PLoS ONE: Sammenhæng mellem Serum Tryptase, mastceller Positive til Tryptase og mikrovaskulære Density i kolorektal Kræftpatienter: Mulig Biologisk-Clinical Significance

Abstrakt

Baggrund

Tryptase er en serin protease opbevares og frigives fra mastceller (MCS), der spiller en rolle i tumorangiogenese. I denne undersøgelse sigter vi for at evaluere serum tryptase niveauer i kolorektal cancer (CRC) patienter før (STLBS) og efter (STLAS) radikal kirurgisk resektion. Vi evaluerede også mast celletæthed positivt til tryptase (MCDPT) og mikrovaskulære densitet (MVD) i primær tumor væv.

Metoder

En serie af 61 patienter med stadie B og C CRC (ifølge den Astler og Coller iscenesættelse systemet) blev udvalgt. Serum blodprøver blev indsamlet fra patienter en dag før og en dag efter operationen. Tryptase niveauer blev målt ved anvendelse af UniCAP Tryptase Fluoroenzymeimmunoassay (Pharmacia, Uppsala, Sverige). Tumor snit blev immunfarvet med et primært anti-tryptase-antistof (klon AA1, Dako, Glostrup, Danmark) og et anti CD-34-antistof (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italien) ved hjælp af immunhistokemi og derefter evalueret af billedet analysemetoder.

Resultater

gennemsnit ± sD STLBS og STLAS var 5,63 ± 2,61 ug /l, og 3,39 ± 1,47 ug /l henholdsvis og en signifikant forskel mellem gennemsnitsniveauer blev fundet: p = 0,000 ved t-test. Middelværdi ± s.d. af MCDPT og MVD var 8,13 ± 3,28 og 29,16 ± 7,39 hhv. En stærk korrelation mellem STLBS og MVD (r = 0,83, p = 0,000); STLBS og MCDPT (r = 0,60, p = 0,003); og MCDPT og MVD (r = 0,73; p = 0,001) blev fundet

Konklusion

Resultater demonstrerede højere STLBS i CRC patienter, hvilket indikerer en involvering af MC tryptase i CRC angiogenese.. Data antydede også lavere STLAS, hvilket tyder på frigivelse af tryptase fra tumor-infiltrerende MCs. Serum tryptase niveauer kan derfor spille en rolle som en ny bio-markør til forudsigelse af respons på radikal kirurgi. I denne sammenhæng tryptaseinhibitorer såsom gabexate og Nafamostat mesilat kunne evalueres i adjuvans kliniske undersøgelser som en ny anti-angiogene tilgang

Henvisning:. Ammendola M, Sacco R, Sammarco G, Donato G, Montemurro S, Ruggieri E, et al. (2014) Sammenhæng mellem Serum Tryptase, mastceller Positive til Tryptase og mikrovaskulære Density i kolorektal Kræftpatienter: Mulig Biologisk-Klinisk signifikans. PLoS ONE 9 (6): e99512. doi: 10,1371 /journal.pone.0099512

Redaktør: Michael Muders, University Hospital Carl Gustav Carus Dresden, Tyskland

Modtaget: December 2, 2013; Accepteret: 15. maj 2014 Udgivet: 10 juni 2014

Copyright: © 2014 Ammendola et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Forfatterne har ingen støtte eller finansiering til at rapportere

konkurrerende interesser:.. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Angiogenese er en kompleks proces involveret i væksten, invasion, og metastase af adskillige humane og animalske tumorer [1] – [3]. Mastceller (MCS) gribe ind i denne proces frigiver klassiske pro-angiogene faktorer, såsom vaskulær endotelvækstfaktor (VEGF), thymidinphosphorylase (TP), fibroblastvækstfaktor-2 (FGF-2), interleukin-6 (IL- 6), samt ikke-klassiske pro-angiogene faktorer, såsom tryptase, gemt på deres sekretoriske granula [4] – [8]. Data fra eksperimentelle tumormodeller antyder, at MC’er akkumulere nær til tumorceller før begyndelsen af ​​angiogenese, og at de er nødvendige for den makroskopiske udvidelse og metastatisk spredning af primære tumorceller. Beviser for en specifik rolle MC’er er blevet rapporteret i animalske og menneskelige kræftformer, såsom MC tumorer, hoved og hals, mave, kolorektal, lunge- og kutane maligniteter, hvor MC tæthed er stærkt korreleret med omfanget af tumor angiogenese [9 ] – [19]

Tryptase er en neutral serinprotease med en molekylvægt på 134 kDa og et tetramert struktur bestående af ikke-kovalent bundne underenheder.. Der er identificeret fire forskellige former for tryptase i human MC’er hidtil: α-, β-, γ- og δ-tryptase [20]. Af disse α- og β-tryptase er de to bedste cirkulerende isoformer beskrevet. α-tryptase konstant frigivet fra MC’er i blodbanen. β-tryptase selektivt koncentreret i de sekretoriske granulat af MC’er og frigives først efter degranulering. Tilstedeværelsen af ​​en høj koncentration af β-tryptase i blodstrømmen er derfor et klart udtryk for MC-aktivering [21] – [23]. Eksperimentelle undersøgelser har vist, at frigivelsen af ​​tryptase fra MCs at være en potent angiogene stimulus, der er i stand til at fremkalde neo-vascolarization både i

vitro og in vivo

og er derfor involveret i udviklingen af ​​kræft.

i denne pilotundersøgelse, vi analyserede serum tryptase niveauer (STLs) i CRC patienter før (STLBS) og efter (STLAS) radikal kirurgisk resektion; MC densitet positivt tryptase (MCDPT); og mikrovaskulære densitet (MVD) i primær tumor væv med henblik på at korrelere hver til de andre og til at evaluere STLs som en mulig bio-markør til forudsigelse af respons på radikal kirurgi. I den forbindelse kan inhiberingen af ​​tryptase ved hjælp af gabexate og nafamostat evalueres i adjuvans-kliniske forsøg som ny anticancerterapi [24] – [26].

Materialer og metoder

Undersøgelse Befolkninger

En serie af 61 CRC patienter observeret ved Klinisk Kirurgi Unit af “Magna Graecia” University of Catanzaro blev udvalgt. Helical computertomografi af thorax, abdomen og bækken viste, at ingen patienter havde fjernmetastaser. blev anvendt forskellige kirurgiske metoder: venstre og højre åben hemicolectomy for tyktarmskræft; åben anterior resektion, total meso-rektal udskæring og åben abdomino-perineale resektion til rektal cancer [27] – [30]. Patienter med stadie B og C CRC henhold til Astler og Coller iscenesættelse systemet blev inkluderet. I den globale serie var der 61 adenocarcinomer; den histopatologiske sortering blev udført ifølge den AJCC 7

th Edition [31] – [32]. De klinisk-patologiske træk ved de patienter er opsummeret i tabel 1. Fuld etisk godkendelse og underskrevet samtykke fra individuelle patienter blev opnået at udføre undersøgelsen. Det fulde navn på etik institutionel komité Review Board, der er godkendt vores undersøgelse er:. Universitetshospital Ethics Committee “Mater Domini”, Germaneto, Catanzaro, Italien

Prøveforberedelse

Blodprøver blev indsamlet fra 7:00 til 09:00 efter faste natten over, en dag før og en dag efter kirurgisk resektion af tumoren. Prøverne blev straks dispenseret i reagensglas med serumseparatorrør uden additiver (Becton Dickinson Vacutainer Systems Hemogard, Plymouth, UK) og henstår i mindst 30 minutter ved stuetemperatur for at muliggøre en fuldstændig koagulation. Prøverne blev efterfølgende centrifugeret ved 1.500 x g i 15 minutter ved stuetemperatur, og supernatanten blev udvundet. Patient sera opnået blev opsamlet, opdelt i portioner og frosset ved -80 ° C indtil analysefasen.

Før igangsættelse af analytiske fase blev prøverne optøet til stuetemperatur og blandet grundigt ved hvirvelbehandling ved lav hastighed for at fjerne eventuelle rester af fibrin eller anden partikler potentielt kan påvirke reproducerbare resultater. Lipæmiske eller hæmolyserede prøver potentielt interfererende med analysen blev udelukket fra den analytiske vurdering.

Serum tryptase niveauer blev målt ved fluor-enzym-immunoassay (FEIA) for hver prøve, ved hjælp af Uni-CAP100 (Pharmacia Diagnostics AB, Uppsala , Sverige).

Immunhistokemi

til vurdering af MCPT og MVD en trelags biotin-avidin-peroxidase system blev udnyttet [33]. Kort fortalt blev 4 um tykke serielle sektioner af formalinfikseret og paraffinindlejret tumorprøve og tilstødende normal slimhinde skæres. Snit blev derefter microwaved ved 500 W i 10 minutter, hvorefter endogen peroxidise aktivitet blev blokeret med 3% hydrogenperoxid-opløsning. Tumor snit blev inkuberet med et anti-tryptase (klon AA1, Dako, Glostrup, Danmark) fortyndet 1:100 i 1 time ved stuetemperatur, og et anti-CD34-antistof (QB-END 10; Bio-Optica Milano, Italien) fortyndet 1 :50 i 1 time ved stuetemperatur som en pan-endotel markør hhv. Tilstødende normale slimhinde snit blev inkuberet med et anti-tryptase (klon AA1, Dako, Glostrup, Danmark) og derefter bearbejdet på ovennævnte måde. Tumor snit blev også inkuberet med et anti-VEGF (Clone VG-1) (Dako Glostrup, Danmark), fortyndet til 1:200 i 1 time ved stuetemperatur. Det bundne antistof blev visualiseret under anvendelse af et biotinyleret sekundært antistof, avidin-biotin peroxidise kompleks og hurtigt rødt. Nuklear kontrastfarvning udførtes med Gills hæmatoxylin no. 2 (Polysciences, Warrington, PA, USA). Det primære antistof blev udeladt i negative kontroller.

morfometrisk analyse

Et billedanalysesystem (Quantimet500 Leica, Wetzlar, Tyskland) blev anvendt [34]. I tumor sektioner blev fem mest immunofarvede områder (hot spots) valgt ved lav forstørrelse og individuel MCDPT (fig. 1A) og MVD (fig. 1B) blev talt ved X400 forstørrelse (0,19 mm

2-område). Detaljerne blev evalueret ved x1000 forstørrelse i olie (fig. 2A og 2B henholdsvis). I tilstødende normale mucosa sektioner fem mest immunofarvede områder (hot spots) blev udvalgt ved lav forstørrelse og individuel MCDPT (fig. 3A) blev talt ved X400 forstørrelse (0,19 mm

2-område). I tumorvæv VEGF-ekspression blev vurderet (Fig 3B).

I en et primært anti-tryptase antistof er blevet ansat. Pile viser røde mastceller positive for tryptase. I B et primært anti CD-34 antistof er blevet ansat. Pile angiver røde positive mikrokar.

I en et primært anti-tryptase antistof er blevet ansat. De store pile angiver enkelt rød mastceller positive for tryptase. Den lille pil viser den degranulering foran mastcelle danner en mikrokar. I B et primært anti CD-34 antistof er blevet ansat. Den store pil angiver en rød positiv mikrokar. Den lille pil viser kernen af ​​endotelcelle. Bemærk lumen mikrokardannelse.

I en et primært anti-tryptase antistof er blevet ansat. Pil viser en enkelt og unikke røde mastceller positive for tryptase i den observerede felt. I B et primært anti-VEGF antistof er blevet ansat. Mange røde immunofarvet kræftceller. Store pile angiver enkelt rød cytoplasmatiske kræftceller positive til VEGF.

Statistisk analyse

MCDPT og MVD middelværdier ± 1 standardafvigelser (SD) blev evalueret af to uafhængige observatører (GR og GD) for hver tumorprøve og i hver række af sektioner. MCDPT middelværdier ± 1 SD blev også evalueret for hvert tilstødende normal slimhinde. Korrelationer mellem STLs blev MCDPT, og MVD beregnet ved anvendelse Pearsons (R) analyse. Korrelationerne mellem de ovennævnte indekser og de klinisk-patologiske træk, der er anført i tabel 1 blev analyseret ved Chi-square test. Alle statistiske analyser blev udført med SPSS statistisk programpakke (SPSS, Inc., Chicago, IL).

Resultater

Den gennemsnitlige ± s.d. STLBS og STLAS var 5,63 ± 2,61 ug /L og 3,39 ± 1,47 ug /l henholdsvis og en signifikant forskel mellem gennemsnitsniveauer blev fundet: p = 0,000 ved t-test (tabel 2, fig. 4). I tumorvæv middelværdien ± s.d. af MCDPT og MVD var 8,13 ± 3,28 og 29,16 ± 7,39 (Tabel 2). (. R = 0,83, p = 0,000, figur 5) En signifikant sammenhæng mellem STLBS og MVD, STLBS og MCDPT (r = 0,60, p = 0,003, figur 6.), Og MCDPT og MVD (r = 0,73; p = 0,001 , fig. 7) blev fundet. I det tilstødende normale slimhinde middelværdien ± s.d. af MCDPT var 2,63 ± 1,17 (fig. 3A). En væsentlig forskel mellem tumorvæv MCDPT betyde og tilstødende normale slimhinde MCDPT middelværdi blev fundet (p = 0,000). VEGF-ekspression viste en stærk cytoplasmatisk immunfarvning i cancervæv (fig. 3B), men baseret på tidligere publicerede data, som viser en stærk ekspression af VEGF i CRC væv og blod fraktion fra patienter sammenlignet med tilstødende normal mucosa og raske kontroller henholdsvis data blev ikke vist [35] -. [38] Vejviser

Ingen andre signifikante korrelationer mellem de ovennævnte indekser og de vigtigste klinisk-patologiske træk, der er anført i tabel 1 blev fundet .

diskussion

i denne pilotundersøgelse vi har vist for første gang, at STLBS stærkt korrelerer med MCDPT og MVD i primær tumor væv. Vore data viser også, at STLs falde efter kirurgisk resektion i CRC patienter med en signifikant lavere værdi af STLAS. På grund af frigivelsen af ​​tryptase fra MC aktivering, foreslår vi, at MCDPT i primær CRC tumorvæv repræsenterer den vigtigste kilde til serum tryptase. I vores hypotese, hvis primære tumorvæv fjernes fuldstændigt STLs bør mindskes dag på grund af deres omtrent 4-h lang livscyklus. Af disse grunde har vi registreret STLs 24 timer før operation for at evaluere deres mulige rolle som en cirkulerende biomarkør antyder tilstedeværelsen af ​​tumorvæv, og igen 24 timer efter behandling for at bekræfte koncentrationsfaldet og, som følge heraf dens mulige konsekvenser af fraværet af tumorvæv. Vi uddybe baggrunden for vores hypotese baseret på tidligere offentliggjorte pilot data, som foreslog en stigning på MCDPT i primær tumor væv, og her vores resultater bekræftede også de indberettede data (figur 1A, 3A). I disse undersøgelser STLBS og MCDPT blev korreleret med MVD, hvilket tyder på deres rolle i CRC angiogenese. Vores data er enig med en tidligere offentliggjort undersøgelse, der viste en inddragelse af MC’er i forskellige maligniteter såsom blodkræftsygdomme, melanom, brystcancer, gastrointestinal og colo-rektal kræft, og også i dyretumormodeller [38] – [43]. de ovennævnte undersøgelser har imidlertid ikke fokusere på de ændringer i STLs før og efter operationen, og ingen sammenhæng mellem STLs blev MCDPT og MVD evalueret. Interessant er tryptase frigivet fra MC’er involveret i tumorangiogenese af flere mekanismer: for det første, tryptase stimulerer dannelsen af ​​vaskulære rør i

in vitro

in vivo

forsøgsmodeller; for det andet, tryptase er en agonist af proteinase-aktiveret receptor-2 i vaskulære endotelceller, som på sin side inducerer angiogenese [44]; for det tredje kan tryptase stimulere frigivelsen af ​​latente angiogene faktorer bundet til den ekstracellulære matrix [45] – [47]. Betragtet sammen, de ovennævnte data antyder, at tryptase kan være en potentiel surrogat bio-markør af tumorangiogenese, som er i stand til at forudsige respons på kirurgisk behandling.

Derfor, med den primære kilde til tryptase produktion ikke længere eksisterende, efter 24 ha bør forventes væsentlig reduktion i STLs. Hvis forhøjede STLs fortsætter efter operationen, ville dette tyder på, at resterende tumorvæv tilbage efter kirurgisk resektion eller alternativt at ukendte metastaser er til stede. I den forbindelse kan flere tryptasehæmmere såsom gabexate eller Nafamostat mesilat evalueres i fremtidige kliniske undersøgelser som en ny anti-tumor og anti-angiogene tilgang.

Tak

Forfatterne vil gerne tak Caroline Oakley for manuskript redigering.