PLoS ONE: Monascuspiloin Forbedrer Radiation følsomhed for Human prostata cancer celler ved at stimulere endoplasmatisk reticulum Stress og Induktion Autophagy

Abstrakt

Prostatakræft er en meget almindelig kræft blandt mænd. Traditionelle behandlinger for prostatakræft har begrænset effekt; derfor skal nye terapeutiske strategier og /eller nye adjuvans-lægemidler undersøges. Rød gær ris (RYR) er en traditionel mad krydderi lavet i Asien ved gæring hvide ris med

Monascus purpureus

Gik gær. Akkumulerende beviser indikerer, at RYR har antitumoraktivitet. I denne undersøgelse blev PC-3-celler (humane prostatacancerceller) anvendes til at undersøge anti-cancer virkninger af ioniserende stråling (IR) kombineret med monascuspiloin (MP, et gult pigment isoleret fra

Monascus pilosus M93

– fermenteret ris) og til at bestemme de underliggende mekanismer for disse effekter

in vitro

in vivo

. Vi fandt, at IR kombineret med MP viste øget terapeutisk effekt sammenlignet med enten behandling alene i PC-3 celler. Derudover kombineret behandling forstærket DNA-skader og endoplasmatisk reticulum (ER) stress. Den kombinerede behandling inducerede primært autofagi i PC-3-celler, og celledød, der blev induceret af den kombinerede behandling var hovedsageligt et resultat af hæmning af Akt /mTOR signaleringsveje. I en

in vivo

undersøgelse kombinationsbehandlingen viste større anti-tumorvækst virkninger. Disse nye fund antyder, at den kombinerede behandling kunne være en potentiel terapeutisk strategi til prostatacancer

Henvisning:. Chiu H-W, Fang W-H, Chen Y-L, Wu M-D, Yuan G-F, Ho S-Y et al. (2012) Monascuspiloin Forbedrer Radiation følsomhed for Human prostata cancer celler ved at stimulere endoplasmatisk reticulum Stress og Induktion Autophagy. PLoS ONE 7 (7): e40462. doi: 10,1371 /journal.pone.0040462

Redaktør: Kevin Camphausen, NIH, USA

Modtaget: 17. april, 2012; Accepteret: 18. maj 2012; Udgivet 3. juli, 2012 |

Copyright: © 2012 Chiu et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af FødevareErhverv forskning og udvikling Institute og finansiel støtte (101-EF-17-A-01-04-0525) i Økonomiministeriet, National Science Council, Taiwan (NSC 100-2314-B- 006 -055), den Sinlau Christian Hospital, Tainan, Taiwan, Food and Drug Administration, Department, Executive Yuan (DOH101-FDA-41301) og Sigt efter Top University Project. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Red gær ris (RYR), også kendt som rød Koji eller “Hongqu”, omfatter primært ikke-klistrede ris, røde gær, og biprodukter af fermenteringen. RYR er en traditionel mad krydderi, der forbruges i hele Asien [1]. Det er produceret ved gæring maden svamp, en

Monascus

arter, med dampet ris og har været brugt i mere end 600 år at producere vin og andre gærede fødevarer. Flere arter af svampen

Monascus

har været meget udbredt i at gøre rødvin og røde sojabønner ost [2].

Monascus

-fermented produkter har mange funktionelle sekundære metabolitter, herunder Monacolin K, citrinin, ankaflavin, og monascin. I flere nylige undersøgelser har disse sekundære metabolitter vist anti-inflammatorisk, anti-oxidativ, og antitumoraktiviteter [3], [4]. Mange undersøgelser har også undersøgt den anti-cancer evne RYR, såsom i colon, bryst, lunge, og prostatacancer [3]. De klasser af polyketid strukturer, der skyldes gæringsprocessen kaldes monacolins, og de store Monacolin fundet i RYR er Monacolin K [5]. Viste imidlertid RYR en mere potent inhibering af cancercellevækst sammenlignet med Monacolin K [6], [7]. de andre polyketider i RYR, kan dog give en botanisk tilgang til cancerbehandling, der er værdig til yderligere undersøgelse.

Prostatakræft er verdens mest almindelige malignitet og den anden hyppigste årsag til kræftdødsfald [8]. Tidlige fase prostatacancer androgen-afhængige og kan behandles effektivt med androgen ablation terapi, stråling, og /eller kirurgi. Imidlertid prostatacancerceller videre til en androgen-uafhængig stat, hvor de kan udvikle sig og føre til metastase og død [9]. Fordi kemoterapi og strålebehandling er stort set ineffektive og metastatiske sygdomme ofte udvikle endnu efter operationen, der er begrænsede behandlingsmuligheder til rådighed for prostatakræft [10]. Derfor skal der udvikles nye metoder til behandling af prostatacancer. Akkumulere beviser har vist, at erhvervet resistens over for strålebehandling kan overvindes ved anvendelse af forbindelser med små molekyler, der er målrettet centrale proteiner involveret i strålingsmodstand [11]. Anticancer terapeutiske tilgange som ioniserende stråling (IR), kan aktivere cellulære apoptotiske maskiner i androgen-uafhængige prostatacancerceller [12]. Imidlertid kan erhverves strålingsmodstand udvikle sig i hormon-refraktær prostatacancer, der er associeret med apoptose resistens [13]. Tidligere undersøgelser har også vist, at defekter i apoptotiske maskineri er korreleret med modstand af kræftceller til aktuelle terapeutiske indgreb, herunder IR [14].

Autophagy er en vigtig kataboliske proces er ansvarlig for nedværdigende og genanvendelse langlivede proteiner, cellulære aggregater og beskadigede organeller. Foruden den veldokumenterede rolle autofagi i celleoverlevelse, har en funktion til autofagi i celledød længe været foreslået [15]. I de senere år har den rolle, autophagy som en alternativ celledød mekanisme været et emne for debat. Undersøgelser er i gang for at definere optimale strategier til at modulere autophagy til forebyggelse og terapi af kræft og udnytte autophagy som mål for anticancer lægemiddelforskning [16]. Aktivering af PI3 kinase /Akt pathway, en velkendt fremgangsmåde til inhibering af apoptose, hæmmer også autofagi [17]. Akt phosphorylerer mammalian target of rapamycin (mTOR), som er blevet rapporteret at inhibere induktionen af ​​autofagi [18]. Tidligere undersøgelser har vist, at det endoplasmatiske reticulum (ER) stressrespons, i kombination med autophagy, betegner en adaptiv mekanisme til støtte celleoverlevelse som svar på en lang række skadelige betingelser [19]. ER stress aktiverer et sæt signalveje, der er kollektivt betegnet den udfoldede Protein Response (UPR). Typisk UPR signalering fremmer celle overlevelse ved at forbedre balancen mellem proteinet belastning og folde kapacitet i ER [20]. Men hvis cellerne udsættes for længerevarende eller robust ER stress, dør cellerne ved apoptose [21]. Stigende beviser har vist, at ER stress er også en potent udløser af autofagi [22]. Således er en bedre forståelse af de signalveje, der styrer ER stress induceret autophagy og cellulære skæbne vil forhåbentlig åbner nye muligheder for kræftbehandling.

(A) Kemisk struktur af MP. (B) koncentrationsafhængig effekter af MP på levedygtigheden af ​​PC-3-celler. Celler blev behandlet med 5, 15, 25, 35 eller 45 uM MP i 48 timer. *,

s

0,05, MP versus kontrol. (C) cytotoksiske virkninger i celler behandlet med IR (4 Gy) og /eller MP (25 uM). #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, MP versus kombineret behandling. (D) De stråling dosis-respons overlevelseskurverne for PC-3 celler med eller uden MP. Data er præsenteret som gennemsnit ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg.

Monascuspiloin (MP), en gul pigment først isoleret af vores gruppe fra

Monascus pilosus M93

-fermented ris, er et strukturelt ligner den velkendte

Monascus

pigment monascin. Men mekanismerne bag effekterne af MP i kombination med IR på prostatacancer er stort set ukendte. I nærværende undersøgelse blev PC-3-celler (androgen-uafhængige menneskelige prostatakræft celler) anvendes til at undersøge anti-cancer effekter af IR kombineret med MP

in vitro

in vivo

. De typer af celledød induceret af IR når det kombineres med MP blev undersøgt. Vi undersøgte også de mulige mekanismer bag celledød induceret af IR og /eller MP i PC-3 celler.

Gy) og MP (25 uM). Halerne indikerer DNA-skade. (B) Virkningen af ​​MP eller IR alene eller i kombination i 48 timer i gennemsnit hale DNA. #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, MP versus kombineret behandling

Materialer og metoder

Cell kultur

Den menneskelige prostatakræft cellelinje. PC-3 (ATCC CRL-1435) blev opnået fra American Type Culture Collection (ATCC). Cellerne blev dyrket i RPMI 1640-medium (Gibco BRL, Grand Island, NY) suppleret med antibiotika indeholdende 100 U /ml penicillin, 100 ug /ml streptomycin (Gibco BRL, Grand Island, NY) og 10% føtalt bovint serum (HyClone, South Logan, UT, USA). Cellerne blev inkuberet i en fugtig atmosfære indeholdende 5% CO

2 ved 37 ° C. Eksponentielt voksende celler blev frigjort under anvendelse af 0,05% trypsin-EDTA (Gibco BRL, Grand Island, NY) i RPMI 1640 medium.

(A) Tidlig apoptose, detekteres ved anvendelse af et Annexin V apoptose afsløring kit, blev målt ved anvendelse flow cytometri. Celler blev behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 uM) i 48 timer. (B) Udvikling af Avos i PC-3 celler. Påvisning af grøn og rød fluorescens i AO-farvede celler under anvendelse af flowcytometri. (C) Kvantificering af AVOS med AO-farvede celler behandlet med IR (4 Gy) eller MP (25 uM) alene eller i kombination under anvendelse af flowcytometri. #,

s

0,05, IR versus kombineret behandling. *,

s

0,05, MP versus kombineret behandling. Data er præsenteret som middelværdi ± standardafvigelse for tre uafhængige forsøg. (D) EM mikrofotografier af PC-3 celler behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 uM) i 48 timer.

hvide pile

punkt at autophagic vakuoler og autolysosomes. (E) Western blotting for LC3-I, LC3-II, P62 /SQSTM1 og Atg5-12 i PC-3-celler. Cellerne blev behandlet med IR (4 Gy) og MP (25 uM) i 48 timer.

mikroorganismer og forberedelse af monascuspiloin (MP)

Monascus pilosus M93

blev opnået fra BCRC, FIRDI (Hsinchu, Taiwan) og vedligeholdes på kartoffeldextroseagar (PDA, Difco). Stammen blev udsået på PDA-plader og dyrket ved 25 ° C i 7 dage. Sporerne blev derefter vasket ud fra PDA pladen under anvendelse af sterilt vand, og koncentrationen af ​​den resulterende sporesuspension blev indstillet til 1 x 10

6 /ml. Efter sporer berigelse trin blev 1 ml sporesuspension inokuleret i 250 ml rystekolber indeholdende 50 ml RGY medium (3% risstivelse, 7% glycerol, 1,2% polypepton, 3% sojabønnepulver, 0,1% MgSO

4 og 0,2 % NaNO

3), og dyrket under omrystning (150 rpm) ved 25 ° C i 3 dage til opnåelse myceliet bouillon af M93. Til fremstilling af RYR, halvtreds 450 ml glasflasker, der hver indeholder 75 g ris og 75 ml deioniseret vand, blev steriliseret i 20 minutter ved 121 ° C. M93 mycelium bouillon (7,5 ml) og RGY medium (7,5 ml) blev tilsat til hver flaske. De bottltes blev derefter inkuberet ved 25 ° C i 21 dage (7,5 ml RGY medium blev tilsat til hver flaske på 10

th inkubationsdag), og indholdet blev derefter lyofiliseret for at fjerne vand. Den RYR (1 kg) blev ekstraheret under anvendelse 95% ethanol (3 I) ved 25 ° C i 24 timer, og ethanolen blev fjernet ved vakuum-tørring til opnåelse af det rå RYR ekstrakt. Mængden af ​​MP i de rå ekstrakter blev målt ved anvendelse af HPLC med en Purospher® stjerne RP-18-søjle (Merck). Den mobile fase bestod 60% acetonitril indeholdende 0,1% phosphat ved strømningshastighed på 1,0 ml /min. Den RYR (1 kg) blev derefter ekstraheret med 70% ethanol (3 I) ved 25 ° C. Efter filtrering blev ethanolekstrakt koncentreredes og tilsattes ethylacetat (EA) til opnåelse af en EA-opløselige fraktion. EA-opløselige fraktion var injektion i en silicagelkolonne (70-230, 230-400 mesh, Merck) og elueret under anvendelse af n-hexan /ethylacetat (02:01). Til opnåelse MP, blev den eluerede fraktion koncentreredes under reduceret tryk og oprenset ved præparativ tyndtlagskromatografi (silicagel 60 F-254, Merck) med

n

hexan /EtOAc (02:01).

Gy) og /eller MP (25 uM) i 48 timer.

Optiske drejninger blev målt ved hjælp af et Jasco P-1020 digital polarimeter. UV-spektre blev opnået i MeOH under anvendelse af et Jasco UV-240 spektrofotometer, og IR-spektre (KBr eller rent) blev opnået ved anvendelse af et Perkin-Elmer System 2000 FT-IR spektrometer. Den 1D (

1 H,

13C, DEPT) og 2D (COSY, NOESY, HSQC, HMBC) NMR-spektre ved hjælp CDC

3 og CD

3OD som opløsningsmidler, blev registreret ved hjælp af et Varian Unity Plus 400 (400 MHz for

1H NMR, 100 MHz for

13C NMR) og Varian INOVA-500 (500 MHz for

1H NMR, 125 MHz for

13C NMR) spektrometer. Kemiske skift blev refereret til de interne opløsningsmiddel signaler i CDC

3 (

1H, δ 7,26;

13C, δ 77,0), og TMS blev anvendt som intern standard. Lav opløsning ESI-MS-spektre blev opnået under anvendelse af en API 3000 (Applied Biosystems), og høj opløsning ESI-MS spektre blev obstained anvendelse af et Bruker Daltonics APEX II 30e spektrometer.

Gy) eller MP (1 mg /kg × 6) alene eller i kombination. (A) Kropsvægt i nøgne mus, målt en gang om ugen. (B) Tumorvolumen i nøgne mus, målt hver anden dag. Data er præsenteret som den relative tumorvolumen (middel ± standardfejl) normaliseret til det oprindelige volumen tumor målt på dag 0. (C) Direkte observationer af mus med tumorer. Følgende eksperimenter blev musene aflivet, og tumorerne blev fjernet. (D) Måling af tumor vægt i nøgne mus efter aflivning. (E) immunhistokemisk (IHC) og hematoxylin og eosin (H anti-GAPDH blev opnået fra Abcam (Cambridge, MA, USA); anti-LC3 og anti-Atg5-12 blev opnået fra Abgent (San Diego, CA, USA); anti-P62 blev opnået /SQSTM1 antistof fra MBL (Nagoya, Japan), og anti-mTOR og anti-p70S6K blev opnået fra Epitomics (Burlingame, CA, USA).

In vivo tumor vækst assays under anvendelse pc’en -3 tumor model i nøgne mus

Alle forsøg på mus blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i vores institut (vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr, National Cheng Kung University). Nedenstående brug dyr protokol er blevet revideret og godkendt af Institutional Animal Care og brug Udvalg (IACUC) (Godkendelse nr: 99.138). Seks til otte uger gamle mandlige nøgne mus (BALB /cAnN.Cg-Foxn1

nu /CrlNarl) blev erhvervet fra National Laboratory Animal Center (Taiwan). Dyrene blev anbragt med fem i hvert bur ved 24 ± 2 ° C og 50% ± 10% relativ fugtighed og udsættes for en 12-timers lys /12-timers mørke-cyklus. Dyrene blev akklimatiseret i 1 uge før starten af ​​eksperimenterne og fodret med en Purina chow kost og vand ad libitum. Tumorer blev induceret ved subkutan (s.c.) injektion af PC-3-celler (2 x 10

6 celler i 0,1 ml PBS) i den ene side af den højre flanke. Tumorer (visualiseret som små knuder på stederne for injektion) syntes -7 dage efter injektion, og dyrene blev tilfældigt fordelt i hver gruppe. Mus blev behandlet med: (1) vehikel (majsolie), (2) 1 mg /kg MP tre gange om ugen i to uger, (3) en enkelt dosis på 6 Gy IR, eller (4) en kombinationsbehandling, der omfatter 1 mg /kg MP tre gange om ugen i to uger indledes umiddelbart efter en enkelt dosis på 6 Gy IR. Mus kropsvægte blev målt en gang om ugen og blev anvendt som indikator for systemisk toksicitet af behandlingen. Tumorvækst blev målt hver anden dag, og tumorvolumenet blev beregnet efter den nedenfor viste [25] formel:

tumorvolumen (mm

3) = større diameter (mm) × lille diameter (mm )

2/2

data er udtrykt som den relative tumorvolumen i forhold til volumenet forbehandling målt på dag 0. tumorvolumen firedobling tid (TVQT, i dage) blev bestemt ved en best fit regression analyse. Den tumorvækstforsinkelse (TGD) defineres som forskellen mellem TVQT på de behandlede tumorer sammenlignet med ubehandlede kontroldyr tumorer. Den TVQT og TGD tid blev beregnet for hver enkelt mus, og derefter midlet blev genereret for hver gruppe. Tumorvækstinhibering blev beregnet som følger:. Inhibition (%) = (gennemsnitlig tumorvolumen af ​​ubehandlede kontrolmus – tumorvolumen af ​​behandlede mus) /middelværdi tumorvolumen af ​​ubehandlede kontrolmus x 100

immunhistokemisk (IHC) farvning analyse

Paraffin-vævssnit (4 pm) blev tørret, deparaffineret, og rehydreret. Efter mikroovn forbehandling i citratpuffer (pH 6,0; for antigen hentning) blev objektglassene nedsænket i 3% hydrogenperoxid i 20 minutter for at blokere aktiviteten af ​​endogen peroxidase. Efter intensiv vask med PBS blev objektglassene inkuberet natten over ved 4 ° C med anti-LC3 og anti-P62 /SQSTM1 (MBL, Japan) antistoffer. Snittene blev derefter inkuberet med et sekundært antistof i 1 time ved stuetemperatur, og objektglassene blev udviklet ved anvendelse af STARR TREK Universal HRP detektion kit (Biocare Medical, Concord, CA). Endelig blev objektglassene kontrastfarvet hjælp hæmatoxylin. Hvert objektglas blev scannet ved lav effekt (× 200).

Statistisk analyse

Data udtrykkes som middelværdi ± SD. Statistisk signifikans blev bestemt under anvendelse af Students t-test for sammenligning mellem de midler eller envejs variansanalyse med post-hoc Dunnetts test [26]. Forskelle blev anset for at være væsentlig, når p. 0,05

Resultater

cytotoksiske virkninger og overlevelseskurverne for MP og IR behandlet alene eller i kombination på PC-3 celler

cellernes levedygtighed blev observeret ved forskellige koncentrationer af MP (0 til 45 uM) i 48 timer (fig. 1b). MP alene reducerede levedygtigheden af ​​celler i en koncentrationsafhængig måde. Efter behandling med 25 pM MP i 48 timer, levedygtighed PC-3-celler blev reduceret til 60%. Figur 1C viser levedygtigheden af ​​MP og IR behandlet alene eller i kombination på PC-3-celler. Markant øget toksicitet blev fundet for den kombinerede behandling sammenlignet med MP og IR behandling alene i PC-3 celler. Desuden figur 1D viser stråling dosis-respons overlevelse kurver for PC-3 celler med eller uden MP behandling. Overlevelseskurverne dramatisk flyttet nedad. MP (15 eller 25 uM) øgede IR-induceret klonogenisk celledød i PC-3-celler. MP væsentligt reduceret overlevelse fraktion i en dosisafhængig måde sammenlignet med IR alene.

DNA beskadigelse bestemt ved comet assay og ekspression af ER stress-relaterede proteiner i PC-3-celler behandlet med MP og IR alene eller i kombination

IR spiller en central rolle i behandlingen af ​​kræft på grund af sin evne til direkte at inducere DNA-beskadigelse [27]. Kometen assay er et følsomt værktøj til vurdering af DNA-skader og reparation på celleniveau, kræver kun et lille antal celler [28]. I comet assay for PC-3-celler, blev en begrænset eller ingen hale fundet i de ubehandlede kontroller, mens halen voksede efter bestråling og kombineret behandling (fig. 2A). Halen længde voksede markant efter IR (4 Gy) i forhold til kontrolgruppen (Fig. 2B). Markant forbedret DNA-skader blev fundet for den kombinerede behandling sammenlignet med IR alene. Disse resultater antydede, at DNA beskadigelse var involveret i de anti-proliferative virkninger af kombineret behandling i PC-3-celler. Desuden viser de seneste resultater, at en af ​​de mekanismer, hvorved IR aktiverer ER stress og UPR er ved induktion af DNA-beskadigelse [29]. Derfor, for at detektere ekspressionen af ​​ER stressrelaterede proteiner, udførte vi western blotting med lysater fra PC-3-celler modtager hver af de forskellige behandlinger (fig. 2C). Vores resultater viste, at IRE1α og fosforylering af eIF2α steget med kombineret behandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene, hvilket bekræfter, at den kombinerede behandling induceret ER stress i PC-3 celler.

Måling af apoptose og autofagi i PC 3-celler behandlet med MP og IR alene eller i kombination

som vist i figur 3A, tidlig apoptose i PC-3-celler blev målt ved flowcytometri med Annexin V apoptose afsløring kit. Kvantitative resultater viste, at forekomsten af ​​tidlig apoptose i PC-3-celler behandlet med MP og /eller IR var lav. Således har vi yderligere analyseret, at type II programmeret celledød (autofagi). Det er karakteriseret ved dannelsen af ​​talrige sure vesikler, som kaldes sure vesikulære organeller (AVOS) [30]. Acridinorange (AO) farvning blev kvantificeret under anvendelse af flowcytometri (fig. 3B, 3C). En betydelig stigning i AO-positive celler blev fundet for celler der modtager kombineret behandling med sammenlignet med dem behandlet med IR eller MP alene. Desuden blev ultrastructures af PC-3 celler for hver behandlingsgruppe observeret af EM fotomikrografi (fig. 3D). Den kombinerede behandling resulterede også i et stort antal autophagic vakuoler og autolysosomes i cytoplasmaet. Desuden var der ingen chromatinkondensering eller nuklear pyknosis, der er karakteristiske for apoptose, forekom i nogen af ​​de behandlede celler. For at detektere ekspressionen af ​​autofagi-relaterede proteiner, udførte vi western blotting med lysater fra PC-3-celler modtager hver af de forskellige behandlinger (fig. 3e). Ekspressionsniveauerne af LC3-II, P62 og Atg5-12 proteiner steget med kombineret behandling, tyder på, at den kombinerede behandling induceret autophagy i PC-3 celler.

Den Akt /mTOR-signalvejen er involveret i den kombinerede behandling -induceret autophagy i PC-3-celler

Tidligere undersøgelser har vist, at Akt /mTOR pathway er involveret i regulering autofagi [31]. Derfor, for at undersøge, om Akt /mTOR signalvej var involveret i den kombinerede behandling-induceret autophagy, udførte vi western blotting for at detektere proteinphosphorylering tilstand (fig. 4). Phosphorylerede proteiner, der er involveret i Akt /mTOR signalveje blev også undersøgt. Phosphorylering af Akt, mTOR og p70S6K faldt i celler behandlet med den kombinerede behandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene.

tumorvækst i nøgne mus blev undertrykt af IR og MP

Vi næste evaluerede anti-tumorvækst effekt af IR og MP

in vivo

. Tumorer blev induceret ved s.c. injektion af PC-3-celler i nøgne mus. Vi målte kropsvægten af ​​musene på ugebasis og tumorvolumen hver anden dag. Resultaterne af denne undersøgelse viste, at ingen af ​​behandlingsregimer produceret ethvert tab af kropsvægt, hvilket kan være et tegn på toksicitet (fig. 5A). Den kombinerede behandling undertrykt tumorvolumen og tumorvægt i nøgne mus sammenlignet med MP eller IR-behandlinger alene (fig. 5B, 5C, 5D). Som vist i tabel 1 blev tumorvolumen firdobling tid (TVQT) for kontrolgruppen målt på dag 10 (10,3 ± 2,4). Den tumorvækst forsinkelse (TGD) tid for de 10 dages behandling af MP alene var 10,4 ± 4,2 dage, hvilket var væsentligt anderledes end for kontrolgruppen (

s

0,05). IR alene gav en TGD på cirka 17,8 ± 6,2 dage (

s

0,05 sammenlignet med kontrolgruppen). Den kombinerede behandling resulterede i en TGD tid på 52,3 ± 7,1 dage (

s

0,05 sammenlignet med kontrolgruppen eller MP alene). Kombinationsbehandlingen og IR MP resulterede i en tumorvækst inhibering af 71% på dag 10. Således den kombinerede behandling besidder anti-tumorvækst effekt

in vivo

.

Dernæst histologisk undersøgelse blev analyseret ved hematoxylin og eosin (H & E) farvning (fig 5E.). Tumoren af ​​kombineret behandling bestod af celler med lavere kerne-til-cytoplasma forhold end MP eller IR behandling alene. Desuden blev LC3 og P62 ekspressionsmønstre i PC-3 tumorer undersøgt ved hjælp af IHC farvning. LC3 og P62 blev forøget i tumorer fra mus behandlet med den kombinerede behandling sammenlignet med MP eller IR behandling alene.

Diskussion

For nylig blev det rapporteret, at RYR, en traditionel kinesisk mad urt og moderne kosttilskud, demonstreret

in vitro

virkninger, herunder hæmning af spredning og stimulering af apoptose i humane colon cancerceller [6]. Desuden RYR væsentligt reduceret tumorvolumener af prostata xenotransplantattumorer [32]. Kombinationen af ​​IR med andre midler, som opnår strålingssensibiliserende potentiale er blevet vigtige interventioner for patienter med prostatakræft [33]. Tidligere undersøgelser har også vist, at naturlige produkter som de hidtil ukendte radiosensibilisatorer til behandling af hormon-refraktær prostatacancer, er resistent over for strålebehandling [11], [34]. I den foreliggende undersøgelse, vi viste for første gang, at MP sensibiliserer human prostatacancer PC-3-celler IR både

in vitro

in vivo

i den nøgne mus xenograftmodellen (fig. 1, 5). For de fleste af historien om cancerbehandling, blev apoptose menes at være den eneste mekanisme af lægemiddel-induceret celledød. For nylig er det blevet rapporteret, at en type II programmeret celledød, autophagy, kan deltage i cancerterapi-induceret celledød. Nylige fund, herunder vores laboratorium, har antydet, at aktiveret autofagi er en tumor suppressor [23], [24], [35]. Her PC-3 celler behandlet med kombineret behandling induceret autophagy potentielt fandt sted, da apoptosecyklus af PC-3 celler blev blokeret (fig. 3). I

in vivo

undersøgelse af PC-3 xenotransplantattumorer, LC3 og P62 blev forøget efter den kombinerede behandling (fig. 5E).

Stråling spiller en central rolle i behandlingen på grund af dens evne til direkte inducerer DNA-ødelæggelse, især DNA dobbelt-strenget pauser, hvilket fører til celledød [27]. I vores nuværende undersøgelse blev signifikant forøget DNA beskadigelse fundet i den kombinerede gruppe behandling sammenlignet med IR eller MP alene (fig. 2A, 2B). Imidlertid er detaljer af mekanismen endnu ikke fuldt forstået. Det er muligt, at MP interfererer med behandling og reparation af IR-induceret DNA dobbelt-strengbrud. Alternativt MP kan forstyrre en post-reparation trin involverer den faktiske tilbageførsel af γH2AX, såsom defosforylering eller nedbrydning og /eller en histon udveksling af γH2AX [36]. De seneste tal viser, at en af ​​de mekanismer, hvorved IR aktiverer ER stress er induktionen af ​​DNA-skade [29]. Således kan dobbeltstrengede DNA-brud tjene som en forbindelse mellem IR og ER stress aktivering. Vores resultater viste, at IRE1α og phosphorylering af eIF2α steg med kombineret behandling, hvilket indikerer, at kombineret behandling inducerede ER stress i PC-3-celler (fig. 2C). ER-stress kan aktivere signalveje, der er involveret i apoptose og autofagi [22].