PLoS ONE: PTEN Loss Øger PD-L1 Protein Expression og Påvirker Sammenhæng mellem PD-L1 Expression og kliniske parametre i kolorektal cancer

Abstrakt

Baggrund

Programmeret død ligand-1 (PD-L1) er blevet identificeret som en faktor, der er forbundet med dårlig prognose i en række kræftformer, og blev rapporteret til at være primært induceret ved PTEN tab i gliomer. Den kliniske effekt af PD-L1 og dens regulering af PTEN er endnu ikke fastlagt i kolorektal cancer (CRC),. I den foreliggende undersøgelse, vi kontrolleret regulering af PTEN om PD-L1 og yderligere bestemmes effekten af ​​PTEN på sammenhængen mellem PD-L1 udtryk og kliniske parametre CRC.

Metoder /Results

RNA-interferens fremgangsmåde blev anvendt til at nedregulere PTEN ekspression i SW480, SW620 og HCT116-celler. Det blev vist, at PD-L1-protein, men ikke mRNA, var signifikant forøget i celler transficeret med siRNA PTEN sammenlignet med den negative kontrol. Desuden blev kapaciteten af ​​PTEN at regulere PD-L1-ekspression ikke åbenbart påvirket af IFN-γ, den vigtigste inducer af PD-L1. Tissue microarray immunohistokemi blev anvendt til at detektere PD-L1 og PTEN i 404 CRC patientprøver. Overekspression af PD-L1 var signifikant korreleret med fjernmetastaser (P 0,001), TNM stadie (P 0,01), metastatisk progression (P 0,01) og PTEN udtryk (P 0,001). Univariate analyse afslørede, at patienter med høj PD-L1-ekspression havde en dårlig samlet overlevelse (P 0,001). Men multivariat analyse ikke understøtter PD-L1 som en uafhængig prognostisk faktor (P = 0,548). Univariate (P 0,001) og multivariat overlevelse (P 0,001) analyse af 310 placeret CRC patienter viste, at højt niveau af PD-L1-ekspression var forbundet med øget risiko for metastatisk progression. Endvidere den kliniske effekt af PD-L1 på CRC var ikke statistisk signifikant i en undergruppe af 39 patienter uden PTEN ekspression (fjernmetastase: P = 0,102; TNM stadium: P = 0,634, gennemsnitlig overlevelse: P = 0,482).

konklusioner

PD-L1 kan anvendes til at identificere CRC patienter med høj risiko for metastase og dårlig prognose. Denne kliniske manifestation kan delvis forbundet med PTEN udtryk

Henvisning:. Song M, Chen D, Lu B, Wang C, Zhang J, Huang L, et al. (2013) PTEN Loss Øger PD-L1 Protein Expression og Påvirker Sammenhæng mellem PD-L1 Expression og kliniske parametre i kolorektal cancer. PLoS ONE 8 (6): e65821. doi: 10,1371 /journal.pone.0065821

Redaktør: Jun Sun, Rush University Medical Center, USA

Modtaget: December 20, 2012; Accepteret: April 28, 2013; Udgivet: 13 juni 2013

Copyright: © 2013 Song et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Sun Yat-sen University “100 Talents Program”; Guangdong Innovative Research Team Program (2009010058); Videnskab og Informationsteknologi Bureau of Guangzhou, Guangdong (2011J5200009); Guangdong Provincial Institut for Videnskab og Teknologi (2012B050500004); og “985 Project” af Sun Yat-sen Universitet og Guangdong Translationel Medicin Public Platform (4.202.037). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Kolorektal cancer (CRC) er den næststørste årsag til kræftdødsfald i vestlige lande. Globalt er det den tredje mest almindeligt diagnosticeret kræft hos mænd og den anden mest almindeligt diagnosticeret kræft hos kvinder [1]. Hvad værre er, at dødeligheden af ​​CRC fortsætter med at stige i mange lande med metastatisk kolorektal cancer (mCRC) er den primære dødsårsag i de fleste patienter. Tidlig stadie CRC patienter havde en fem-års overlevelse på op til 90%, men satsen kunne falde til 60% af patienterne beløb med lymfeknude involvering, og endda ned til 10%, når metastaser er til stede [2]. Men det er svært at påvise mCRC på et tidligt tidspunkt kun er baseret på symptomer, som fører til komplicerede beslutning behandling gør, ofte med aggressive terapi eller behandling helligdage. En biomarkør, som kan identificere patienter med høj risiko for metastase og dårlig prognose kan have brede kliniske anvendelser. Undersøgelser, der søger efter sådanne biomarkører er rigelige. PD-L1 er et af de vigtigste emner af biomarkør forskning.

PD-L1 (også kendt som CD274, B7-H1), en af ​​de ligander for programmeret celledød 1 (PD-1), er en immun-inhiberende receptor tilhører CD28 /cytotoksiske T-lymfocyt antigen 4 (CTLA-4) familie. Det kan levere et inhiberende signal til PD-1 /B7-1 udtrykkende T-celler, hvilket resulterer i immun svækkelse [3], [4]. PD-L1-protein udtrykkes ofte på aktiverede T-celler, B-celler, NK-celler, DC’er, makrofager og knoglemarvafledte mastceller [5]. PD-L1-ekspression er også fundet på en lang række humane tumorer. Desuden har undersøgelser vedrørende PD-L1-ekspression til udfald sygdom blevet gjort i de fleste tumorer, og resultaterne viser, at PD-L1-ekspression stærkt korrelerer med ugunstig prognose i nyre [6], ovarie- [7], blære [8], bryst [9], lever [10], gastrisk [11], og pancreascancer [12], men ikke i ikke-småcellet lungekræft (NSCLC) [13]. Vigtigst disse undersøgelser viser, at højere ekspression af PD-L1 kan lette fremføringen af ​​tumor fase og øge invasionen potentiale. Men i CRC, den kliniske effekt af PD-L1 og dens regulering mekanisme er endnu ikke blevet bestemt,.

PD-L1-ekspression kan induceres af mange inflammatoriske mediatorer og cytokiner, hvoraf Interferon-γ (IFN- γ) er den mest potente. Det er blevet vist, at både type I og type II IFN’er opregulere PD-L1-ekspression i de fleste cancercellelinier. Kun få undersøgelser fokuserer på de lovgivningsmæssige rolle PD-L1 i tumorer. Desuden disse undersøgelser produceret divergerende resultater. En nylig undersøgelse viste, at tabet af tumor suppressor PTEN (phosphatase og tensin homolog slettet på kromosom ti) kan være en vigtig mekanisme, der øger PD-L1-ekspression i gliomcellelinier og patientprøver tumorprøver [14]. PTEN er en vigtig tumor-suppressor gen, som primært negativt regulerer celle-overlevelse signalering PI3K-proteinkinase B (AKT) pathway [15], [16]. Desuden viste akkumulerende undersøgelser, PTEN kan være et vigtigt gen, der er forbundet med tumormetastase [15], [17], [18]. Både i

vitro

i

vivo

eksperimenter af CRC viste, at PTEN styrer tumorigen og metastatisk potentiale. Det forlyder, at injektion af PTEN-mangelfulde celler i mus resulterede i langt mere pulmonal og “multi-placering” metastaser end injektion af kontrol celler [19]. Endvidere viser nogle kliniske data, at tab af detektion af PTEN ved immunfarvning var forbundet med fremskreden sygdom, levermetastaser og dårlig patientoverlevelse [20] – [22]. Men nogle nylige undersøgelser ikke støtte den rolle PTEN i reguleringen af ​​PD-L1 udtryk. Det blev sagt, at “PD-L1-ekspression blev moduleret gennem forskellige veje mellem forskellige typer tumorceller” [23].

Det er velkendt, at PD-L1 er en potent negativ regulator af antitumor immunitet, men det er uvist, om dette immun-udstrømmende virkning er tilstrækkelig til at gøre PD-L1 en særskilt faktor associeret med dårlig prognose for alle typer af humane cancere. Omvendt PTEN er blevet identificeret som en afgørende faktor i forskellige centrale processer i udviklingen af ​​kræft, og som et vigtigt gen for kræft diagnose og prognose. Efter den nylige opdagelse, at PD-L1-protein-ekspression korreleret med PTEN tab [14], kom vi til den hypotese, at tumor progression og PD-L1 udtryk uafhængigt er relateret til PTEN tab, og at den kliniske effekt af PD-L1 kan på fald delvist tilskrives sammenhængen mellem PTEN tab og PD-L1 udtryk.

i den foreliggende undersøgelse, vi først undersøgt effekten af ​​PTEN tab på PD-L1-ekspression i CRC-cellelinjer, og fast besluttet på, om den observerede effekt opretholdes i nærvær af IFN-γ. For det andet, vurderede vi sammenslutningen af ​​PD-L1 udtryk med sygdom udfald og PTEN udtryk i 404 CRC patienter med en median opfølgning på 5 år. Endelig undersøgte vi den kliniske betydning af PD-L1 i en undergruppe af 39 patienter med PTEN komplet tab at undersøge, om effekten af ​​PD-L1 i CRC er afhængig af PTEN udtryk.

Materialer og metoder

Etik Statement

Denne undersøgelse blev godkendt af de institutionelle anmeldelse bestyrelserne for Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina), og skriftligt informeret samtykke blev opnået fra hver patient.

Prøvetagning og Cell Culture

i denne undersøgelse blev 404 formalinfikserede, paraffinindlejrede prøver af CRC opnået fra tumor bred af Patologisk Institut for First Affiliated Sygehus, Sun Yat-Sen University (Guangzhou, Kina ). Disse 404 patienter, der var blevet diagnosticeret med CRC og gennemgik indledende kirurgisk resektion for CRC fra januar 2000 og november 2006, var opfølgning via telefon eller breve fra kirurgi op til april 2010 for at indsamle generel information, patologi rapporter og oplysninger om patienternes tilstand efter operationen.

Tre CRC-cellelinjer, blev SW480, SW620 og HCT116 købt fra Culture Collection of Chinese Academy of Science (Shanghai, Kina), og dyrket i RPMI 1640 suppleret med 10% FBS og 1% penicillin -streptomycin ved 37 ° C i 5% CO

2

RNA interferens (RNAi)

for at nedregulere PTEN udtryk, de specifikke siRNA-duplexer rettet mod menneskelige PTEN (forstand:. 5 ‘-GAGCGUGCAGAUAAUGACAdTdA-3′; antisense: 3’-dAdTCUCGCACGUCUAUUACUGU-5 ‘) blev syntetiseret og indkøbt fra RiboBio Co. Ltd (Guangzhou, Kina), og siRNA-duplexer med ikke-specifikke sekvenser blev anvendt som negativ kontrol (NC). SiRNA transfektion blev udført med lipofectamin 2000 (Invitrogen, CA, USA) med en koncentration på 100 nM. Transfektionseffektiviteten blev testet ved QRT-PCR og western blot. Disse eksperimenter blev udført i nærvær og fravær af rekombinant human IFN-γ (500 IE /ml, Peprotech, NJ, USA) og gentaget i triplikater.

Kvantitativ Reverse Transcription PCR (QRT-PCR)

Otteogfyrre timer efter transfektion blev totalt cellulært RNA ekstraheret med TRIzol-reagens (Invitrogen, CA, USA) ifølge producentens protokol. cDNA blev afledt fra 500 ng af total RNA under anvendelse af cDNA revers transkription kit (Toyobo, Osaka, Japan). Derefter blev real time PCR udført under anvendelse af kvantitativ SYBR Green PCR kit (Takara Bio, Dalian, Kina) på ABI 7500 RT-PCR System (Applied Biosystems, CA, USA) ifølge producentens protokol. De anvendte primere er anført i tabel 1, blev PTEN og PD-L1 relativ genekspression niveau analyseres ved hjælp af sammenlignende C

T metoden (også kaldet 2

-ΔΔCT metode). Nærmere oplysninger om metode sammenlignende C

T er tidligere blevet beskrevet [24], [25]. Kort fortalt blev tre gentagne PCR-amplifikationer udført for hver prøve. β-actin blev anvendt som en intern kontrol. Den gennemsnitlige C

T blev beregnet for begge målgenerne og β-actin. Den ΔC

T blev bestemt som (gennemsnittet af de tredobbelte C

T værdier for målgenet) minus (gennemsnittet for tre eksemplarer C

T-værdier for β-actin). Den ΔΔC

T repræsenterede forskellen mellem de parrede cellelinjer, hvor PTEN ΔΔC

T = ΔC

T fra celler transficeret med siRNA minus ΔC

T af den negative kontrol og PD-L1 ΔΔC

T = ΔC

T fra celler behandlet med IFN-γ minus ΔC

T af de ubehandlede kontrolceller. Den relative ekspressionsniveau blev udtrykt som 2

-ΔΔCT.

Western Blot

Tooghalvfjerds timer efter transfektion blev cellerne vasket tre gange med phosphatbufret saltvand (PBS ) og lyseret med RIPA-buffer (Dingguo, Beijing, Kina) suppleret med protease og phosphataseinhibitorer (Merck Bioscience, Darmstadt, Tyskland). Bagefter blev PTEN proteinniveauer bestemt ved anvendelse tofarvet fluorescerende western blotting på Odyssey infrarøde billeddannende system (LI-COR, Nebraska, USA) som tidligere beskrevet [26]. Kort fortalt, blev lige store mængder af protein separeret ved 10% natriumdodecylsulfat-polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) og overført til en polyvinylidenfluorid (PVDF) membran (Pall, New York, USA). Membraner blev derefter blokeret med 5% BSA i 1 time og inkuberet med primære antistoffer natten over ved 4 ° C [Primært antistof: Rabbit anti-PTEN (fortyndet 1:10000, Epitomics, CA, USA); Kanin-anti-Akt (fortyndet 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Kanin anti-phospho-Akt

Ser473 (fortyndet 1:1000, Cell Signaling Technology, MA, USA); Mus β-actin antistof (fortyndet 1:10000, Proteintech, Chicago, USA)]. Den næste dag, efter inkubering med arter-relevant fluorescens konjugerede sekundære antistoffer i 1 time ved stuetemperatur, blev membranerne analyseret ved anvendelse af Odyssey infrarød billeddannelse system.

Flowcytometri

PD-L1-ekspression på celleoverfladen blev bestemt under anvendelse flowcytometre. Celler blev høstet og inkuberet med anti-human PD-L1 PE-Cy7 (eBioscience, CA, USA) eller isotype-matchet kontrol antistof (eBioscience, CA, USA) i 30 minutter i mørke på is (0,5 ug antistoffer til 10

5 celler i et slutvolumen på 100 pi). Efter prøver blev vasket tre gange, blev farvede celler resuspenderet og analyseret på BD FACSCanto II (BD Biosciences, CA, USA) under anvendelse FlowJo software (TriStar, CA, USA). Standardiserede fluorescensintensiteter blev beregnet ved at dividere median fluorescensintensiteter af specifikke antistoffer ved medianen fluorescensintensiteter af isotype-matchet kontrol. Alle data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. Statistisk signifikans blev bestemt ved parrede-prøver

t

test.

Tissue Microarray (TMA’er) og Immunhistokemi (IHC)

TMA’er blev bygget ved hjælp af automatiserede væv microarray instrument (ALPHELYS, Plaisir, Frankrig). Efter identifikation af de H 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Sammenslutninger af PD-L1 /PTEN udtryk med kliniske parametre blev evalueret ved hjælp af Wilcoxon rank sum test (for to populationer, der er relateret) eller Kruskal- Wallis test (for mere end to populationer, der er relateret), fordi data fra PD-L1 /PTEN udtryk indeks er ikke i overensstemmelse med en normalfordeling (Shapiro-Wilk test: P 0,001). Samlet overlevelse (OS) og metastase overlevelse (MFS) blev estimeret ved anvendelse af Kaplan-Meier-metoden. Bliver diagnosticeret som metastase under opfølgning i de placeret CRC (pM0) patienter blev defineret som den terminale begivenhed for MFS-analyse. De sammenslutninger af PD-L1 /PTEN udtryk med resultatet sygdom blev evalueret ved hjælp af Cox proportionel risiko regressions modeller. Den optimale single cut-point for PD-L1 /PTEN udtryk, separate patienter i en gruppe med PD-L1 /PTEN højere udtryk og en gruppe med PD-L1 /PTEN lavere udtryk blev bygget af X-flise software som tidligere beskrevet [23 ], [24]. Lignende foreninger og overlevelse analyse blev udført i den delmængde af 39 patienter uden PTEN udtryk, som repræsenterer gruppe, hvor confounding rolle PTEN styres.

Resultater

Ikke PTEN Tab men IFN -γ induceret PD-L1 mRNA-ekspression i CRC cellelinier

Både mRNA-niveauet og proteinniveauet af PTEN faldt i celler transficeret med siRNA PTEN sammenlignet med den negative kontrol. MRNA-niveauet af PTEN blev reduceret ned til ca. 12,4% i SW480, 14,6% i SW620, 22,6% i HCT116 ved 48 h efter transfektion i celler transficeret med siRNA PTEN sammenlignet med den negative kontrol (fig. 1. A). Der var ingen signifikant forskel i PD-L1 mRNA-niveauet mellem cellerne transficeret med siRNA PTEN og den negative kontrol. Derimod PD-L1 mRNA-niveauet steg betydeligt i celler, som blev udsat for IFN-γ i forhold til de matchede-kontrol celler uden udsættelse for IFN-γ (ca. 8-folds) (fig. 1. B).

(a) de relative ekspressionsniveau af PTEN-mRNA (detekteret ved QRT-PCR, beregnet ved 2

-ΔΔCT metode) i fire grupper: celler transficeret med siRNA PTEN eller ikke-specifikke sekvenser i nærvær eller fravær af IFN -γ. (B) Den relative ekspressionsniveau af PD-L1 mRNA i fire grupper af celler. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. Fejl- søjler repræsenterer SD.

Både IFN-γ og PTEN Loss Induceret PD-L1-protein Ekspression i CRC

Vi evaluerede virkningerne af PTEN knockdown på Akt aktivering i nærvær /fravær af IFN-γ. Phospho-Akt

Ser473 steg i celler transficeret med siRNA PTEN sammenlignet med den negative kontrol, uanset tilstedeværelsen af ​​IFN-γ (fig. 2). PD-L1-protein-ekspression blev signifikant forøget i celler transficeret med siRNA PTEN sammenlignet med den negative kontrol (P 0,05). Desuden har tilstedeværelsen af ​​IFN-γ ikke ændre denne udgangssituationen (fig. 3).

protein udtryk niveau af PTEN, Akt og phospho-Akt

Ser473 blev bestemt ved Western blotting. β-actin blev anvendt til at verificere lig belastning. Repræsentative billeder er valgt fra udførte eksperimenter gentages i tre eksemplarer

PD-L1-protein udtryk niveau på overfladen af ​​SW480, SW620 og HCT116 blev bestemt ved flowcytometer:. Celler transficeret med siRNA PTEN (røde linjer) og celler transficeret med ikke-specifikke sekvenser (blå linjer) i fravær af IFN-γ; celler transficeret med siRNA PTEN (sorte linjer), og celler transficeret med ikke-specifikke sekvenser (orange linjer) i nærvær af IFN-γ; celler farvet med isotype-matchet kontrol antistof (skraverede område). Standard fluorescensintensitet af PD-L1-protein blev beskrevet af histogrammet i højre panel: celler behandlet (hvid søjle) eller ubehandlede (grå søjle) med IFN-γ. Data blev indsamlet fra tre uafhængige forsøg. Fejl- søjler repræsenterer SD. . (* P 0,05 af parrede-prøver

t

test)

IFN-γ induceret PD-L1 protein med to forskellige strukturer i SW480 Cell Linje

Den flowcytometri histogrammer viste to toppe i SW480-celler behandlet med IFN-γ (500 IU, 72 timer), mens der kun var en enkelt distinkt top i ubehandlede gruppe. Desuden blev kun en enkelt distinkt top observeret i SW620-celler og HCT116 celler både i nærvær og fravær af IFN-γ (fig. 3). For at bestemme, om disse to toppe var tidsafhængig eller dosering-afhængig, behandlede vi SW480-celler med forskellig dosering af IFN-γ i 48 timer. PD-L1-protein blev maksimalt forøget ved 500 IU /ml IFN-γ. Tidsforløbet virkning af IFN-γ på PD-L1-protein blev bestemt derefter. SW480 blev behandlet med 500 IU /ml IFN-γ i 0, 24, 48 og 72 timer. Resultaterne viste, at i nærvær af IFN-γ, uanset doseringen af ​​IFN-γ og behandlingstiden, PD-L1-protein med to forskellige strukturer blev anerkendt på overfladen af ​​SW480-celler (fig. 4).

(A) SW480 behandlet med IFN-γ på angivne koncentration (0 IU /ml, 50 IU /ml, 100 IE /ml, 500 IE /ml, 1000 IE /ml). (B) SW480 behandlet med 500 IU /ml IFN-γ for tiltalt gange (0 timer, 24 timer, 48 timer og 72 timer). Skraverede område repræsenterer SW480 uden behandling af IFN-γ, og tal ved siden af ​​toppe repræsenterer standard fluorescens intensiteten af ​​PD-L1. Repræsentative billeder er valgt fra udførte eksperimenter gentages i tre eksemplarer

Patient Opfølgning

Blandt de 404 patienter, 5 patienter ( 3%). Var gået tabt i slutningen af opfølgning, 110 patienter (27,2%) var døde ved en median follow-up tid på 2,7 år (spændvidde: 0.1-9.1 år), og de resterende 288 patienter havde en median follow-up tid på 5,8 år (interval: 0,1 -10.2 år). Da IHC blev udført, blev vævet af 57 patienter vasket af objektglas, og de resterende 347 patienter havde immunohistokemiske data. Der var ingen forskel i den samlede overlevelse mellem patienter med og uden immunhistokemiske data (P = 0,716, log-rank test). Der var heller ingen signifikant forskel i metastatisk progression (diagnosticeret som metastaser efter kirurgi) satserne mellem patienter med og uden immunhistokemiske data (12,4% og 14,0%, P = 0,682).

Korrelation af PD-L1 /PTEN Expression og kliniske parametre

immunhistokemisk farvning af PD-L1 ligger i cellemembranen og endomembrane systemet havde et udtryk indeks lå 0-15,9 (median: 2,33) (figur 5. en

1-D

1, A

2-D

2). PTEN blev placeret i cytoplasma med et udtryk indeks lå 0-54,7 (median: 5,57) (. Figur 5. E

1-G

1, E

2-G

2) .Der var 39 patienter, der ikke havde nogen PTEN udtryk (fig. 5. H

1, H

2).

(A

1, A

2, E

1 , E

2) Negativ kontrol; (B

1, B

2, F

1, F

2) Prøver fra den samme patient med metastatisk progression; (C

1, C

2, G

1, G

2) Prøver fra en anden patient uden metastatisk progression; (D

1, D

2) En typisk repræsentant som viste, at PD-L1-ekspression er forhøjet i tumorområdet (T) sammenlignet med dem for tilstødende normale mucosa (N); (H

1, H

2) Prøver fra patient uden PTEN udtryk; (J, K) Statistisk analyse viste, at PD-L1-ekspression er forøget i patienter med metastatisk progression sammenlignet med dem uden metastaserende progression, mens en sådan statistisk analyse af PTEN ikke var signifikant. (To paneler, farvet med PD-L1-antistof, to ned paneler, farvet med PTEN antistof), (A

1-H

1, x 100, A

2-H

2, × 400)

Som vist i tabel 2, patienter med højere PD-L1-ekspression var mere tilbøjelige til at udstille fjernmetastaser (pM) (p . 0,01), ugunstige patologiske funktioner (2007 TNM klassifikation) (P 0,01), og metastatisk progression (P 0,001) (. figur 5. J), og PD-L1-ekspression var korreleret med PTEN udtryk i nogen grad (P 0,001). Der var ingen statistisk signifikant forskel mellem køn, alder, tumor location, primær tumor klassifikation (pT), regional lymfeknude involvering (PN), eller tilbagefald efter operation. Omvendt PTEN udtryk havde ingen signifikant sammenhæng med de primære variabler (pT: P = 0,221; PN: P = 0,131; pM: P = 0,525; TNM stadie: P = 0,337; gentagelse: P = 0,397; metastatisk progression: P = 0,710 ). Den samlede overlevelse og metastase overlevelse blev heller ikke forbundet med PTEN ekspression (P = 0,366, P = 0,141 henholdsvis) (fig. 6. C, D).

(A, B) den OS og MFS var signifikant lavere i PD-L1-højere-ekspressions patienter sammenlignet med PD-L1-lavere-ekspressionssystemer patienter (både P 0,001). (C, D) OS og MFS var ikke signifikant forskellig mellem PTEN-højere-udtryk patienter og de PTEN-lavere-udtryk patienter (OS, P = 0,366; MFS, P = 0,141). (E) I den delmængde af 39 patienter med komplet PTEN tab, PD-L1-ekspression ikke længere forbundet med OS (P = 0,482).

Survival Analysis

Analyse af X-flise software afslører, at 1,49 var den optimale cut-point, der adskilte patienter i en gruppe med PD-L1 højere ekspression og en gruppe med PD-L1 lavere ekspression. Kaplan-Meier-kurve og log-rank test viste, at den samlede overlevelsesraten for patienter med lavere PD-L1-ekspression var betydeligt højere end de patienter med højere PD-L1-ekspression (figur 6A, χ2 = 13,964, P. 0,001). 5-års OS sats var 62,9% for patienter med højere PD-L1-ekspression og 81,1% for patienter med lavere PD-L1-ekspression. I multivariat analyse af Cox proportional hazard model, PD-L1 var ikke en selvstændig prognostisk faktor for CRC efter justering for de variabler, der opfylder PH antagelse (alder, tumor placering, differentiering kvalitet, pT, PN, pM, metastatisk progression) (P = 0,548). Men hvis variable, der signifikant associeret med PD-L1-ekspression (pM, metastatisk progression) ikke blev justeret for i multivariat analyse, PD-L1-ekspression blev en signifikant prædiktor for CRC (P 0,01). (Tabel 3)

Som det fremgår af vores resultater, PD-L1 tilbøjelige til at associere med metastase variabler. Så for yderligere at bestemme sammenslutning af PD-L1 med kræft metastatisk progression, vi studerede den delmængde af 310 patienter med lokaliseret CRC (pM0), hvoraf 28 (9,03%) udviklet sig til fjernmetastaser ved en median opfølgning på 5.14 år ( interval, 0.06-10.14 år). I denne undergruppe blev PD-L1-ekspression signifikant associeret med metastase overlevelse (MFS) (Fig 6B, χ2 = 21,444, P. 0,001). Den 5-årige MFS sats var 99,5% for PD-L1-lavere-udtryk patienter og 72,1% for PD-L1-højere-udtryk patienter. Desuden Cox analyse afslørede, at PD-L1-ekspression var en signifikant prædiktor for metastatisk progression. (RR: 1.165; 95% CI: 1,072-1,268; P 0,001)

Interessant nok i delmængden af ​​39 PTEN -no-ekspressionsvektorer patienter, hvor confounding virkning PTEN på PD-L1 kontrolleres, blev PD-L1-ekspression ikke længere knyttet til fjernmetastaser (P = 0,102), TNM stadie (P = 0,634), og overlevelse analyse viste, at der var ingen signifikant forskel i den samlede overlevelse mellem PD-L1-højere-udtryk gruppe og PD-L1-lavere-udtryk gruppen (fig. 6E, χ2 = 0,494, P = 0,482).

diskussion

PD-L1 har været en af ​​de store emner for tumor biomarkør forskning i det seneste årti. Et stort antal undersøgelser har påvist en sammenhæng mellem tumor aggressivitet og PD-L1-protein-ekspression. I den foreliggende undersøgelse, vi gav også stærke beviser for, at et højere niveau af PD-L1-ekspression i CRC letter udvikling af tumor scenen og metastatisk progression. Den samlede overlevelsesraten for patienter med lavere ekspression af PD-L1 var signifikant højere end den for patienter med højere ekspression af PD-L1. Endvidere blev PD-L1-ekspression også signifikant associeret med metastase overlevelse i de 310 placeret CRC patienter. Imidlertid blev PD-L1-ekspression ikke signifikant associeret med ugunstig prognose efter justering for metastaser og metastatisk progression af multivariat overlevelsesanalyse. Dette er i modstrid med den tidligere observation, at PD-L1 udtryk forbliver forbundet med ugunstige prognose ved multivariat analyse i nyre celle karcinom patienter [6]. En forklaring på denne uoverensstemmelse kan være de forskellige variabler, der er korrigeret for i multivariate model. I den tidligere undersøgelse blev det metastatiske progression variabel (diagnosticeret som metastaser efter operation) ikke justeret i den multivariate overlevelse analyse. Det er velkendt, at metastaser er den primære dødsårsag i CRC patienter; så når vi justeret for denne død-relaterede variable, PD-L1 ikke længere var en uafhængig prognostisk faktor for CRC.

Beviser fra litteratur og vores forskning viste, at PD-L1 overekspression er tæt forbundet med cancer progression ( især med metastase progression), hvilket gør PD-L1 en lovende biomarkør og terapeutiske mål for tumorer. Imidlertid er den mekanisme, hvormed PD-L1 øger cancer progression dårligt forstået. Som beskrevet i litteraturen, kan disse foreninger tilskrives velkendt “molekylær shield” leveres af PD-L1. Det blev rapporteret, at PD-L1 tilvejebringer en “skærmende” effekt for at beskytte tumorceller mod lysis med cytotoksiske T-celler. Endvidere blev PD-L1 sig at have en anti-apoptotisk virkning på tumorceller [3], [30]. en i

vivo

undersøgelse viste dog, at transgen ekspression af PD-L1 i en PD-L1-mangelfuld naive mus ikke ændrede sin tumorigenicitet [31]. I multicenter fase I forsøg, Brahmer et al erklærede, at antistof-medieret blokade af PD-L1 inducerer holdbart tumorregression og forlænger stabilisering af sygdommen hos patienter med udvalgte fremskredne kræftformer. Desværre, kolorektal cancer er ikke en af ​​disse udvalgte kræftformer [32]. Vi spekulerede på, om evnen til at ødelægge “molekylære skjold” kan give tilstrækkeligt grundlag for dette kliniske forening i CRC. Andrew T Parsa foreslog også, at det omfang, hvori PD-L1 protein-ekspression direkte påvirker kræft progression er endnu ikke fastslået [14].

I denne undersøgelse at identificere yderligere indirekte virkninger af PD-L1 udtryk om kræft progression vi studerede signalveje involveret i reguleringen af ​​PD-L1-ekspression i CRC.