PLoS ONE: Identifikation af O-bundne glycoproteiner binding til lectin vinbjergsnegl Agglutinin som markører af metastatisk colorectal Cancer

Abstrakt

Baggrund

Protein glykosylering er en vigtig post-translationel modifikation vist til ændres i alle tumortyper undersøgt til dato. Mucin glycoproteiner er blevet etableret som vigtige bærere af

O

forbundne glycaner men andre glycoproteiner udviser ændrede glycosylerings repertoirer er endnu ikke identificeret, men tilbyde potentiale som biomarkører for metastatisk cancer.

Metode

i denne undersøgelse blev anvendt en glycoproteomic tilgang til at identificere glycoproteiner udviser ændringer i glykosylering i kolorektal cancer og vurdere ændringerne i

O

bundet glycosylering i forbindelse med p53 og KRAS (codon 12/13 ) mutation status. Affinitetsoprensning med carbohydratbindende protein fra

Helix pomatia

agglutinin (HPA) koblet til 2-dimensional gelelektroforese med massespektrometri for at muliggøre identifikation af lav tæthed

O- Salg bundne glycoproteiner fra human kolorektal cancer prøver.

Resultater

Aberrant

O-

bundet glycosylering blev observeret at være en tidlig begivenhed, der fandt sted uafhængigt af p53 og KRAS status og korrelerer med metastatisk kolorektal cancer . Affinity rensning ved hjælp af lectin HPA efterfulgt af proteomisk analyse viste annexin 4, annexin 5 og CLCA1 øges i metastatisk kolorektal cancer prøver. Resultaterne blev valideret ved hjælp af en yderligere uafhængig sæt prøver, og dette viste en signifikant sammenhæng mellem farvningen score for annexin 4 og HPA og tid til metastase; uafhængigt (annexin A4: Chi square 11.45, P = 0,0007; HPA: Chi square 9,065, P = 0,0026) og i kombination (annexin 4 og HPA kombineret: Chi square 13,47; P = 0,0002)

Konklusion

glycoproteiner viser ændringer i

O

bundet glycosylering i metastatisk kolorektal cancer er blevet identificeret. Glycosyleringen ændringer var uafhængig af p53 og KRAS-status. Disse proteiner giver potentiale for yderligere udforskning som biomarkører og potentielle mål for metastatisk kolorektal cancer

Henvisning:. Peiris D, Ossondo M, Fry S, Loizidou M, Smith-Ravin J, Dwek MV (2015) Identifikation af

O

-bundet Glycoproteiner Binding til Lectin

vinbjergsnegl

Agglutinin som markører af metastatisk kolorektal cancer. PLoS ONE 10 (10): e0138345. doi: 10,1371 /journal.pone.0138345

Redaktør: Lu-Gang Yu, University of Liverpool, Storbritannien

Modtaget: Juni 15, 2015; Accepteret: August 28, 2015; Udgivet: 23. oktober 2015

Copyright: © 2015 Peiris et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed: Alle relevante data er inden for papir og dens støtte Information filer

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Against Breast Cancer, Registreret Charity nummer 1121258 (finansieret DP og SF). De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Baggrund

Glycosylering er en vigtig posttranslationelle modifikation, der har vist sig at blive ændret i alle typer cancer undersøgt til dato. De gener, der koder for enzymer involveret i glycosyleringsreaktioner udgør ca. 1% af det humane genom forklarer utal af glycosylerings ændringer præsenteret i cancer. Metastase, formidling af celler fra den primære tumor til fjerne organer, er et stort problem, der berører patienter diagnosticeret med kolorektal cancer (CRC) [1]. Derfor tidlig diagnosticering af metastatisk CRC er et vigtigt mål, og der er behov for nye prognostiske markører til at identificere patienter med den højeste risiko for at udvikle metastaser at gøre det muligt onkologer at skræddersy behandlingsstrategier til risikogrupper af patients.Alterations i glykosylering høje har vist sig at være forbundet med metastatisk adfærd af tumorceller [2,3] og kan identificeres ved anvendelse carbohydratbindende proteiner, lectiner, isoleret fra en lang række organismer, herunder bakterier, planter, hvirvelløse dyr og hvirveldyr [4]. Den lektin

vinbjergsnegl

agglutinin (HPA) genkender

O

knyttet glykanstrukturer [5,6] og blev første gang vist sig at binde fortrinsvis til brystkræft fra patienter med dårlig prognose [2] [ ,,,0],7]. Anvendeligheden af ​​HPA til detektering metastatisk cancer er siden blevet vist for en række faste tumorer herunder mavetarmkanalen, for eksempel tyktarms-, mave- og øsofageale tumorer [8-11]. Glycoproteinerne anerkendt af HPA er blevet undersøgt i CRC afledt cellelinier og dette viste, at anvendeligheden af ​​HPA ligger i dens evne til samtidigt at binde til mange glycoproteiner involveret i en række pro-metastatiske funktioner, herunder cellemigration, anti-apoptose og cellesignalering [12]. HPA har vist sig at binde de samme glycoproteiner i brystkræft som dem detekteret i HT29-celler tankevækkende at HPA indregner ændringer i glycosylering, der er fælles på tværs solide tumorer. HPA genkender glycoproteiner er modificeret ved fastgørelse af

O

knyttet

N

-acetylgalactosamine (

O-

GalNAc) og

N

-acetylglucosamine (

O-

GlcNAc) [13]. Kræft associerede ændringer i

O

bundet glycosylering er blevet anerkendt i nogen tid, men der har været beskæftiget med at kortlægge de proteiner, som de ændrede glykaner er attached.In den aktuelle undersøgelse relativt få undersøgelser, lectin HPA blev anvendt at identificere

O

forbundne glycoproteiner af CRC væv, der var metastatisk til lymfeknuderne. Proteiner blev præ-beriget ved lectin-affinitetschromatografi og adskilt af to-dimensionel gelelektroforese (2-DE) efterfulgt af identifikation ved anvendelse af massespektrometri (MS). Verifikation af glycoproteiner identificerede blev udført ved immunhistokemi og Western blotting. Sammenhængen mellem HPA binding; muteret P53 i KRAS og CEA status af vævsprøverne blev evalueret med henblik på forståelse

O-

koblet glycosylering i forbindelse med andre markører for CRC. En validering studie med en yderligere samling af CRC prøver uafhængig af den oprindelige stikprøve kohorte viste, at ændringerne i

O

bundet glycosylering anerkendt af HPA forblive forbundet med dårlig prognose CRC.

Materialer og metoder

Kemi blev opnået fra Sigma-Aldrich, Poole, Dorset, UK, medmindre andet er angivet.

Patientprøver

proteomisk undersøgelse omfattede 27 patienter med primær CRC, er kendt for at være fri for levermetastaser, som alle gennemgik kirurgisk resektion på University Hospital, Martinique (S1 tabel). Undersøgelsen blev godkendt af den etiske komité for Medical School of Martinique og University Research etiske komité (UREC) fra University of Westminster. Alle patienter gav skriftligt informeret samtykke til deres prøver, der skal anvendes ved forskning. Prøverne blev snap-frosset efter kirurgi og tilsvarende prøver blev fikseret i formaldehyd og indlejret i paraffin til histopatologiske undersøgelser. For hver kræft vævsprøve, blev den normale væv opsamlet fra tumor frie områder i den nærliggende slimhinde i en radius af 4 cm af tumoren. Patienter blev kategoriseret i to grupper baseret på graden af ​​inddragelse af regionale lymfeknuder. Alle væv, der anvendes i forbindelse med undersøgelsen, blev undersøgt og verificeret for tilstedeværelse af tumorceller under anvendelse af hæmatoxylin og eosin-farvede objektglas. Valideringen arbejde blev udført ved hjælp af paraffin-blev indlejrede blokke af CRC væv indsamles på University College London Hospitals (før 2006) og anvendes i overensstemmelse med loven humant væv (2008).

Histochemistry

den immunohistokemi brugte peberrodsperoxidasekonjugeret (HRP) detektionssystem (EnVision kit plus Dual link-system-HRP-kompleks, Anti-Mouse /Rabbit-HRP, Dako, Carpinteria, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Kort beskrevet 4 um tykke snit fra formalin-fikserede paraffin-voks indlejret (FFPE) arkiveringsformål colonvæv (tumorer og normale modstykker) blev de-paraffinized i xylen og rehydreret gennem en serie af graduerede alkoholer (70% – 100%). Antigen genfinding blev udført under anvendelse af Target Retrieval Solution eller citratbuffer efter producentens anvisninger. Endogen peroxidaseaktivitet blev standset ved inkubation med Dual Endogen Enzyme blok (Dako, Carpinteria, CA, USA). Snit blev inkuberet med det respektive primære antistof: monoklonalt anti-p53 (klon DO1; Immunotech, fortynding 1:50) eller kanin polyklonalt antistof mod annexin 4 og 5 (fortynding 1:50; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA) . Anvendte betingelser for hvert antistof var som beskrevet af producenten. Farvning uden det primære antistof blev udført som en negativ kontrol. Envision system HRP, anti-muse- eller anti-kanin blev anvendt til påvisning af de primære antistoffer (Dako, Carpinteria, CA, USA) og væv farvning blev visualiseret med diaminobenzidin (DAB) chromogenopløsning (Dako, Carpinteria, CA, USA). Kerner blev modfarvet med hæmatoxylin i 5 minutter. Sektionerne blev dehydreret gennem en række graduerede alkoholer ryddet i xylen og monteret i di-n-butyl-phthalat i xylen (DPX) monteringsmedium. Histochemistry til påvisning HPA bindende udnyttet 10 ug /ml biotinyleret lectin i phosphatpufret saltvand (PBS) med 5% vægt /vol bovint serumalbumin (BSA) anvendes til objektglassene i 1 time, vasket i tre skift af PBS med 0,01% volumen /v Tween-20 og inkuberet med 5 ug /ml streptavidin-HRP i 30 minutter. Snittene blev vasket igen i hold PBS med 0,01% volumen /volumen Tween-20 og lectin binding blev afsløret ved inkubering med 1% vægt /volumen DAB og 0,3% v /v H

2O

2. Cellerne blev modfarvet og monteret som ovenfor.

Objektglas blev evalueret under et lysmikroskop og blev scoret af to uafhængige individer i en blindet måde. I tilfælde, hvor der var indledende uenighed blev en konsensus opnået efter drøftelse. P53 blev registreret som positiv, når tumoren cellekerner blev farvet, uanset procentdelen af ​​positive celler. Den samlede immunoreaktive score blev bestemt (for P53) ifølge fremgangsmåden tidligere anvendte [6]. IRS er den samlede værdi af intensiteten af ​​immunfarvning (0 (-) for ingen farvning; 1 (+) for svag farvning, 2 (++) for moderat farvning og 3 (+++) til stærk farvning) og procentdelen af positive tumorceller 5% = 0; 20% = 1; 20-50% = 2; 50-80% = 3 og 80% = 4. HPA og annexin 4 blev de samme kriterier anvendes. Først den procentdel af cancerceller Farvning blev vurderet og dette blev derefter tilsat til intensiteten score at give en endelig score på mellem 0 og 8. For at bestemme den optimale cut-off, blev resultaterne fra alle prøverne analyseret med hensyn til deres farvning score. Scoren som gav den største forskelsbehandling mellem patienter, som udviklede metastatisk sygdom og dem, der forblev sygdomsfri (5-års overlevelse data) blev anvendt som cut-off værdi.

DNA-ekstraktion

prøver af tumorvæv og normalt væv fra hver patient blev anvendt til DNA-ekstraktion. Sektioner af 1 mm

3 væv blev skåret og knust umiddelbart i 200 pi lysepuffer pH 7,5 indeholdende 10 mM Tris, 1 mM EDTA, 0,5% vol /vol SDS, 100 ug /ml proteinase K. phenolekstraktioner blev udført, og DNA’et blev udfældet med ethanol ved -20 ° C. Det resulterende bundfald blev tørret ved stuetemperatur og resuspenderet i sterilt Tris-EDTA (TE) buffer ved en koncentration på ca. 1 mg /ml. DNA-koncentrationen blev bestemt ved anvendelse af et GeneQuant Pro spektrofotometer (GE Healthcare, Bucks, UK). Prøverne blev opbevaret ved + 4 ° C indtil anvendelse.

DNA amplifikation

Amplifikationsreaktionen af ​​DNA’et ekstraheret fra normale og tumorvæv blev udført under anvendelse af 1 pi DNA-prøve i et samlet reaktionsvolumen af 50 pi indeholdende Promega Master Mix (Ref. M7502) og primere genereret af Dr. E. Jullian Cochin Hospital. Amplifikationsreaktionen blev udført i to trin med 12 pM hver primer. Den første PCR-reaktion (KRAS1) blev udført med følgende primere: KRN5 ‘(5′-TAAGGCCTGCTGAAAATGAC-3’) og KRN3 ‘(5′-TGAAAATGGTCAGAGAAACC-3’) med følgende amplifikationscyklus: 95 ° C i 10 min, 55 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min, derefter 43 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 minut, og en endelig forlængelse ved 95 ° C i 30 sek , 55 ° C i 30 sek, 72 ° C i 10 min. Observationen af ​​en svag bånd af lav intensitet eller af mangel på båndet, efter 1,5% vægt /volumen agarosegelelektroforese førte til en anden amplificeringsreaktion. Denne anden PCR-reaktion (KRAS2) blev udført under anvendelse af 2 til 10 pi af den første reaktion KRAS1 og de følgende primere: KRS5 ‘(5′-AACTTGTGGTAGTTGGAG 3’) og KRS3 ‘(5’ – GTTGGATCATATTCGTCC 3 ‘) med følgende amplifikationscyklus: 95 ° C i 12 min, 52 ° C i 1 min, 72 ° C i 1 min, derefter 43 cykler ved 95 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sek, 72 ° C i 1 min og en endelig cyklus ved 95 ° C i 30 sek, 52 ° C i 30 sek, 72 ° C i 10 min. PCR-produkterne fra tumorvævet blev sekventeret for og mutationer i kodonerne 12 og 13 i KRAS-genet blev identificeret (Millegen, Frankrig).

Prøvefremstilling til proteinanalyse

Forud for valget af prøver til proteom undersøgelser blev 7 um frosne snit skåret og tilstedeværelsen af ​​cancerceller blev bekræftet ved farvning med hæmatoxylin og eosin. Prøver indeholdende 60% cancerceller og hæmolyse fri blev udvalgt. Fire proteinsamlinger fremstillet: LN positiv (n = 6) CRC (LN +), der støder op sundt væv (AdLN +); LN negativ (n = 5) CRC (LN-) og tilsvarende raske væv (AdLN-). De kliniske patologiske træk af prøverne er vist i S1 tabel. Proteiner blev ekstraheret fra hver prøve ved at vaske 50 mg væv tre gange med afkølet PBS, homogenisering i lectin puffer: 0,05 M TBS, 1 mM CaCI

2, 1 mM MgCl

2, pH 7,6 under anvendelse af en håndholdt homogenisator i 5 min med intermitterende afkøling på is. Homogenatet blev centrifugeret ved 15.000 x

g

at indsamle supernatanten. Protein kvantificering blev udført under anvendelse qubit’en systemet (Qiagen, UK). Protein- udbytterne spændte fra 5% til 7% af den våde vægt af vævet. Hver af de puljer består 100 mg af hver af de cancer /normale protein præparater af de relevante prøver.

SDS-PAGE og Western blotting

Proteiner blev adskilt med en-DE natriumdodecylsulfatpolyacrylamidgel gelelektroforese (SDS-PAGE) under anvendelse af en 12% gel ved 120 V i 1,5 h [14] og farvet med kolloid Coomassie Blue G-250 [15]. Prøver adskilt ved SDS-PAGE blev overført til nitrocellulose ved anvendelse af en våd blotting-system i 1,5 timer ved 110 V i transfer-buffer: 25 mM Tris, 192 mM glycin, 20% volumen /volumen methanol, blokeret med 2% vægt /vol BSA i TBS -Tween 0,05% v /v natten over og inkuberet med 5 ug /ml biotinyleret HPA i 2 timer efterfulgt af 1 times inkubation med 2 ug /ml streptavidin-HRP og probet med DAB /H

2O

2. Til analyse af de CEA-niveauer et murint anti-CEA monoklonalt antistof (sc-55.547, Santa- Santa-Cruz, CA, USA) blev anvendt ved 5 pg /ml anti-CEA-antistof i 2 timer, inkuberet med 2 ug /ml peroxidase -konjugeret anti-muse IgG i 1 time og visualiseret som ovenfor. For at verificere indholdet af annexin 4 og 5 proteinprøver blev adskilt, og blottet som før og probet med murint monoklonalt anti-annexin 4/5 antistoffer (sc-46.693 /sc-74.438, Santa-Cruz, CA, USA) ved 5 ug /ml natten over efterfulgt af inkubering med gede-anti-muse-IgG (1 ug /ml) og udviklet med forøget kemiluminescens (ECL) substrat. Signalet blev indfanget på røntgenfilm ved anvendelse af en eksponeringstid på 1 min.

Berigelse af HPA bindende glycoproteiner

HPA affinitetskromatografi blev anvendt til at berige og oprense HPA bindende glycoproteiner fra vævsekstrakter . Dette tilladt kvalitative ændringer i glykosylering og kvantitative ændringer i protein niveauer skal vurderes. Derudover dette trin fjernes høje tæthed proteiner. En 5 ml HPA affinitetskromatografisøjle blev fremstillet ved kobling af 10 mg af HPA til en HiTrap NHS-aktiveret Sepharose-søjle (GE Healthcare, Bucks, UK) ifølge producentens instruktioner. 2 mg puljet proteinprøve blev fyldt på søjlen og elueret med 0,25 M GlcNAc frisk fremstillet i lectin buffer. Prøver blev dialyseret natten over mod TBS og frysetørres. Frysetørrede prøver blev rekonstitueret i 100 pi urea buffer: 7 M urinstof, 2 M thiourinstof, 2% v /v amfolytter 4-7 (GE Healthcare, Bucks, UK), 4% w /CHAPS og 1% w /v DTT. Protein kvantificering blev udført som før. Udbyttet af affinitetsoprenset protein varierede fra 1% til 2% af det totale protein pool.

To dimensional elektroforese (2-DE)

affinitetsoprenset glycoproteiner blev separeret ved 2-DE. 50 ug af hver puljet proteinprøve blev blandet med rehydrering buffer: 6 M urinstof, 2 M thiourinstof, 0,5% volumen /volumen CHAPS, 0,4% vol /vol DTT, 0,5% v /v amfolytter pH 4-7, hvilket gav et slutvolumen 120 pi. Blandingen blev fyldt på en 11 cm Immobiline pH gradueringslinjen, pH 4-7L (GE Healthcare, Bucks, UK) ifølge fremgangsmåden beskrevet af [16] metode. Isoelektrisk fokusering blev udført under anvendelse af et Multiphor II (GE Healthcare, Bucks, UK) 10.000 Vh (GE Healthcare, 2004). Efter fokusering blev IPG strimlen opbevaret ved -80 ° C indtil separation ved SDS-PAGE som beskrevet ovenfor. Tre gentagelser af hver af de affinitetsoprensede glycoprotein puljer blev separeret ved 2-DE og visualiseret ved farvning med kolloid Coomassie Blue G-250 [15]. Gel billeder blev taget med et GS-800 densitometer (BioRad, UK).

Analyse af 2-DE-separationer

De 2-DE-separationer blev analyseret for at identificere glycoproteiner stede i forskellige niveauer i CRC enheder af patienter med LN positiv sygdom. Scannede billedfiler blev analyseret under anvendelse af Progenesis PG240 SameSpots software (Nonlinear Dynamics, U.K.), er relativ proteinmængde i en given plet udledes af pixelstyrkeværdi og omdannes til en procentdel af den samlede intensitet af alle protein pletter på gelen. Glycoproteiner viser ændrede niveauer blev rangordnet efter p-værdien (en vej ANOVA) og fold-ændre værdier.

Matrix assisteret laser desorption ionisering massespektrometri (MS) analyse

Protein identifikation var udført af kommerciel aftale med Dr. Kevin Bailey, School of Biomedicinsk Institut, University of Nottingham. Proteinpletter blev udskåret fra 2-DE separeret geler; afsaltet hjælp fase C18ZipTips omvendt (Millipore, UK). 2 pi afsaltet peptid prøve blev plettet på et enkelt mål brønd på en rustfri stål matrix-assisteret laser desorption ionisering (MALDI) plade med 1 pi alpha cyano-4-hydroxycinnaminic syreholdige intern standard (adeno corticotrophic hormon, ACTH). Målet lodes lufttørre og analyseret under anvendelse i en MALDI-MS (MicroMass M @ LDI, Waters Corp) drift opløsning 10.000 fulde bredde ved halvt maksimum) i refleksion mode. Spektre blev erhvervet ved 5 Hz ved hjælp af en nitrogen laser (λ 337 nm) med 10 skud summeres pr spektre. Data, blev overtaget af tilfældigt prøveudtagning fra målet pladen og peptid-peak liste filer blev genereret både manuelt og automatisk. De baggrunde toppe fra trypsin og keratin blev udelukket, og peak lister blev indlæst i MASCOT PMF (https://www.matrixscience.com/) database søgemaskine med parametre som følger: peptid tolerance 0.2 Da; ændringer i løbet af fordøjelsesprocessen såsom oxideret methionin og CAM blev bogført og ubesvarede spaltninger var sat til 1.

Forudsigelse af post-translationelle modifikationer (PTM)

Bioinformatik analyse blev foretaget ved hjælp af NetNGlyc ; NetOGlyc; YinOYang; NetPhos værktøjer på https://www.cbs.dtu.dk/services at identificere potentielle N-koblede, O-GalNAc, O-GIcNAc og O-fosfat modifikation sites på HPA bindende proteiner identificeret ovenfor.

Statistisk analyse

Sammenligninger mellem de 2 grupper (lymfeknude positiv /negativ CRC) blev foretaget ved hjælp af Student uafhængige prøver t-test for løbende data og ANOVA for kategoriske variable. Pearson koefficient blev også anvendt til at bestemme, om niveauerne af HPA eller annexinbinding var forbundet med sygdomsfrit interval. Overlevelseskurver blev afbildet ifølge Kaplan-Meier-metoden og sammenlignet under anvendelse af log-rank test; til alle prøver gennemføres, P-værdier for 0,05 blev taget som statistisk signifikant. Alle statistiske analyser blev udført ved hjælp af SPSS-version 19 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA, IBM Company).

Resultater og Diskussion

proteomiske analyse af

O-

forbundne glycoproteiner i CRC

Puljede proteiner fra CRC væv blev fraktioneret ved hjælp HPA affinitetskromatografi, adskilt af en-dE og 2-dE og identificeret ved hjælp af MS, i et proteomisk tilgang med henblik på at karakterisere den

O

forbundne glycaner forhøjet i CRC metastatisk til lymfeknuderne (fig 1 og S1 fig). Syv glycoproteiner blev identificeret ved hjælp af denne fremgangsmåde (tabel 1), herunder de cellemembranproteiner Annexin 4, annexin 5 og calcium aktiverede chlorid kanalprotein 1 (CLCA1). Annexin 4 er tidligere blevet identificeret som en HPA bindende glycoprotein i colorektal cancercellelinie HT29 [12]. Ved siden af ​​de øgede niveauer af

O

bundet glycosylering, forhøjede niveauer af CEA blev også identificeret (S1 Fig) tyder på, at

N

bundet glycosylering også stige i metastaserende CRC kræft.

Proteiner puljet fra LN + ve CRC vævsprøver var affinitetsoprenset med HPA og separeret ved isoelektrisk fokusering på en pH 4-7 IPG strimler og derefter ved SDS-PAGE (12%) og fremkaldes med kolloidt Coomassie Blue. Indsat: annexin 4/5 som angivet i LN + ve sammenlignet med LN-ve CRC vævsprøve proteinsamlinger. Proteinerne identificeret i MALDI-MS-analyse er angivet.

tiltrædelse nummer protein, beskrivelse MASCOT score, sekvens dækning, nominel masse og forudsagt pI er angivet. Fold ændring er forholdet mellem den gennemsnitlige normaliserede volumen af ​​stedet adskilt af 2-DE fra LN + ve gruppen og LN-ve gruppe.

O

bundet glycosylering , p53 og

KRAS

mutation status

en histokemisk fremgangsmåde blev anvendt med HPA som en markør for

O

koblet glycosylering status. Størstedelen af ​​prøverne var reaktive med lectin (n = 24, af den samlede n = 27 tilfælde) og udviste intens cellemembran farvning med færre tilfælde viser granulær cytoplasmatisk farvning, måske repræsenterer bindingen af ​​lectinet til glycokonjugater i transit gennem Golgi apparat (figur 2). Den lysmikroskop giver ikke tilstrækkelig opløsning til at tillade tæt forhør af de intracellulære organeller i de væv, der er bundet HPA. Det er muligt, at nogle af de glycoproteiner der er identificeret i denne undersøgelse er derfor proteiner i transit gennem den sekretoriske bane, herunder Golgi-apparatet, men meget af HPA binding observeret ved anvendelse immunohistokemi blev cellemembranen associeret. Der var ingen sammenhæng mellem HPA farvning intensitet og patientens alder, køn, tumor lønklasse eller LN status, men dette kan afspejle de relativt få prøver i denne indledende analyse (data ikke vist). Den anti-p53 antistof var stærkt reaktivt i 13 af de 29 sager, og svagt reaktivt i yderligere 7 tilfælde (Fig 2) og

O

bundet glycosylering status korrelerede ikke med P53 farvning. Alle af p53 positive tilfælde (n = 15) bundet HPA samt nogle af P53 negative tilfælde (n = 8).

KRAS

mutation status blev vurderet ved hjælp af en PCR baseret tilgang og 8 af de 25 evaluerbare prøver udstillet muteret

KRAS

i enten codon 12 eller 13 (26% af tilfældene), dette forhold positivt med den rapporterede forekomst i CRC på mellem 30-40% [17]. Af 8 prøver med muteret

KRAS

, fire var sideløbende positive for HPA farvning og alle disse var P53 positive. Tilsammen disse resultater er tankevækkende, at

O

koblet glycosylering sker ændringer tidligt i ætiologien af ​​CRC

Venstre:. Lysmikroskopi billeder af kolorektale vævssnit (5 um) inkuberet med HPA (10 ug /ml) og streptavidin-HRP (5 ug /ml) eller inkuberet med anti-P53 antistof (1: 200) og biotinyleret heste kanin-anti-muse-IgG (1: 1000) som angivet. Den brune farve angiver peroxidase reaktion med DAB /H

2O

2, kernerne blev modfarvet med hæmatoxylin (blå). Forstørrelse X400. Til højre: Tabel viser resultater for HPA, P53 og

KRAS

analyse

Validering af resultaterne af den proteomisk analyse

Annexin 4 og annexin 5 niveauer blev undersøgt. bruge Western blotting, Fig 3. Efter normalisering til p-actin niveauer, en betydelig stigning i niveauet af annexin 4 (men ikke annexin 5) blev observeret i CRC vævsprøver, som havde spredt sig til lymfeknuderne på tidspunktet for diagnosen (student t-test, P = 0,05). Ligeledes blev Western blots probet med HPA og en stigning i HPA-bindende glycoproteiner blev observeret i prøver fra lymfeknudeceller positive patienter (data ikke vist). Dette er i overensstemmelse med resultaterne af andre undersøgelser, rapporterer en stigning i

O

bundet glycosylering i dårlig prognose metastatisk CRC kræft. For at bestemme om annexin 4 og HPA binding korreleret med dårlig prognose CRC en ekstra serie af 35 CRC prøver med patienten opfølgning data blev vurderet ved hjælp af immunhistokemi. Når procentdelen af ​​celler farvning (0-100%) og den samlede farvning score (skala 0-7) blev overvejet, var begge signifikant omvendt korreleret med patientens overlevelse, Fig 4. For eksempel, når den samlede farvning score for HPA blev taget som ≥5 median overlevelse var 13 måneder sammenlignet med 68 måneder for en afskåret ≤5 (Chi square test 9,065; P-værdi = 0,0026); for annexin 4: når en afskåret for den samlede farvning score på ≥5 blev taget den mediane overlevelse var 17 måneder; i modsætning en score på ≤5 var forbundet med en median overlevelse på 59,6 måneder (Chi square test 11,45; P-værdi = 0,0007). Når resultaterne for både annexin 4 og HPA blev kombineret disse forblev signifikant omvendt forbundet med overlevelse efter CRC, Fig 4. annexin 4: tage en afskæringsværdi på ≥60% af celler farvning, den mediane overlevelse var 11 måneder sammenlignet med 58 måneder til ≤60% celler farvning (Chi square test 7,466; P-værdi = 0,0063) ;. For HPA: ≥50% cellefarvning i en median overlevelse på 11,5 måneder; men når ≤50% cellefarvning blev taget median overlevelse var 60 måneder (Chi test 11,74; P-værdi = 0,0006), data ikke vist. Disse resultater illustrerer, at bindingen af ​​HPA og anti-annexin 4-antistoffer til vævssnit af CRC er indikatorer for dårlig prognose. Både

O

bundet glycosylering-målt ved HPA farvning-og niveauerne af annexin 4 er markører for dårlig prognose CRC. Kompleksiteten af ​​proteom gør tumor markør opdagelse arbejde udfordrende; ikke desto mindre er der et behov for identifikation af biomarkører og nye mål for behandling af CRC. Af de mange posttranslationelle modifikationer at forekomme på proteiner, glycosylering er den mest udbredte og forskelligartede [18] og afvigelser i proteinglycosylering rapporteret i cancer [19] giver potentiale for identifikation af cancer-specifikke ændringer. Carbohydratbindende proteiner, lectiner, er tidligere blevet beskrevet for up-front indfangning af cancerassocierede glycoproteiner [20, 21]. Der har været stor interesse for de glycoproteiner anerkendt af lektin HPA som inddragelse af HPA bindende epitoper i den metastatiske proces er fastslået ved hjælp af kræft cellelinjer afledt af humane tumorvæv [22]. Integrin α5 og α6 og annexin 2 og 4 er tidligere blevet identificeret som de vigtigste HPA bindende partnere i metastaserende CRC cellelinie HT29 [12]. I denne undersøgelse proteiner fra CRC vævsprøver blev præ-fraktioneret under anvendelse af HPA affinitetschromatografi hvorved lav tæthed proteiner der skal isoleres og identificeres. Forskelle i HPA bindende glycoproteiner i prøver, der havde spredt sig til lymfeknuderne på tidspunktet for diagnosen var tydelige, når de glycoproteiner var adskilt af en-DE og blottet til nitrocellulose-indikerer en samlet stigning i

O-

forbundet glykosylering; sandsynligvis være forbundet med Tn og sialyl-Tn-antigenet ekspression i cancer [23]. Da HPA blev anvendt til at probe Western blots af kræft proteinpræparater, varierede antallet af bånd og deres intensitet sammenlignet med når proteinerne havde været præ-fraktioneret ved lectinaffinitetskromatografi (S1 Fig). Dette kan afspejle subtile forskelle i binding, når HPA blev kovalent immobiliseret til en affinitetsmatrix sammenlignet med, når lectin var i fri opløsning. Identifikationen af ​​HPA bindende glycoproteiner af CRC var en betydelig Formålet med dette arbejde, disse blev sammenlignet med niveauerne af CEA fra de samme vævsprøver og bekræftet at være uafhængig af CEA niveauer (S1 Fig). Mens studiet af muciner var uden for rammerne af denne aktuelle arbejde, klart niveauerne af MUC1 og MUC2 og deres HPA bindende egenskaber er et spørgsmål om en vis interesse. Tilsvarende intracellulære lokalisering af HPA bindende proteiner er af interesse. Det er ikke teknisk muligt at fraktionere cellulære organeller, når frosset cancer vævsprøver anvendes som udgangsmateriale, og så vi ikke kunne afgøre, om glycoproteiner fra Golgi-apparatet blev oprenset ved anvendelse af affinitetskromatografi trin. Det primære mål var at identificere proteiner, der binder lectin HPA og som er ændret i metastatisk og ikke-metastaserende CRC. Som vævet-farvning ved anvendelse af HPA viste både intracellulære og intens membranfarvning, vi hypotese, at HPA-bindende glycoproteiner identificeret i denne undersøgelse forventes at være afledt af cellemembranen, cytosol og potentielt, fra Golgi-apparatet. Proteomisk analyse af affinitetsoprensede HPA bindende proteiner afslørede syv glycoproteiner herunder annexin 4 og 5 og CLCA1 der blev øget i forberedelserne af de metastatiske kræft væv. Annexin 4 er allerede blevet vist i en særskilt undersøgelse at blive anerkendt af HPA i CRC-cellelinje HT29 [12]. Alle tre af disse proteiner, er tidligere blevet beskrevet i relation til CRC men disse proteiner er ikke tidligere blevet identificeret gennem præ-berigelse via

O- Salg forbundet glycan moeities. Annexiner er en familie af calcium-regulerede phospholipid og carbohydratbindende proteiner med forskellige intra- og ekstracellulære roller i forskellige cellulære processer, herunder signalering, iontransport, celledeling og apoptose [24].