguleres negativt af JNK-medieret phosphorylering. Vi postuleret, at anvendelse af midler i stand til at inhibere JNK aktivitet kunne øge effektiviteten af ​​PPARy-ligander. Vi analyserede virkningerne af rosiglitazon (PPARy ligand) og AS601245 (en selektiv JNK inhibitor) alene eller sammen på adhæsion og migrering af Caco-2, HT29, og SW480 human colon cancerceller og undersøges, gennem microarray analyse, de gener involveret i disse processer. Celleadhæsion og migration var stærkt hæmmet af rosiglitazon og AS601245. Kombineret behandling med de to forbindelser resulterede i en større reduktion af adhæsion og migration kapacitet. Affymetrix analyse i Caco-2 celler viste, at nogle gener, der var stærkt moduleret af den kombinerede behandling kan inddrages i disse biologiske reaktioner. Rosiglitazon, AS601245 og kombineret behandling nedreguleres ekspressionen af ​​fibrinogen kæder i alle tre cellelinier. Desuden rosiglitazon, alene eller sammen med AS601245, forårsagede et fald i fibrinogen frigivelse. ARHGEF7 /β-PIX-genet var stærkt nedreguleret ved kombineret behandling, og western blot analyse afslørede, at β-PIX protein down-moduleret i Caco-2, HT29 og SW480 celler, også. Transfektion af celler med β-PIX-genet fuldstændigt ophævede den inhiberende virkning på cellemigrering, bestemt ved rosiglitazon, AS601245 og kombineret behandling. Resultaterne viste, at β-PIX protein er involveret i hæmning af celle migration og fastholde det positive samspil mellem PPARy ligander og antiinflammatoriske midler i mennesker

Henvisning:. Cerbone A, Toaldo C, Minelli R, Ciamporcero E , Pizzimenti S, Pettazzoni P, et al. (2012) Rosiglitazon og AS601245 Fald Cell Adhesion og migration gennem Modulation af specifik genekspression i Human Colon Cancer Cells. PLoS ONE 7 (6): e40149. doi: 10,1371 /journal.pone.0040149

Redaktør: Frederic Andre, Aix-Marseille Universitet, Frankrig

Modtaget: Februar 22, 2012; Accepteret: 1 Jun 2012; Udgivet: 28 juni 2012

Copyright: © 2012 Cerbone et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af tilskud fra Regione Piemonte (https://www.ricerca-sanitaria-finalizzata.it/) og Universitá degli Studi di Torino (https://www.unito.it/unitoWAR/page/istituzionale/ricerca1/Ricerca_601) . De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

modstridende interesser:. AC og GR er ansat af MerckSerono Ivrea – RBM SpA Der er ingen patenter, produkter i udvikling eller markedsførte produkter til at erklære. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle de PLoS ONE politikker om datadeling og materialer, som beskrevet online i vejledningen for forfattere.

Introduktion

PPARy tilhører den nukleare receptor superfamilien består af en gruppe på ca. 50 transkriptionsfaktorer involveret i mange forskellige biologiske processer og betragtes som vigtige mål for udviklingen af ​​nye lægemidler [1]. PPARy-aktivering med agonister regulerer lipid opbevaring i adypocytes [2], inhiberer proliferation og inducerer differentiering og apoptose i en række cancerceller [3]. Således har PPARy-ligander blevet betragtet som potentielle lægemidler for forskellige former for kræft. Endogen PPARy-ligander indbefatter umættede fedtsyrer og flere prostanoider såsom 15-deoxy-prostaglandin J2 (15d-PGJ2) og 15-hydroxy-eicosatetranoic syre (HETE), som er metabolitter af arachidonsyre [4]. Syntetiske ligander omfatter insulin-sensibiliserende thiazolindinedione (TZD) class (troglitazon, pioglitazon og rosiglitazon), der anvendes til behandling af diabetes mellitus [5] – [6] og adskillige ikke-steroide anti-inflammatoriske lægemidler (NSAID), især indomethacin og ibuprofen, der er svage PPARy agonister ved høje mikromolære koncentrationer [7].

følsomheden af ​​de forskellige celletyper til PPARy-ligander meste afhænger af PPARy udtryk og aktivitet. Høje niveauer af PPARy udtryk er blevet rapporteret i fedt- og colon væv. Sidstnævnte er den vigtigste væv, der udtrykker PPARy i epitelvæv [1]. På trods af denne observation er antallet af studier, der undersøger PPARy i mennesker med tyktarmskræft begrænset. I prøver fra patienter med tyktarmskræft, immunhistokemisk analyse viste en sammenhæng mellem PPARy og cellecyklus-relaterede molekyler, men ingen sammenhæng blev opdaget mellem PPARy og patient overlevelse [8]. For nylig Ogino og samarbejdspartnere demonstreret, i kolorektal cancer patienter, at ekspressionen af ​​PPARy er forbundet med en god prognose [9], i overensstemmelse med de tidligere data indberettet af Jackson og samarbejdspartnere [10], som påviste, at PPARy (mRNA og protein) ekspressionsniveauerne blev trykket betydeligt i kolorektal cancer celler sammenlignet med matchede ikke-maligne væv. I dyreforsøg blev en mangel i tarm PPARy forbundet med forøget tumorgenicitet for tyndtarmen og tyktarmen af ​​ApcMin /+ mus [11]. Tilsvarende i musemodeller for coloncancer, PPARy-agonister inhiberede tumorvækst eller colon carcinogenese [12] – [14]. Disse data understøtter den hypotese, at PPARy ligander kan hæmme kolorektal tumor progression og kan være en vigtig terapeutisk mål.

A. Virkning af forskellige doser af rosiglitazon (10, 50, 100, 200, 250 uM) på Caco-2, HT29 og SW480-celleproliferation; B. Virkningen af ​​forskellige doser af AS601245 (0,1, 1, 2,5, 5, 10 uM) på Caco-2, HT29 og SW480-celleproliferation. Værdier detekteres ved måling af luminescens frigivet af metabolisk aktive celler. Værdierne, udtrykt i RLU’er er midler S.D. af tre separate eksperimenter.

En af de vigtigste aspekter i kræft progression, er erhvervelsen af ​​invasive adfærd, en multi-trins proces, der involverer kræftceller adhæsion til Vassel endotel og motilitet gennem ekstracellulære matrix. Det er blevet påvist, at PPARy-agonister påvirker disse parametre ikke kun i kontrollen af ​​celle betændelse [15], men også i flere typer af cancerceller [16], [17].

Udover ligandbinding, PPARy genomisk aktivitet kan moduleres ved forskellige cellulære processer.

Faktisk mitogene hormoner, vækstfaktorer og proinflammatoriske signaler er alle kendt for at reducere muligheden for PPARy til at reagere på ligandstimulering. De mekanismer, der styrer dette nedregulering er komplekse og omfatter phosphorylering [18], ubiquitinering [19], sumoylation [20], og cytoplasmatisk shuttling [21]. En nøgle nedregulere mekanisme involverer phosphorylering af forskellige mitogenaktiveret kinaser (MAPK’er), som er centrale signalering komponenter i reguleringen af ​​celledeling, differentiering overlevelse, stress respons og apoptose [22]. Navnlig er det blevet rapporteret, at c-Jun-terminal kinase (JNK) phosphorylerer PPARy og negativt regulerer dens transkriptionelle aktivitet [23]. På grundlag af disse observationer vi postuleret, at anvendelse af midler, der kan inhibere JNK aktivitet kunne øge effektiviteten af ​​PPARy-ligander. AS601245 [1,3-benzothiazol-2-yl (2 – {[2- (3-pyridinyl) ethyl] amino} -4-pyrimidinyl) acetonitril; JNK inhibitor V] er valgt som en potent og selektiv JNK hæmmer med anti-inflammatoriske egenskaber [24], og har været anvendt i det foreliggende arbejde at vurdere sit engagement med anti-kræftfremkaldende virkninger, der vises af rosiglitazon i kolon kræftceller. Især vi undersøgt virkningerne af rosiglitazon og AS601245, alene eller i forening, på vedhæftning og migration af humane colon cancerceller, og undersøgte de er involveret i disse processer gener, gennem microarray analyse (Affimetryx GeneChip).

Virkning af forskellige doser af rosiglitazon (0,01, 0,1, 1, 10, 50 pM), AS601245 (0,01, 0,1, 1, 10, 50 uM) og kombineret behandling på Caco-2, HT-28 og SW480 på celleadhæsion til HUVEC’er. Celler blev behandlet med eller uden lægemidlerne i 24 timer, høstet og inkuberet i 1 time på HUVEC monolag. Data er udtrykt som procent af adhæsionsinhibering versus ubehandlede kontrolceller. Kontrolværdien af ​​adhæsion var omkring 55 ± 6 celler pr mikroskopfelt (n = 6) for alle cellelinjer. Værdierne er middelværdien ± SD af 3 adskilte eksperimenter. Varians analyse: *

s

0,05, **

s

0,01 vs kontrol; # P 0,05 vs rosiglitazon; ## P 0,01 vs rosiglitazon; §. 0,01 vs begge forbindelser

Materialer og metoder

Etik Statement

Brugen af ​​HUVEC blev godkendt af den etiske komité af “Presidio Ospedaliero Martini “i Torino og gennemføres i overensstemmelse med Helsinki-deklarationen. Skriftligt informeret samtykke blev opnået fra alle patienter.

Cell Kultur og behandlinger

Caco-2, blev SW480 og HT29 colon kræftceller fås fra European Collection of Cell Cultures (ECACC) og dyrket ved 37 ° C i en fugtig atmosfære af 5% CO

2-luft. ECACC giver fuld kvalitetskontrol og autentificering procedurer for cellelinjer. Disse cellelinier er blevet valgt, fordi de repræsenterer tre celle modeller med forskellige potentialer invasionsevne: højere i HT29-celler, midt i Caco-2 celler og lavere i SW480 celler. Celler blev dyrket i D-MEM-medium (Caco-2 og SW480 celler) eller McCoys medium (HT29 celler) suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS, HyClone, Italien), 2 mM glutamin, 1% ikke essentielle aminosyrer opløsning og 1% antibiotisk blanding (penicillin-streptomycin) (Sigma, Milano, Italien).

Inhibering af tumor migration ved en Boyden kammer assay. Caco-2, blev HT29 og SW480 celler udpladet på den apikale side af Matrigelcoatede filtre i serumfrit medium suppleret med lægemidler ved forskellige koncentrationer (0,1, 1, 10, 50 pM rosiglitazon, 0,1, 1, 10, 50 pM AS601245 ) og med sammenslutningen af ​​de stoffer i forskellige koncentrationer i 24 timer. Kemoattraktant anvendt var 20% FCS suppleret medium, som er tilføjet i den basolaterale kammer. Cellerne migrerede til bunden af ​​filtrene blev farvet ved anvendelse crystalviolet og talt (5 felter af hver tredobbelte filtre) ved anvendelse af et omvendt mikroskop. Kontrol migration var 45 ± 8 celler /mikroskopfelter til Caco-2 celler, 50 ± 5 celler /mikroskopfelter for HT29 og 40 ± 3 celler /mikroskopfelter til SW480. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM (n = 5) af procentdelen af ​​inhibering versus migrationen af ​​celler udsat for vehikel (1% DMSO). Varians analyse *

s

0,05, **

s

0,01 vs kontrol; en

s

0,05, aa

s

0,01 vs rosiglitazon; b

s

0,05, bb

s

. 0,01 vs AS601245

Behandlinger med rosiglitazon og AS601245 [1,3-benzothiazol-2-yl – (2 – {[2- (3-pyridinyl) ethyl] amino} -4-pyrimidinyl) acetonitril; JNK inhibitor V] (SPRI, Geneve, Schweiz) blev udført ved resuspension af narkotika i DMSO. Koncentrationen af ​​køretøj i kultur ikke overstige 1%. Desuden kulturer, behandlet med 1% DMSO alene, blev udført for at udelukke køretøjets virkninger.

HUVEC blev isoleret som beskrevet andetsteds [25] og dyrket på gelatineovertrukne dyrkningsskåle i M199 medium suppleret med 20% varme -inactivated FCS, 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin, 5 UI /ml heparin, 12 ug /ml bovin hjerne ekstrakt og 200 mM glutamin. HUVEC blev udnyttet ved II-V passager.

Cell Proliferation og levedygtighed

Cell proliferation blev evalueret af kit “CellTiter-Glo Selvlysende Cell Levedygtighed Assay” (Promega, Milano, Italien). Dette assay detekterer luminescens frigivet af metabolisk aktive celler. Kvantificering af luminescens blev udtrykt som RLU (Relativ Light Unit). For spredning eksperimenter blev behandlinger udført ved tilsætning af lægemidlerne (i forskellige koncentrationer) til cellerne podet ved ca. 4.000 celler /brønd i en 96-brønds plade.

genekspression i Caco-2-celler behandlet med 50 pM rosiglitazon, 0,1 uM AS601245 og foreningen af ​​disse to forbindelser (rosiglitazon + AS601245) blev opdaget af microarray analyse 24 timer efter behandlingen. Venn-diagram viser antallet af gener moduleret af behandlingerne.

Vedhæftning Assay

HUVEC blev dyrket til konfluens i 24-brønds plader, vasket og efterladt på stedet for en dag i M199-medium plus 10% FCS. Kommerciel fluorescerende celle linker mini kit PKH67 (Sigma) blev anvendt til membran mærkning af colon cancerceller. Farvningen effektivitet blev overvåget ved fluorescensmikroskopi. Colon kræftceller (Caco-2, SW480 og HT29 celler) behandlet eller ubehandlet (24 timer) med rosiglitazon eller AS601245 (50 til 0,01 uM) eller begge stoffer, blev høstet og mærket som beskrevet ovenfor, og belagt (1-3 × 10

5 celler /brønde) i et slutvolumen på 0,25 ml M199 medium på ubehandlet HUVEC og efterladt på stedet i 1 time ved 37 ° C i 5% CO

2. Efter inkubation blev ikke-adhærente celler fjernet ved vask 3 gange med 1 ml M199-medium. Midten af ​​hver brønd blev analyseret ved fluorescens billedanalyse [26]. Vedhæftende celler blev talt under anvendelse Image Pro Plus software til mikro-imaging (Media Kybernetik, version 5.0). Single eksperimentelle punkter blev analyseret i fire eksemplarer, og standardfejlen af ​​de fire replikater var under 10% i alle tilfælde.

Fibrinogen frigivelse i Caco-2 celler udsat for forskellige koncentrationer (1-10-50 uM) af rosiglitazon, 0,1 uM AS601245 eller begge stoffer (50 uM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245). Data er udtrykt som procent af fibrinogen frigivelse i forhold til kontrolværdien og er middelværdien ± SD af 3 separate forsøg. Varians analyse: **

s

0,01 vs kontrol, # p 0,05 vs rosiglitazon

Matrigel Migration Assay

kemotaksiassay af kræft. celler blev udført ved Boyden kammer fremgangsmåde under anvendelse af et filter på 8,2 mm i diameter og 5,0 um porestørrelse (Neuro Probe, Inc .; BIOMAP SNC, Milano Italien) overtrukket med 0,1 ul /ml Matrigel (BD Matrigel ™ Matrix, BD Biosciences, Oxford , UK). Kort beskrevet medium indeholdende 20% FCS som en kemoattraktant blev anbragt i de nedre brønde. Oprindeligt Caco-2, HT29 og SW480-celler (i en slutkoncentration på 5 x 10

4 celler /ml) blev suspenderet i de øvre brønde (ca. 4000 celler /brønd for HT29 og 8000 celler /brønd for SW480 og CaCo- 2) i serumfrit medium suppleret med lægemidler ved forskellige koncentrationer (fra 0,1 um til 50 uM for både stoffer) og med sammenslutningen af ​​lægemidlerne i forskellige koncentrationer. Migrationen af ​​kontrol- ubehandlede celler, celle udsættes for køretøjet (1% DMSO) og kontrol- og behandlede celler eksponeres for mitomycin C (50 ug /ml) (Sigma) blev også analyseret. Kammeret blev inkuberet ved 37 ° C under 5% CO

2 i 24 timer. Kemotaksi blev kvantificeret ved at tælle de farvede celler, der migrerede til undersiden af ​​filteret ved hjælp af et optisk mikroskop (forstørrelse x 100). De farvede celler blev talt som det gennemsnitlige antal celler pr 5 tilfældige felter for hvert assay. Resultater udtrykkes som procentdel af inhibering af behandlede celler versus målte migration i celle udsættes for 1% DMSO. Disse betingelser blev opretholdt i transfekterede celler, også.

Fibrinogen Slip Bestemmelse

Fibrinogen (FBG) frigivelse i dyrkningsmedier blev analyseret ved hjælp af AssayMax menneskelige Fibrinogen (FBG) ELISE Kit fra Assaypro (St. Charles, MO, USA) ifølge producentens protokol.

Caco-2 celler blev dyrket i kolber og podet i en koncentration på 4 x 10

6 /kolbe. Celler, der udsættes for rosiglitazon (50, 10 og 1 uM), AS601245 (0,1 uM) eller begge stoffer (50 pM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245), blev høstet efter 24 timer fra begyndelsen af ​​eksperimentet og centrifugeret. De opsamlede supernatanter blev inkuberet i en 96-brønds plade overtrukket med et polyklonalt antistof specifikt for humant FBG. FBG i prøver blev klemt af det immobiliserede polyklonale antistof og biotinyleret polyklonalt antistof specifikt for humant FBG, som blev genkendt af en streptavidin-peroxidasekonjugat. Alt ubundet materiale blev vasket væk, og et peroxidase-enzym-substrat blev tilsat. Farveudviklingen blev standset, og intensiteten af ​​farven blev målt i en mikropladelæser ved en bølgelængde på 450 nm.

RNA-ekstraktion og Array Hybridisering

Caco-2 celler blev behandlet med vehikel (1% DMSO) eller 50 pM rosiglitazon eller 0,1 uM AS601245 eller rosiglitazon plus AS601245 i 24 timer, og totalt RNA fra 3 biologiske gentagelser af hver behandling blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Milano, Italien). Prøver blev behandlet med DNase for at undgå enhver genomisk kontaminering. Kvaliteten af ​​den resulterende RNA blev bestemt ved hjælp af Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies). RNA-indholdet blev normaliseret ved hjælp af Thermo Scientific NanoDrop ™ ND-1000 spektrofotometer. RNA-prøver af hver gentagelse blev analyseret ved hjælp af Affymetrix GeneChip Human Genome U133A plus 2,0 chips (Affymetrix). RNA-amplifikation, dobbeltstrenget cDNA syntese og generering af biotin-mærket cRNA ved in vitro transkription (IVT) blev udført ifølge producentens protokol under anvendelse af Affymetrix kits. Den endelige cDNA blev kontrolleret for kvalitet og kvantitet før fragmentering og chip hybridisering. Hver chip blev derefter vasket og farvet under anvendelse af en Fluidik station 450 (Affymetrix). Fluorescensintensitet for hver chip blev fanget med en Affymetrix GeneChip Scanner 3000 (Affymetrix). GCOS software version 1.2 (Affymetrix) blev anvendt til at definere proben celle og beregner intensiteten for hver celle. CEL filer genereret, der indeholder de sammenfattende intensiteter for hver probe, blev analyseret gennem følgende bioinformatiske metoder. Vi først vurderede den overordnede datakvalitet hjælp R /BioConductor. Derefter vi indlæst datasættet ind i Rosetta Resolver for data normalisering, generering af udtryk værdier, og statistisk analyse. Ekspressionsniveauer værdier for alle behandlingsgrupper blev opnået som forhold over for den negative kontrol (1% DMSO). Differential analyser mellem par af grupper blev udført med 1-vejs ANOVA efterfulgt af Benjamini-Hochberg multiple test korrektion (False Discovery Rate-FDR cut-off på 1%) og en Student-Newman-Keuls post-hoc analyse. Endelig blev differentielt udtrykte gener analyseret i Ingenuity Pathway Analysis software version 7.5 (Ingenuity® Systems, www.ingenuity.com).

RealTime RT-PCR

For at bekræfte Affymetrix resultater valgte vi 5 gener, der havde vist en 2-gange ændring i udtrykket for yderligere undersøgelse af real time PCR i et særskilt forsøg. To af disse (GANAB og MT2A) viste sig at blive forøget i Affymetrix analyse, hvorimod der ikke blev fundet andre to til at være faldet (FGA og FGFR2). Endelig blev et gen (ARHGEF7), kunne være stærkt reduceret i kombineret behandling, kun. Desuden analyserede vi ekspressionen af ​​de tre kæder af fibrinogen i Caco-2, HT29 og SW480 celler. Cellerne blev behandlet med 1% DMSO som køretøjet eller med 50 pM rosiglitazon, 0,1 uM AS601245 eller rosiglitazon plus AS601245 i 24 timer; totalt RNA fra 3 biologiske gentagelser af hver behandling blev isoleret under anvendelse af TRIzol-reagens (Invitrogen, Milano, Italien), blev derefter totalt RNA kvantificeres med en NanoDrop (Thermo Scientific) spektrofotometer til måling RNA koncentration og analyseret på en Agilent 2100 Bioanalyser at overvåge RNA kvalitet og integritet. Totalt RNA blev revers transkriberet til cDNA i en 20 pi reaktion under anvendelse af TaqMan ° højkapacitets cDNA Reverse Transcription Kit leveret af Applied Biosystems. 500 ng af total RNA blev anvendt som udgangsmateriale fra hver prøve. For hver RealTime PCR reaktionen blev revers transkriberet anvendte prøve som template. For at teste assay linearitet, blev en cDNA pulje først seriefortyndet. Reaktioner blev udført i nærvær af de kommercielle TaqMan® Gene Expression Assays og en 1 × koncentrationen af ​​TaqMan® Universal PCR Master Mix (Applied Biosystems). Mål-mRNA blev kvantificeret under anvendelse af et ABI 7900 HT Fast RealTime PCR-system (Applied Biosystems). Primere blev købt fra Applied Biosystems: GANAB (glucosidase, alpha, neutral AB, Hs00929274_m1), MT2A (metallothionein 2A, Hs02379661_g1), FGA (fibrinogen alfa-kæde, Hs00241027_

m1), FGB (fibrinogen beta-kæde Hs00905942_

m1 ) FGG (fibrinogen y-kæden Hs00241037_

m1) FGFR2 (fibroblastvækstfaktorreceptor 2, Hs01552926_m1) og ARHGEF7 (Rho guaninnukleotid udveksling faktor (GEF) 7, Hs00388776_m1). TaqMan prober blev mærket med en 5’reporterfarvestof (FAM, 6-carboxyfluorescein) og en 3’udslukningsfarvestof (TAMRA, 6-carboxytetramethylrhodamin). RealTime PCR-reaktioner blev udført i tre eksemplarer i microamp optiske 384-brønds plader i et samlet volumen på 10 pl /brønd. Data blev analyseret ved ABI Sequence Detection System (SDS) software ved hjælp af den relative kvantificering. Folden ændringer bestemmes af ΔΔCt fremgangsmåde som beskrevet i Applied Biosystems User Bulletin No. 2. Kort fortalt, niveauet for hvert mål-mRNA blev normaliseret til det niveau af 18S ribosomale RNA (housekeeping-gen) for at opnå den ACt og derefter den ΔΔCt blev beregnet mod DMSO behandling.

Western blot-analyse af β-PIX ekspression i Caco-2, HT29 og SW480-celler, der er behandlet i 24 timer med forskellige koncentrationer af rosiglitazon (1, 10, 50 uM) , AS601245 (0,1, 1, 10), og kombineret behandling med 50 pM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245. Lig protein loading blev bekræftet ved eksponering af membranerne til anti-β-actin-antistof. Kvantificering af proteinprodukter (til højre) blev udført ved densitometrisk scanning. Data er normaliseret ved hjælp af β-actin signal og er angivet som middelværdi ± SD fra tre uafhængige eksperimenter. (A) Western blot-analyse af Caco-2-celler og relative densitometriske værdier. (B) Western blot-analyse af HT29-celler og relative densitometriske værdier. (C) Western blot-analyse af SW480-celler og relative densitometriske værdier. Varians analyse:. * P 0,05, **

s

0,01 vs kontrol eller rosiglitazon behandlede celler

β-PIX transfektion

β-PIX plasmide blev købt af Qiagen (EIM0195303), opformeret i Escherichia coli kompetente celler (Promega) efter standardprocedurer og renses ansætte de EndoFree Plasmide Midi Kit (Qiagen). For transiente transfektionsforsøg, Caco-2, HT29 og SW-480 celler blev dyrket i seks-brøndsplade ved 80% konfluens, 6 ug af oprensede plasmide konstruktioner blev transficeret under anvendelse af Lipofectamine 2000 reagens (Invitrogen) ifølge producentens anvisninger. P-PIX ekspression blev vurderet 24 timer efter transfektion ved Western blot. For negativ kontrol blev pQE-TriSystem-6-vektoren (Qiagen) anvendes. blev udført mindst tre uafhængige forsøg for hver tilstand.

Statistisk analyse

2-vejs ANOVA blev udført i proliferation, adhæsion, migration, fibrinogen tests frigivelse og densitometrisk analyse af Western blotting.

Resultater

rosiglitazon og AS601245 Affect Cell proliferation

Indledende forsøg viste, at celledeling var påvirket af rosiglitazon og AS601245 indtil 96 timer, i en koncentrationsafhængig måde i alle tre linjer af tyktarmskræft celler testet (fig. 1). Men de lægemiddeldoser effektive til inhibering af celleproliferation med 50% (IC50) var temmelig høje. I Caco-2 celler, IC50 var 150 ± 25 uM for rosiglitazon og 2,5 ± 1 pM for AS601245. Doserne kan nedbringe celleproliferation med 20% (IC20) var: 50 pM ± 12 for rosiglitazon og 0,1 pM ± 0,1 for AS601245. IC50 og IC20 doser var meget ens i alle tre testede cellelinjer. De IC20 doser af rosiglitazon og AS601245, defineret i Caco-2 celler, blev derefter anvendt til microarray eksperimenter i denne cellelinie.

Cell Adhesion og Migration Efter rosiglitazon og AS601245 Behandlinger

i adhæsionsassayet, udført efter 24 timer fra begyndelsen af ​​behandlingen, tilsætning af 50 uM rosiglitazon alene resulterede i en reduktion af celleadhæsion til HUVEC med ca. 55% i Caco-2-celler og med 58% og 59% i HT29 og SW480 celler, (fig. 2). Niveauet af inhibering blev gradvist reduceret ved behandling af cellerne med lavere doser af rosiglitazon. I et første sæt eksperimenter blev celleadhæsion kapacitet analyseret i HCT116-celler, også. I denne cellelinie, blev celleadhæsion inhiberet med 71% efter behandling med 50 pM rosiglitazon og med 59% efter behandling med 10 pM rosiglitazon (data ikke vist). Behandlingen med 50 uM AS60124 reducerede adhæsionen ved ca. 55, 72 og 60% i Caco-2, HT29 og SW480 celler. Procentdelen af ​​inhibering blev gradvist reduceret ved behandling af cellerne med lavere doser af AS601245 og behandling med 0,1 pM AS601245 påvirkede ikke signifikant denne parameter. For at kontrollere, om den kombinerede behandling af rosiglitazon og AS601245 kunne have en additiv effekt i at hæmme celleadhæsion blev 0,1 uM AS601245 forbundet med stigende doser af rosiglitazon. I alle tre cellelinjer kombinationen af ​​0,1 uM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245 viste en additiv virkning med at reducere celleadhæsion. Den kombinerede behandling på 0,1 uM AS601245 med højere doser af rosiglitazon øgede effekten af ​​rosiglitazon alene at nå det maksimale niveau for hæmning. Alle tre typer af celler viste en lignende reaktion på behandlingerne.

A. Western blot-ekspression af Caco-2, HT29 og SW480 celler af kontrol og transficeret med den tomme plasmide og med plasmide bærer β-PIX-genet. B. Inhibering af tumorcelleinvasion af en Boyden kammer assay i celler transfekteret med β-PIX transporterer plasmide. Kontrolceller og transficerede celler blev udpladet på den apikale side af Matrigelcoatede filtre i serumfrit medium suppleret med lægemidler ved forskellige koncentrationer (10, 50 pM rosiglitazon, 0,1, 1, 10, 50 pM AS601245) og med associeringen af ​​forskellige koncentrationer i 24 timer lægemiddel. Kemoattraktant anvendt var 20% FCS suppleret medium, som er tilføjet i den basolaterale kammer. Cellerne migrerede til bunden af ​​filtrene blev farvet ved anvendelse crystalviolet og talt (5 felter af hver tredobbelte filtre) ved anvendelse af et omvendt mikroskop. Kontrol migration var 45 ± 8, 51 ± 8 og 33 ± 4 celler /mikroskop vilkår for Caco-2, HT29, SW480 celler, henholdsvis og 49 ± 5, 50 ± 6 og 30 ± 6 celler /mikroskop vilkår for Caco-2 , HT29 og SW480 celler, henholdsvis efter transfektion med β-PIX transporterer plasmide og tomme plasmide. Data er udtrykt som middelværdi ± SEM (n = 5) af procentdelen af ​​inhibering versus kontrol migration.

Migration blev undersøgt i Caco-2, HT29, og SW480 cellelinier. Antallet af migrerede celler /mikroskop banen ubehandlede kontrolceller var 45 ± 8 til Caco-2-celler, 50 ± 3 for HT29-celler og 40 ± 3 for SW480-celler. Værdien af ​​migration af kontrol- celler udsat for køretøjet (1% DMSO) blev 44 ± 6 til Caco-2-celler, 51 ± 8 for HT29-celler og 40 ± 5 for SW480-celler. Endvidere at udelukke, at de opnåede i behandlede celler resultater kan afhænge af celleproliferation, analyserede vi cellemigration i ubehandlede celler og i celler behandlet i 24 timer med de højeste koncentrationer af rosiglitazon eller AS601245 (50 uM) i nærvær af mitomycin C. Resultater opnåede viste, at migrationen værdierne var ens i fravær eller i nærværelse af mitomycin C (celler /mikroskop feltet var 45 ± 8 for kontrol Caco-2 celler og 44 ± 6 for Caco-2 kontrol celler behandlet med mitomycin, 50 ± 3 for kontrol HT29-celler og 49 ± 5 for celler behandlet med mitomycin; 40 ± 3 til styring SW480-celler og 42 ± 8 for celler behandlet med mitomycin). Procentdelene af inhibering i rosiglitazon behandlede celler var: 65% og 64% for Caco-2-celler, 79% og 80% for HT29-celler og 60% og 63% for SW480, med og uden mitomycin, henholdsvis; procentdelene af inhibering af AS601245 behandlede celler var: 55% og 50% for Caco-2-celler, 80% og 75% for HT29-celler og 92% og 87% for SW480-celler, med og uden mitomycin, henholdsvis)

.

I fig. 3 rapporteres resultaterne migration opnået i celler behandlet med rosiglitazon, AS601245 og begge stoffer, udtrykt som procentdelen af ​​inhibering i forhold migrationen af ​​celler udsat for køretøjet kun (1% DMSO). Migrationen blev signifikant inhiberet af 10 og 50 uM rosiglitazon og AS601245 i alle tre cellelinier. Behandlingerne med forskellige kombinationer af koncentrationer under 50 uM af begge forbindelser frembragte en additiv virkning ved inhibering af cellemigration. Den kombinerede behandling med koncentrationer på 50 uM rosiglitazon eller AS601245 producerede ikke additive virkninger (data ikke vist), sandsynligvis fordi disse koncentrationer, alene, frembragte en procentdel af inhibering tæt på plateauet.

microarray analyse af genekspression i Caco-2 celler

for at analysere, om cellen reaktioner på behandlingerne med rosiglitazon, AS601245 eller med begge stoffer var en konsekvens af et specifikt gen vej modulation, vi udførte microarray analyse ved hjælp af Affimetryx GeneChip platformen. Da inhibering af celleadhæsion og migrering ved rosiglitazon og AS601245 var meget ens i alle tre cellelinier af tyktarmskræft undersøgt, vælger vi Caco-2-cellelinje til at udføre denne analyse, 24 timer efter behandlingerne. De i denne undersøgelse anvendte doser var de i stand til at inducere en IC20 inhibering af Caco-2-celleproliferation (50 pM rosiglitazon og 0,1 uM AS601245).

Antallet af gener signifikant moduleret af rosiglitazon og ved AS601245 var meget høj . Den komplette liste over de gener, moduleres af rosiglitazon, AS601245 og ved den kombinerede behandling er rapporteret i de understøttende Information S1. Venn diagram (fig. 4) viser, at rosiglitazon moduleret 1260 gener, AS601245 moduleret 3245 gener og de kombinerede behandlinger moduleret 1188 gener. Blandt de, der berøres af rosiglitazon alene eller AS601245 alene gener, 1118 var almindelige i begge de to grupper. Den kombinerede behandling påvirkede 735 gener, der var til stede i både rosiglitazon og AS601245 grupper og 173 gener, som ikke var berørt af enten rosiglitazon eller AS601245, alene. Tabel 1 angiver de berøres af rosiglitazon ved AS601245 gener, og af den kombinerede behandling med rosiglitazon og AS601245, anbragt i forhold til de relative biologiske funktioner og noteret på grundlag af p-værdien. Fig. Fig.