PLoS ONE: ICAD Mangel i Human tyktarmskræft og Disposition til Colon tumorigenesis: Forbindelse til Apoptose Modstand og Genomisk ustabilitet

Abstrakt

Vi har tidligere vist, at DNA-fragmentering faktor, som omfatter en caspase-3-aktiveret DNase (CAD) og dens inhibitor (ICAD), kan have indflydelse på hastigheden af ​​celledød ved at generere PARP-1- aktiverende DNA-brud. Her testede vi den hypotese, at ICAD-deficiente kolonepitelceller udviser resistens over for død stimuli kan akkumulere yderligere genetiske modifikationer, hvilket fører til en tumorigen fænotype. Vi viser, at ICAD mangel kan være forbundet med kolon malignitet hos mennesker. Faktisk en undersøgelse af ICAD udtryk ved hjælp af immunhistokemi i en vifte af både tyktarmskræft og normale væv viste, at ICAD ekspressionsniveauerne alvorligt blev kompromitteret i de ondartede væv. Ved DNA-skader forårsaget af en lav dosis af bestråling, ICAD celler erhverve en tumorigen fænotype. Kolonepitelceller afledt fra ICAD-mus viste en signifikant modstand mod død som følge af kolon kræftfremkaldende dimethylhydrazin in vitro og hos mus. Sådan modstand var forbundet med et fald i PARP-1-aktivering. I en dyremodel af dimethylhydrazin-induceret colon tumorigenese, ICAD

– /- mus udviklede signifikant højere antal tumorer med markant større størrelser end vildtype modstykker. Interessant fænotypen af ​​ICAD

– /- mus var ikke forbundet med en betydelig stigning i præcancer kryptfoci antyder en mulig forbindelse til tumorprogression snarere end initiering. Vigtigere, blev ICAD mangel forbundet med svær genomisk instabilitet vurderet ved vifte komparativ genomisk hybridisering. En sådan genomisk instabilitet bestod mest fremtrædende af amplificeringer, men med betydelige udeladelser i forhold til de kolleger vildtype berører flere kræftrelaterede gener, herunder

RAF-1

,

GSN

,

LMO3

og

Fzd6

uafhængigt af

p53

. Alt i alt, vores resultater præsentere en levedygtig tilfældet for inddragelse af ICAD mangel i colon carcinogenese og vise, at apoptose og genomisk ustabilitet kan omfatte de midler, hvormed mangel kan bidrage til processen med at øge modtagelighed for kræftfremkaldende-induceret tumorigenese.

Henvisning: Errami Y, Brim H, Oumouna-Benachour K, Oumouna M, Naura AS, Kim H, et al. (2013) ICAD Mangel i Human tyktarmskræft og Disposition til Colon tumorigenesis: Forbindelse til Apoptose Modstand og Genomisk ustabilitet. PLoS ONE 8 (2): e57871. doi: 10,1371 /journal.pone.0057871

Redaktør: Vincenzo Coppola, Ohio State University Comprehensive Cancer Center, USA

Modtaget: August 10, 2012; Accepteret: 29 Januar 2013; Publiceret: 22 feb 2013

Copyright: © 2013 Errami et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet, delvist af tilskud RSG-116.608 fra American Cancer Society (https://www.cancer.org/) og tilskud HL072889 fra National Institutes of Health (https://www.nhlbi.nih.gov/) til AHB. Ingen yderligere eksterne midler modtaget for denne undersøgelse. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Forfatterne vil gerne fastslå, at HB og HA er PLoS ONE redaktionelle bestyrelsesmedlemmer. Dette ændrer ikke forfatternes tilslutning til alle PLoS ONE politikker om datadeling og materialer.

Introduktion

Colon carcinogenese er en flertrins proces, der kræver mange år at udvikle og er forbundet med flere nylig karakteriserede genetiske ændringer [1], [2], [3]. Forekomsten af ​​inaktiverende mutationer i begge alleler af

adenomatøs polypose coli

genet (

APC

) [2], et tumorsuppressorgen, anses for at være en af ​​de indledende begivenheder i colorektal carcinogenese . Mutation og deraf følgende dysregulering af

K-RAS

proto-onkogen er også menes at udgøre en tidlig medvirkende faktor til kolon carcinogenese [4]. Omsætningen af ​​epitelceller er relativt hurtig og genetiske ændringer, som gør disse celler resistente over for apoptose eller flere proliferative er kritiske initierende begivenheder i colon tumorigenesis [4]. Den efterfølgende ophobning af mutant epitelceller bidrager til dannelse af strukturer kendt som afvigende krypt foci (ACF) [5].

Opsplitning af DNA menes at være et vigtigt skridt i bortskaffelse af genomet af apoptotiske celler. Samtidig med spaltning af nuklear lamin er DNA først nedbrudt til store fragmenter på 50 til 300 kb, som derefter forarbejdes til internukleosomal gentagelser [6], [7]. DNA fragmentation factor (DFF) er blevet foreslået at bidrage til denne proces [8]. DFF er sammensat af to underenheder, en 40-kDa caspase-aktiveret DNase (CAD) eller DFF40 og dets 45-kDa inhibitor ICAD (DFF45) [8], [9], [10]. Endonukleasen aktiviteten af ​​dette enzym, som er uløseligt forbundet med CAD, induceres på spaltning af ICAD af caspase-3. ICAD fungerer både som en inhibitor af CAD aktivitet og som en chaperone for denne underenhed [10], [11], [12]. Faktisk er ICAD påkrævet for CAD udtryk og den overflod af endonuclease i ICAD

– /- celler er stærkt reduceret sammenlignet med i vildtype celler [8], [9], [10], [13]. Vi og andre [13], [14], [15], [16], [17] rapporterede, at en række celletyper, herunder immunceller, fibroblaster, og corticale neuroner afledt af ICAD

– /- mus, udvise resistens over for apoptose induceret af forskellige stimuli. Vi viste også betydningen af ​​DFF i fragmentering af DNA i 50-kb stykker under apoptose [13], [14], [15], [16], [17]. Frembringelsen af ​​disse DNA-strengbrud resulterer i den tidlige og forbigående aktivering af PARP-1. PARP-1-medieret poly (ADP-ribosyl) ation resulterer i et markant fald i de intracellulære koncentrationer af NAD og ATP, hvilket skaber en cellulær energimangel, som menes at bidrage til acceleration af dødsprocessen [13], [16], [18], [19]. Vi viste, at svigt af ICAD

– /- fibroblaster til at generere 50-kb DNA-fragmenter som reaktion på TNF-α beskyttet cellerne fra overdreven aktivering af PARP-1 og derved forhindret udtømning af intracellulær NAD [13], [16] . Forsinkelsen i PARP-1-aktivering observeret i disse celler korrelerede med forsinkelser både i caspase-3 aktivering og i pro-apoptotiske mitokondrie begivenheder, herunder tab af mitokondrielle membran potentiale og frigivelse af cytochrom c [13], [16]. Baseret på disse forskellige iagttagelser foreslog vi at dannelsen af ​​50-kb DNA-fragmenter ved DFF er ikke blot en passiv trin i DNA-nedbrydning, men snarere at den bidrager, sammen med PARP-1, mitokondrier, og caspase-3, til en forstærkning fase af apoptose [13], [16].

ICAD ekspression og mutationer i

ICAD

gen blev for nylig associeret med en række humane maligniteter samt med en dyremodel for hudkræft [20], [21]. Desuden Konishi et al. rapporterede, at ICAD mRNA-ekspression var lavere i esophageal pladecellecarcinom tumorer med højere patologisk grad sammen med lymfeknudemetastaser [20]. Omvendt blev ICAD proteinekspression rapporteret at være ofte opreguleret i æggestokkene serøse carcinomaer og kan tjene som en markør for aggressiv adfærd med prognostisk værdi [22]. I betragtning af betydningen af ​​apoptose i vedligeholdelse af colon væv og dets fejlregulering i colon carcinogenese, vi beregnet i nærværende undersøgelse at undersøge, om den potentielle sammenhæng mellem inddragelse af ICAD i apoptose og genomisk stabilitet kan være kritisk i forebyggelsen kolon tumorigenese. Desuden har vi forsøgt at bestemme, om svigt af colon epitelceller til at udtrykke ICAD gjorde dem modtagelige for akkumulere genetiske afvigelser i tillæg til en potentiel evne til at modstå induktion af apoptose, øger modtageligheden af ​​disse dyr til carcinogen (dimethylhydrazin; DMH) -induceret kolon tumorigenese. Til disse undersøgelser anvendte vi en integrativ tilgang kæmning et array af human coloncancer og normalt væv, en nyudviklet fremgangsmåde til isolering primær kolonepitelceller og et veletableret DMH-induceret musemodel for colon carcinogenese.

Materialer og metoder

Etik Statement

den aktuelle undersøgelse blev udført i nøje overensstemmelse med anbefalingerne i Vejledning for Pleje og anvendelse af forsøgsdyr af National Institutes of Health. Vedligeholdelse (IACUC protokol: BC0015) og forsøgsprotokol (IACUC protokol: 2227) blev godkendt af LSUHSC Animal Care og brug Udvalg. Den tyktarmskræft mid-density væv array (købt fra US Biomax Inc. Rockville, MD, USA) og de 23 humant prøvemateriale af tyktarmskræft og normale væv (LSUHSC patologi kerne) falder ind under IRB fritagelse typen 4.

Dyr og behandling

WT og ICAD

– /- mus, både fastholdt på en C57BL /6 × 129 /sv baggrund, blev avlet i en specifik patogen fri facilitet på LSUHSC, New Orleans, LA, og tillod ubegrænset adgang til steriliseret chow og vand

ad libitum

og blev opretholdt på en 12-timers lys-12-timers mørke tidsplan. Ved 5 ugers alder, mus (12 dyr per gruppe) modtog en

ip

injektion af 20 mg /kg DMH (Sigma, St. Louis, MO) i saltopløsning indeholdende 1 mM EDTA gang om ugen i otte uger . Dyrene blev derefter aflivet af CO

2 kvælning 12 eller 24 uger senere. For akutte eksponeringer, mus modtog en enkelt

i.p.

Injektion af 20 mg /kg af lægemidlet og ofret enten 24 eller 48 timer senere. Koloner blev fjernet og fikseret med formalin. Nogle mus blev anvendt til at isolere primære CØE som beskrevet nedenfor.

Isolering af primære kolonepitelceller, immunofluorescens, behandlinger, måling af cellelevedygtighed og klongenicitetsassayet

koloner blev åbnet på langs og vasket grundigt med calcium- og magnesium-fri HBSS suppleret med antibiotika. Vævssegmenter blev inkuberet i 90 minutter ved 37 ° C i komplet DMEM-medium indeholdende 20% FBS, 2% Luria-medium, glutamin, 10 mg dispase og 0,2% collagenase I (Worthington Biochemical Corporation, Lakewood NJ) under konstant forsigtig omrøring. Fordøjelsen blev vasket med HBSS ved centrifugering og derefter resuspenderet i komplet medium uden enzymer. Isolerede kolon krypter blev derefter udpladet og inkuberet ved 37 ° C i 5% CO

2 i 24 timer, hvorefter flydende krypter blev overført til en frisk plade i komplet medium. Effektiviteten af ​​celleisolering blev vurderet ved graden af ​​renhed af krypterne og det lave antal døde celler. Epitel karakter af cellerne blev vurderet ved immunofluorescens med antistoffer mod pan-cytokeratin (Santa Cruz Biotech, Santa Cruz, CA) som tidligere [23] beskrevne. For celledød assayet blev CØE fremstillet i 24-brønds plader og behandlet med en kombination af 2,5 ng /ml TNF-α, 5 ug /ml cyclohexamid, og 3 mM smørsyre (TNF + CHX + BA) eller med 1 mM DMH i 24 timer som beskrevet tidligere. Cellelevedygtighed blev analyseret, i firdobbelte prøver ved anvendelse af calcein-AM-farvning som beskrevet tidligere [23]. For klongenicitetsassayet, WT og ICAD

– /- musefibroblaster (beskrevet [13]) blev udsat for IR (2 Gy), hvorefter cellerne blev udsået i 35 mm skåle i 0,5% lavt-smeltepunkt agarose på en seng på 1% ædle agar i komplet DMEM-medium. Kolonier blev scoret med en automatiseret tæller, og resultaterne er udtrykt som fold-stigning i forhold til værdien for fingeret-bestrålede WT celler.

Histopatologi og Immunhistokemi (IHC).

Serial sektioner fra paraffin -embedded colonvæv blev fremstillet ved anvendelse af standardmetoder. Hver femte sektion blev underkastet H .. E-farvede serielle snit på grundlag af tilstedeværelsen af ​​atypiske kerner, størrelse, øget pericryptal område, og fortykket lag af epitelceller hjulpet af bistand fra en patolog (

K. Fallon

). ACF med 2 eller flere kirtler blev medtaget i vurderingen. Diameter af tumorer blev vurderet ved hjælp af et stereomikroskop.

Profilering af kromosomafvigelser ved aCGH.

Profilen af ​​kromosomafvigelser i colon væv (isoleret fra paraffinindlejrede væv) fra DMH-behandlede WT eller ICAD

– /- mus blev vurderet ved anvendelse af en oligo mikroarray-baserede CGH med en chip, der indeholder 105.000 muse genomiske prober (Agilent, Santa Clara, CA, www.agilent.com). De referenceværdier kontroller var DNA isoleret fra colon væv af alder-matchede naive WT eller ICAD

– /- mus. Reference- og test DNA blev fordøjet med

Alu

I og

RSA

I (Promega, Madison, WI), og renset med QIAprep Spin Miniprep kit (QIAGEN, Germantown, MD). Test-DNA (1 ug) og reference-DNA (1 ug) blev mærket ved vilkårlig priming med Cy5-dUTP og Cy3-dUTP, henholdsvis ved hjælp af Agilent Genomisk DNA Labeling Kit Plus. De individuelt mærket test- og referenceprøver blev koncentreret ved hjælp Microcon YM-30 filtre (Millipore, Billerica, MA) og derefter kombineret. Efter probe denaturering og præ-annealing med muse Cot-1-DNA, blev hybridisering udført ved 65 ° C med rotation i 40 timer ved 20 omdrejninger i minuttet. Fire trin blev udført med Agilent Oligo CGH vaske: vaskebuffer 1 ved stuetemperatur i 5 min, vaskebuffer 2 ved 37 ° C i 1 min, en acetonitril skylning ved stuetemperatur i 1 min og en 30 sek vask ved stuetemperatur i Agilents stabilisering og Tørring Solution. Alle objektglas blev scannet på en Agilent mikromatrice scanner. Data, herunder Copy Number Variations blev opnået ved Agilent Feature Extraction software 9 og analyseret med Agilent Genomisk Workbench software 5.0, ved hjælp af de statistiske algoritmer z score og ADM-2 i henhold til tærsklen henholdsvis 2,5 og 6,0 og en glidende gennemsnit vindue på 0,2 Mb.

Dataanalyse

Alle data er udtrykt som middelværdi ± SD af værdier fra mindst seks mus per gruppe eller fra 4 til 6 gentagelser af den samme behandling af de dyrkede celler. PRISM software (GraphPad, San Diego, CA) blev anvendt til at analysere forskellene mellem eksperimentelle grupper ved envejs ANOVA efterfulgt af Dunnetts multiple sammenligningstest. Analysen af ​​aCGH data blev beskrevet ovenfor.

Resultater

associering mellem ICAD mangel og kolon malignitet hos mennesker

Vi indledte vores undersøgelser ved at gennemføre en direkte undersøgelse af ICAD udtryk anvendelse af immunhistokemi i en vifte af både tyktarmskræft og normale væv. Ekspressionen af ​​ICAD syntes at være mere fremtrædende i epitelceller fra normal colon mucosa med en primær nuklear subcellulære lokalisering (fig. 1A). ICAD ekspressionsniveauer blev imidlertid kompromitteres i cancervæv (fig. 1a). Det er vigtigt at bemærke, at kronisk inflammation og de forventede stressreaktioner forbundet med en sådan inflammation syntes ikke at påvirke ekspressionsniveauerne eller subcellulær lokalisering af ICAD i tyktarmen (fig. 1B). Figur 1C tilvejebringer en kvantitativ vurdering af ICAD ekspressionsniveauer i vævsarray: mere end 40% af cancervæv blev anset for at være markant udtømt for ICAD. Det er underforstået, at styrken af ​​de data, der opnåede ved hjælp af væv arrays kan være begrænset i betragtning af, at de ikke kan omfatte normale tilstødende colon væv som interne kontroller. For at omgå denne begrænsning undersøgte vi ekspressionen af ​​ICAD i 23 humant prøvemateriale af tyktarmskræft i forbindelse med normalt væv indsamlet fra de samme patienter. Analyse af væv indikerede, at ICAD ekspressionsniveauer blev kompromitteret i cancervæv som vist i figur 1D (nedre panel) sammenlignet med den påvist i normale colonvæv af den samme patient; 17 ud 23 prøver viste et fald i niveauet af ICAD sammenlignet med niveauerne detekteret i tilstødende normale væv. De resterende prøver viste moderat til lille ændring i ICAD immunoreaktivitet. Alt i alt viser disse resultater etablere en potentiel forbindelse mellem ICAD mangel og colon malignitet. Imidlertid blev en mere detaljeret undersøgelse kræves for at forstå og fastslå forholdet mellem ICAD mangel og kolon malignitet, især dem, der vedrører undersøgelse af inddragelse af proteinet i cellen skæbne og genetiske ændringer, der fører til tumorigenese.

(A ) vævsarrays indeholdende sektioner fra normal colon (n = 60) eller cancer (n = 131) væv blev underkastet immunhistokemisk farvning med antistoffer mod human ICAD. (B) Ekspressionsniveauer af ICAD i kronisk betændt kolon. (C) Omfanget af ICAD immunoreaktivitet blev vurderet og klassificeret som høj (≥4 +), moderat /høj (3+), moderat /lav (2+), lav (1+) eller negativ (-); Resultaterne er udtrykt som procent positivitet af de samlede prøver (cancer eller normal). (D) Den normale og cancerøse væv blev fikseret i formalin, indlejret (både normale og sygdomsramte væv fra hver enkelt patient blev indlejret sammen), snittet, og derefter underkastet IHC med antistoffer mod humant ICAD. Sorte bokse i (A, B og D) angiver de forstørrede regioner.

Fremme af en tumorigen fænotype af ICAD mangel ved udsættelse for DNA-skader fremkaldt af lav-dosis ioniserende stråling (IR)

Vi har tidligere vist, at ICAD mangel reducerer følsomheden over for (TNF-α) -induceret celledød [13], [25]. For at bestemme hvorvidt apoptose-resistent fænotype af ICAD

– /- fibroblaster fremmet deres transformation efter induktion af DNA-skade, undersøgte vi evnen af ​​disse celler til at danne kolonier i blød agar. Vildtype (WT) og ICAD

– /- celler blev først udsat for en lav dosis (2 Gy) IR, hvorefter de blev suspenderet i agar med komplet medium og kolonier blev talt efter inkubation i 3 uger. Figur 2A viser, at ICAD mangel resulterede i en signifikant (~6.5 gange) forøgelse i cellers evne til at danne kolonier i blød agar efter eksponering for IR; Det er bemærkelsesværdigt, at kolonierne udviklet af vildtypeceller var små i antal og størrelse. Disse resultater antyder en kritisk rolle for ICAD i cellehomeostase og at ICAD mangel kan bidrage til en tumorigen fænotype ved DNA-skade

(A) ICAD

-. /- Og WT musefibroblaster blev enten udsat for IR (2 Gy) eller sham-bestrålede, hvorefter de blev dyrket i blød agar med komplet medium i 3 uger. Kolonier blev derefter talt med en automatisk tæller. Data er udtrykt som en procentdel af værdien for sham-bestrålede WT celler og er middelværdier ± SD af tredobbelte fra et repræsentativt eksperiment. *, Forskel fra sham-bestrålede WT-celler, p 0,05; #, Forskel fra WT celler udsat for IR (2 Gy), s 0,05. (B) CØE blev fremstillet fra WT mus og fik lov til at udbrede i 4 dage. Cellerne blev derefter fikseret og udsat for immunofluorescens med antistoffer mod pan-cytokeratin (rød) eller farvning med DAPI (blå); toppanelet er et eksempel på CØE visualiseret ved lysfeltmikroskopi. Gule pile angiver colon krypter. (C) CØE, isoleret fra WT eller ICAD

– /- mus blev behandlet med 2,5 ng /ml TNF i kombination med 5 pg /ml cyclohexamid og 3 mM smørsyre (betegnet TNF + CHX + BA) eller 1 mM DMH. Cellerne blev inkuberet i 48 timer i fravær eller nærvær af TNF + CHX + BA eller DMH, hvorefter, hvorefter cellelevedygtigheden blev vurderet ved måling af calcein-AM fluorescens. Data er udtrykt som en procentdel af levedygtigheden af ​​ubehandlede celler og er middelværdier ± standardafvigelse. af værdier fra fire brønde fra et repræsentativt eksperiment. *, Forskel fra respektive kontrol, p 0,05. #, Forskel fra de respektive behandlede celler, p 0,05. (D) Mus modtog en IP-injektion af 20 mg /kg DMH eller saltvand (kontrol). Mus blev aflivet efter 48 timer, og deres distale koloner blev fjernet og formalinfikseret. Vævssnit blev derefter fremstillet og underkastet H

s

0,01; #, Forskel fra WT mus udsat for DMH,

s

0,01. (E) Mus blev behandlet som i (D), bortset fra at de blev aflivet efter 24 timer. Distale koloner blev fjernet og formalinfikseret. Vævssnit blev derefter fremstillet og underkastet IHC med antistoffer til poly (ADP-ribose). Røde felter angiver den forstørrede områder; gule pile viser poly (ADP-ribose) -immunoreactive kerner. (F) En kvantificering af poly (ADP-ribose) -immunoreactive kerner af CØE i tyktarmsslimhinden af ​​de forskellige forsøgsgrupper.

associering mellem ICAD gendeletion og et fald i følsomhed kolonepitelceller til døden stimuli

i betragtning af den potentielle tumorigen effekt af ICAD mangel på DNA-skader, vi undersøgte denne mulighed i tyktarmen indstillingen

in vitro

in vivo

. At begynde at teste vores hypotese undersøgte vi effekten af ​​

ICAD

gen knockout af reaktionen hos primære kolonepitelceller (de central- og østeuropæiske) til inducere af celledød, for eksempel TNF-α, cycloheximid, og smørsyre ( TNF + CHX + BA) eller til tyktarmen kræftfremkaldende DMH. Vi har tidligere vist, at TNF + CHX + BA kombination er effektiv til at fremme celledrab i CØE [26]. Derudover adskillige rapporter fra os og andre viste, at cyclohexamid eller butyrat sensibiliserer et antal humane colon epitelial cellelinjer mod TNF-α-induceret celledød [26], [27], [28], [29], [30]. Vi har for nylig etableret en fremgangsmåde til isolering primær kolonepitelceller [26]. Figur 2B viser de typiske karakteristika for de epitelceller, der stammer fra en isoleret kolon krypt; epitel karakter af de isolerede celler blev bekræftet ved immunofluorescens med antistoffer mod cytokeratin. Behandling af central- og østeuropæiske lande med TNF + CHX + BA-induceret død, var moderat, men signifikant faldt med ICAD mangel (Fig. 2C). Interessant, ICAD mangel tillagt en bedre modstand mod celle drab i respons på DMH. Vi næste undersøgt, om ICAD mangel også tillagt modstand til DMH

in vivo

på en akut eksponering. Mus blev behandlet med en enkelt dosis (20 mg /kg) af DMH til 24 eller 48 timer. Figur 2D viser, at ICAD mangel reduceret antallet af pycnotic /apoptotiske celler i colon mucosa vurderet 48 timer efter DMH eksponering. I betragtning af vores tidligere rapporteret forbindelse mellem ICAD udtryk og PARP aktivering [13], [16], vi undersøgte, om modstand ICAD

– /- CØE til DMH-induceret død var forbundet med et fald i PARP aktivering. Figur 2E viser, at DMH behandling inducerede en robust aktivering af PARP som vist ved poly (ADP-ribose) immunoreaktivitet i kerner af CØE i tyktarmsslimhinden af ​​behandlede mus. Denne PARP-aktivering var stort set fraværende i colon epitelceller i slimhinden i DMH-behandlede ICAD

– /- mus. En kvantificering af disse resultater er afbildet i figur 2F. Disse resultater antyder, at DMH-induceret celledød er associeret med PARP-aktivering, og at ICAD ekspression er nødvendig for effektiv induktion af sådan celledød. Vigtigere, tyder disse resultater, at modstanden mod døden følger af ICAD mangel kan deltage i den overordnede proces for tumorigenese i tyktarmen.

Enhancement af følsomhed over for DMH-induceret colon tumorigenesis af ICAD-mangel potentielt post-ACF-dannelse

for yderligere at teste vores ovennævnte hypotese undersøgte vi effekten af ​​ICAD gendeletion i en model af kolon tumorigenese. WT og ICAD

– /- mus blev injiceret intraperitonealt én gang om ugen i 8 uger med 20 mg /kg DMH eller bærer (1 mM EDTA i saltopløsning). Mus blev derefter aflivet 12 eller 24 uger efter den sidste injektion. Figur 1A viser, at 25% af de DMH-behandlede WT mus udviklede tumorer, der udviser en moderat til markant modstand mod DMH-induceret tumorigenese, et træk, der er i overensstemmelse med den rapporterede modstand af C57BL /6 og 129 /Sv-stammer til colon tumorigenesis induceret af DMH eller dets biprodukt azoxymethan [31]. Men 58,3% af DMH-eksponerede ICAD

– /- mus udviklede tumorer, hvilket bekræfter tumorigent potentiale observeret

in vitro

. Den gennemsnitlige tumor pr mus i WT mus var -0,5, gennemsnittet af tumorer i ICAD

– /- mus var ~3.5 omkring 7 gange højere, hvilket tyder på, at ICAD mangel ikke kun øget modtagelighed af mus til DMH men også øgedes tumor mangfoldigheden. Tumorerne påvist i DMH-behandlede ICAD

– /- mus varierede i størrelse, men nåede størrelser så store som 1 cm, som vist i figur 3A-B. Hematoxylin og eosin-farvning afslørede typiske colontumorer med markant hyperplasi og dysplasi og udvikling af store ACF (fig. 3C). Disse tumorer viste høj PCNA positivitet indikerer høje spredning (Fig. 3D). Interessant, disse tumorer udviste store nekrotiske områder og vises betydelig inflammation som det fremgår af det store antal inflammatoriske celler i omegnen af ​​tumorer (fig. 3E), som korrelerede med høj MCP-1 immunreaktivitet, en større kemokin i inflammatorisk celle rekruttering, som samt ekspression af COX-2 (fig 3F.)

WT og ICAD

-. /- mus fik DMH-injektioner en gang om ugen i 8 uger. Mus blev aflivet 24 uger senere. (A) Diameter af tumorer blev vurderet i de forskellige forsøgsgrupper; n = 12. *, Forskel fra DMH-behandlede WT mus, p 0,01. (B) En grov undersøgelse af et stort tumor påvist i DMH-behandlede ICAD

– /- mus. (C) H Bemærk de store nekrotiske kerner (sorte pile) og vaskularisering (gule pile). (D) PCNA udtryk i colon tumorer fra DMH-behandlede ICAD

– /- mus som vurderet af IHC. (E) H det højre panel er et IgG kontrol.

Genetiske ændringer, der gør centraleuropæiske lande resistente over for apoptose eller flere proliferativ er kritiske initierende hændelser i tyktarmen tumorigenese [1]. Den efterfølgende akkumulering af disse modificerede epitelceller bidrager til ACF-dannelse. Disse forstadier til kræft kan eller ikke kan udvikle sig til tumorer, men anses generelt for at være en forudsætning for tumorudvikling [5]. Vi undersøgte derfor effekten af ​​ICAD mangel på ACF på et tidligere tidspunkt (12 uger efter den sidste DMH injektion) og forud for udvikling af store adenomer. Overraskende, selv om antallet af ACF i koloner DMH-behandlede ICAD

– /- mus trended højere end detekteret i WT modstykke, har forskellen ikke statistisk signifikans (fig. 4). Disse resultater antyder, ICAD mangel spillede en større rolle i tumorudvikling snarere end i initiering

WT og ICAD

-. /- Mus fik DMH-injektioner en gang om ugen i 8 uger. Mus blev aflivet 12 uger senere. ACF blev identificeret og talt i H n = 12. * Forskel fra DMH-behandlede WT mus, p 0,05. Højre panel repræsenterer et eksempel på en stor ACF i colon af et DMH-behandlede ICAD

– /-. Mus

Fremme af ved DMH eksponering hos mus og effekter genomisk ustabilitet ved ICAD mangel på tyktarmskræft gener

CAD-mangel blev for nylig i forbindelse med genomisk ustabilitet i hudkræft og i bestrålede cellelinjer [20], [21]. Hæmning af DNA-fragmentering af en caspase-3-resistent mutant af ICAD ført til øget kromosomafvigelser i en p53-uafhængig måde [32]. Vi næste ønskede at undersøge, om stigningen i tumor modtagelighed i DMH-behandlede ICAD

– /- mus var forbundet med en ændring i genomisk integritet i koloner DMH-behandlede ICAD

– /- mus. Til dette formål har vi udført matrix komparativ genomisk hybridisering (aCGH) analyser af tumor-holdige kolon væv af ICAD

– /- mus og sammenlignede dem med WT modstykker. Figur 5 viser, at behandling med DMH forårsagede mild genomisk ustabilitet i WT mus, som bestod primært af sletninger mest fremtrædende plads i kromosomer 2, 9, 11, 13, og 15. I skarp kontrast, ændringerne i colon væv af DMH-behandlede ICAD

– /- mus var omfattende og bestod hovedsagelig af amplifikationer. Figur 5B viser kvantitative vurderinger af de ændringer, der eksemplificerer bidrag ICAD til genomisk instabilitet. Det er bemærkelsesværdigt, at mens ICAD-mangel var forbundet med 170 amplifikation og 120 deletion foci blev ICAD færdighed forbundet med blokade af de fleste amplifikationer (20 foci) med en moderat effekt på deletioner (68 foci). Når stringens blev øget og en cutoff på en 3-gange ændring blev påført, antallet af modificerede sites markant nedsat men tendensen forblev den samme (fig. 5D), hvilket yderligere bekræfter involveringen af ​​ICAD i genomisk integritet.

Kromosomalt DNA isoleret fra de forskellige forsøgsgrupper blev vurderet for generelle kromosomforandringer anvendelse af en oligo microarray-baserede CGH med en chip, der indeholder 105.000 muse genomiske prober.