PLoS ONE: Målretning Thioredoxin reduktase 1 Reduktion i cancerceller Hæmmer selvforsynende vækst og DNA Replication

Abstrakt

Thioredoxin reduktase 1 (TR1) er en stor redox regulator i pattedyrceller. Som en vigtig antioxidant selenoprotein, er TR1 menes at deltage i forebyggelse af kræft, men er også kendt for at være overudtrykt i mange cancerceller. Talrige cancerlægemidler inhiberer TR1, og dette protein er blevet foreslået som et mål for cancerterapi. Vi har tidligere rapporteret, at reduktionen af ​​TR1 niveauer i cancerceller vendt mange maligne egenskaber tyder på, at mangel på TR1 funktionen er antitumorigenic. Den molekylære basis for TR1 rolle i udviklingen af ​​kræft er imidlertid ikke forstået. Heri, fandt vi, at blandt selenoproteiner, er TR1 entydigt overudtrykt i cancerceller og dens knockdown i en mus cancercellelinie drevet af onkogene

K-RAS

medført morfologiske ændringer karakteristiske for parentale (normale) celler, uden signifikant virkning på cellevækst under normale vækstbetingelser. Når der dyrkes i serum-deficient medium, TR1 deficiente cancerceller mister selvforsyning af vækst, manifestere en defekt progression i deres S-fase og en nedsat ekspression af DNA-polymerase α, et enzym vigtig i DNA-replikation. Disse observationer giver dokumentation for, at TR1 er kritisk for selvforsyning i vækst signaler af maligne celler, at TR1 fungerer stort set som en pro-cancer protein og det er faktisk et primært mål i kræftbehandling

Henvisning:. Yoo MH Xu XM, Carlson BA, Patterson AD, Gladyshev VN, Hatfield DL (2007) Målretning Thioredoxin reduktase 1 Reduktion i cancerceller Hæmmer selvforsynende vækst og DNA Replication. PLoS ONE 2 (10): E1112. doi: 10,1371 /journal.pone.0001112

Academic Redaktør: Mikhail Blagosklonny, Ordway Research Institute, USA

Modtaget: September 25, 2007; Accepteret: 12. oktober 2007; Udgivet 31. oktober, 2007

Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Public Domain erklæring hvori det hedder, at når det først er i det offentlige rum, dette arbejde kan frit gengives, distribueres, overføres, ændres, bygget på, eller på anden måde bruges af alle til ethvert lovligt formål

Finansiering:. Denne forskning blev støttet af Intramural Research Program for National Institutes of Health, National Cancer Institute, center for Cancer Research, og ved NIH tilskud CA080946 og GM065204 til VNG. ADP blev sponsoreret af PRAT Fellowship, NIGMS, NIH

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Dietary selen har potent forebyggelse af kræft aktivitet [1], og begge selenholdige proteiner (selenoproteiner) [2,3 og referencer deri] og lavmolekylære selenholdige forbindelser (selenocompounds) [2 og referencer deri] har været impliceret i denne aktivitet. Den store rolle af selen i at yde sundhedsmæssige fordele sandsynligvis gennem handling af selenoproteiner [1]. Thioredoxin reduktase 1 (TR1) er en af ​​24 kendte selenoproteiner i gnavere [4], er et stort antioxidant og redox regulator i pattedyrceller [5,6 og referencer deri] og har en væsentlig rolle i pattedyrs udvikling [7]. synes imidlertid dette enzym at have modsatrettede effekter i udvikling af kræft, som det er blevet impliceret i både forebyggelse af kræft [8] og cancer fremme [9] – [12]. For eksempel, TR1 understøtter p53 funktion og har andre tumor suppressor aktiviteter, og dens målretning af kræftfremkaldende, elektrofile forbindelser argumentere for sin rolle i forebyggelse af kræft [13]. Alternativt er TR1 overudtrykt i mange cancerceller [9] – [12] og dens inhibering med en række potente cancerlægemidler ændrede kræftrelaterede egenskaber af talrige tumorer og maligne celler antyder, at dette enzym er et mål for cancerterapi [9] -. [12], [14], [15]

Det er ikke klart, om TR1 kræft-forebyggelse eller cancer-fremmende egenskaber øve større indflydelse på kræft, om disse modsatrettede effekter fungerer samtidigt eller er specifikke for forskellige udviklingstrin kræft, og hvordan disse egenskaber kunne anvendes i forebyggelse og /eller terapi cancer. For at løse disse problemer, vi oprindeligt undersøgte rolle TR1 i en mus lungekræft cellelinje og en mus dyremodel og bemærkede, at reduktionen af ​​TR1 niveauer vendt mange maligne egenskaber herunder tumorigenecity [16]. Heri undersøgte vi TR1 funktion og roller i udviklingen af ​​kræft i en malign mus cellelinie til hvilken den tilsvarende forældrenes (normal) cellelinje var til rådighed, og yderligere verificeret resultaterne i flere humane kræftceller.

Resultater

Generation af de maligne og forældrenes cellelinjer og analyse af deres TR1 niveauer sammen med flere kræft menneskelige cellelinier

DT celler, som koder for onkogene

k-ras

[17] , [18], og de parentale NIH3T3 (kontrol) celler blev mærket med

75Se og de resulterende proteinekstrakter elektroforese for at undersøge niveauerne af TR1 og andre selenoproteiner (fig. 1A, øvre venstre panel). Den 55 kDa TR1 er en af ​​de store selenoproteiner, sammen med andre selenoproteiner, mærket i denne figur. Det er klart, DT celler har højere mængder af TR1 end kontrol celler. TR1 niveauer blev også undersøgt i kontrol og DT celler ved western blotting (fig. 1A, nederste venstre panel), som bekræftede øget niveauer af TR1 i DT celler. Interessant, forhøjet TR1 udtryk var på bekostning af andre selenoproteiner, som var på lavere niveauer i DT celler sammenlignet med kontrol celler.

angivne cellelinjer blev metabolisk mærket med

75Se, de resulterende protein celleekstrakter elektroforeseret og gelerne udsættes for en Phosphorlmager (se fremgangsmåder). Selenoproteiner identificeret tidligere i celleekstrakter [25], [26] er angivet med en pil og navn til højre for hvert panel. TR1 blev også identificeret ved western blotting i proteinekstrakter af hver cellelinje, som vist i de nedre paneler. (A, venstre panel) Kontrol (forældrekontrol, NIH3T3) og DT celler. (A, højre panel) NIH3T3 (kontrol, parentale celler, der anvendes ved generering DT-celler), LLC1 (muse Lewis lunge cellecarcinom), ACHN (human nyre renalcellecarcinom), A549 (human lunge ikke-småcellet carcinom), HCT116 ( human colon celle adenocarcinom) og SNB19 (human celle glioblastoma). NIH3T3 blev anvendt som indikator cellelinie til sammenligning af TR1 niveauer i en normal cellelinje til de maligne cellelinier. (B) DT /pU6-m3 og DT /siTR1. DT (opnået ved overekspression af mutant

K-RAS

i NIH3T3) celler blev stabilt transficeret med pU6-m3 (kontrol) vektor eller siTR1 knockdown vektor, henholdsvis (se fremgangsmåder).

Desuden blev muse Lewis lungecarcinoma (LLC1) celler [16] sammen med fire humane cellelinier, sammen med, mærket med

75Se og selenoprotein ekspression analyseret (fig. 1A, højre øvre panel). Selvom ingen tilsvarende kontrolceller var tilgængelige for disse maligne cellelinjer, vi sammenlignede deres selenoprotein mærkning mønstre til dem i normale NIH3T3-celler. Den eneste mærkede selenoprotein der syntes at være overudtrykt i hver af de kræftceller linjer var TR1. Western blot-analyse viste også høje niveauer af TR1 i de humane og muse maligne cellelinjer (fig. 1A, nederst til højre panel).

Stabil transfektion af DT og kontrol celler med et siRNA-TR1 knockdown vektor og deres karakterisering

DT-celler blev stabilt transficeret med siRNA-TR1 knockdown (betegnet DT /siRNA) eller kontrol-vektor (betegnet DT /pU6-m3) (fig. 1B, øvre panel). TR1 var stort set fraværende i DT /siRNA transficerede celler som påvist ved metabolisk

75Se mærkning og western blotting (fig. 1B, nederste panel).

fænotyper af de to transfekterede DT cellelinjer blev undersøgt og sammenlignet til dem af utransficerede DT og kontrolceller (fig. 2). Kontrolceller voksede i monolag og stramt fastgjort til dyrkningsskålen, som er kendetegnende for normale celler, mens DT /pU6-m3 og DT-celler voksede i flerlags og løst fastgjort til dyrkningsskålen, som er kendetegnende for maligne celler (Fig. 2A). Imidlertid DT /siRNA-celler havde en signifikant formindsket evne til at vokse i flerlags og blev mere tæt knyttet til dyrkningsskålen end både DT /pU6-m3 eller DT-celler.

(A) Kontrol (NIH3T3, parental) DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler. Celler blev dyrket på dyrkningsplader og fotograferet under eksponentiel vækst (se metoder). (B) Anchorage-uafhængig vækst af kontrol, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 Knockdown celler. Et tusinde celler blev suspenderet i blød agar og dyrket i to uger. Plader blev derefter farvet med INT natten over og fotograferet. Detaljer fremgår Methods. (C) Vækstrater af kontrol, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler under normale og serum-mangelfuld betingelser. Kontrol, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler blev podet (2 × 10

5 celler /60mm skål) og dyrket under normale vækstbetingelser (venstre panel) og DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler podet (5 x 10

5 celler /60 mm skål) og dyrket i serum-deficient medium (højre panel). Vækstraterne i serum-mangelfuld medium blev sammenlignet med dem, der opnås under normale vækstbetingelser.

Da mange kræftceller kan vokse uforankret i blød agar, men de fleste normale celler ikke kan, evne til kontrol, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler til at vokse i blød agar blev undersøgt (fig. 2B). DT og DT /pU6-m3 celler voksede i blød agar, mens kontrol- og DT /siTR1 celler voksede dårligt under disse betingelser. Vækstegenskaber i blød agar af to humane cellelinier, A549 og HCT116, efter transfektion med den tilsvarende humane TR1 knockdown vektor og kontrol vektor mangler siTR1 blev også undersøgt (se fig. S1 og figur legende). Interessant, begge cellelinier koder siTR1 mistet deres evne til at vokse i blød agar.

Selvforsyning i vækstsignaler

Selvforsyning i vækstsignaler er blevet foreslået som en af ​​seks erhvervede evner kræft fænotyper og Ras-Raf-MAPK signalering kaskade er kendt for at være involveret i dette erhvervede evne ved at efterligne vækstsignaler [19]. Vi undersøgte virkningen af ​​TR1 reduktion på denne fænotype ved dyrkning kontrol, DT /pU6-m3 og TR1 Knockdown celler i regelmæssig og serum-deficiente medier (Fig. 2C). Under normale vækstbetingelser, både DT og DT /siTR1 celler voksede mere end det dobbelte af NIH3T3 celler, mens DT /siTR1 celler voksede kun omkring 10% mindre effektivt end DT /pU6-m3 celler (venstre panel, Fig. 2C). Således har TR1 knockdown ikke nedsætte væksten af ​​DT-celler, uden påvirkning forbundet med TR1 væsentlighed for cellevækst. Som mange maligne celler vokser mere effektivt end normale celler ved dyrkning i serum-deficient medium undersøgte vi evner to transficerede cellelinier til at vokse i serum-deficiente betingelser (højre panel). DT /siTR1 celler voksede på omkring halvdelen af ​​satsen som DT /pU6-m3 celler, hvilket yderligere antyder, at kræft-associerede egenskaber af celler specifikt var påvirket af TR1 knockdown.

Cell cyklus analsis

Cell cyklus analyse af kontrol, DT /siTR1 og DT /pU6-m3 celler, når der dyrkes i serum-mangel medium, blev udført for at belyse den påvirket af reduktionen i TR1 udtryk resulterer i væksthæmning (fig. 3) fase. De tre cellelinier blev dyrket i komplet medium natten over og derefter anbragt i serum-deficient medium i 0, 24 og 48 timer. Celler blev inkuberet med 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) og farvet med BrdU antistoffer til at vurdere DNA-replikation og blev inkuberet med 7-amino-actinomycin (7-AAD) at vurdere genomisk DNA. Disse celler blev derefter analyseret ved FACS (Fig. 3A) og de relevante områder kvantificeret (fig. 3B). De tre cellelinier havde et stort antal celler i både G0-G1 og S faser, når analyseret umiddelbart efter aktiv vækst i komplet medium, selvom DT /siTR1 havde flere celler i S-fasen, mens de andre to cellelinjer havde flere celler i G0-G1-fasen (se Tid 0 i fig. 3A og B). Styringen cellelinie havde ca. 90% af dens celler tilbageholdes i G0-G1-fasen hele vækst i serum-deficient medium. Denne observation indikerer helt sikkert, at de fleste af kontrolcellerne tilbageholdes i hvilende (G0) tilstand, som er i overensstemmelse med deres manglende evne til at vokse under disse vækstbetingelser. En væsentlig forskel fandt sted i mængden af ​​celler i DT /pU6-m3 og DT /siTR1 cellelinjer på 24 timers vækst i G0-G1 og S-faser i at DT /pU6-m3 celler havde en langt højere procentdel af sine celler i S-fasen og lavere procentdel i G0-G1-fasen end gjorde DT /siTR1. Inden for S-fasen, DT /pU6-m3 havde omkring 1,5 gange flere celler i tidligt end sent S, mens DT /siTR1 havde omkring 3 gange flere celler i tidligt end sent S. Selvom mængden af ​​celler i både transficerede cellelinier i G0-G1 og S faser tættere tilnærmes hinanden efter 48 timers vækst, den store divergens var stadig til stede mellem de tidlige og sene S faser i disse to cellelinjer. Disse resultater tyder på, at DNA-replikation blev anholdt i den tidlige S-fase i DT /siTR1 celler. Det skal også bemærkes, at DT /siTR1 celler har højere mængder af deres cellepopulation tilbageholdt i G2-M-fasen end enten kontrol- eller DT /pU6-m3 celler under vækst analyse antyder, at flere celler i DT /siTR1 befolkning har problemer overgang til mitose. Den mulige defekt forårsager større forsinkelse af DTsiTR1 celler i tegningsoptionerne G2-M-fase yderligere undersøgelser, men blev ikke forfulgt i denne undersøgelse, da det ikke ser ud til at påvirke den samlede reduktion i DT /siTR1 vækstrate sammenlignet med DT /pU6-m3 i serum-deficient medium (se fig. 2C).

Kontrol, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler blev dyrket i serum-deficient medium i 0, 24 og 48 timer og inkuberet med BrdU for 6 timer. Høstede celler blev farvet med anti-BrdU-antistof til at overvåge nyligt replikeret genomisk DNA og 7-AAD at overvåge hele genomisk DNA. (A) farvede celler blev analyseret ved flowcytometri og (B) kvantificeret i hver fase af vækst cyklussen ved FlowJO. Faser af vækst cyklus blev G0-G1, S-fase (Tidlig S og sen S) og G2-M er vist og værdierne repræsenterer den procent af den totale cellepopulation. Nærmere oplysninger om de forsøg, der er vist i figuren er givet i Metoder.

Analyse af DNA-polymerase faktorer

For at belyse hvilken komponent (er) kan være involveret i DNA-replikation forårsager en reduktion i samlet vækst i serum-mangel medium i DT /siTR1 celler sammenlignet med DT /pU6-m3 celler, undersøgte vi niveauet af DNA Pol α, β, γ og ε, Cdc45 og PCNA som alle spiller en rolle i denne proces [20 ]. Western analyser af disse komponenter blev udført med de tre cellelinier ved hvert tidspunkt (fig. 4). DNA Pol α og Cdc45 blev stærkt beriget i begge transficerede cellelinjer sammenlignet med kontrolceller ved hvert af tidspunkterne. Interessant, DNA Pol α syntes at være reduceret i DT /siTR1 celler i forhold til DT /pU6-m3 celler på 24 timer og mest markant på 48 timer. Desuden niveauerne af DNA Pol ε syntes at blive reduceret i kontrol og DT /siTR1 celler sammenlignet med DT /pU6-m3 celler på 48 timer, mens DNA Pol β syntes at være reduceret på alle tre tidspunkter i DT /siTR1 sammenlignet til enten kontrol eller DT /pU6-m3 celler. Det ser ud til, at den mest udtalte effekt af TR1 reduktion i DT /siTR1 celler er på DNA Pol α resulterer i reduceret væksten af ​​disse celler i serum-mangelfuld medium. Dog kan TR1 reduktion også resultere i at reducere niveauerne af DNA Pol β, hvorimod de reducerede niveauer af DNA Pol ε på 48 timer i kontrol og DT /siTR1 celler kan skyldes serum-mangelfuld vækstmedium.

ekspressionsniveauer af DNA-polymerase komponenter, DNA Pol α, β, δ og ε, Cdc45 og PCNA, i kontrol, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler blev analyseret ved western blotting. Celler blev dyrket i serum-deficient medium i 0, 24 og 48 timer, høstet, protein celleekstrakter fremstillet og elektroforesebehandlet som beskrevet i Methods.

Discussion

TR1 har mange cellulære funktioner og er bredt involveret i cellulære processer, som reguleres af redox [9] – [12]. For eksempel, TR1 har roller i celleproliferation, angiogenese, transskription, DNA-reparation og tjener i antioxidant forsvar og redox regulering af cellesignalering (se anmeldelser [9] – [12]). Dens største funktion menes at opretholde cytosolisk thioredoxin (TRX1) i den reducerede tilstand vha NADPH som en elektrondonor [21]. Til gengæld TRX1 donerer reducerende ækvivalenter til disulfider i nukleare og cytosol proteiner opretholde reducerede cysteinrester i disse proteiner. Heri belyst vi rolle TR1 i selvforsyning af vækst ved at vise, at inhibering af DNA-replikation i en malign TR1 knockdown cellelinie er associeret med en reduktion i DNA Pol α ekspression. Desuden har andre undersøgelser antydet, at DNA-replikation kan forsinkes ved at begrænse DNA-syntese, eftersom thioredoxin har en rolle i at opretholde det intracellulære deoxynukleotid pool [11], [22], [23]. Men vi udelukket denne mulighed ved at undersøge deoxynucleotid pools i kontrol, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler og vise, at de ikke varierer under vækst i serum-mangel medium (se fig. S2).

Mange TR1 funktioner og egenskaber tyder på, at denne selenoprotein har anti-cancer funktioner: 1) oxidativt stress er en af ​​vigtigste karakteristika kræftceller og TR1 er en central aktør i antioxidant forsvar ved at reducere TRX1 og andre redox regulatorer i celler [ ,,,0],9] – [12]; 2) TR1 er afgørende for korrekt funktion af tumor suppressor p53 [13]; 3) TR1 hæmning af carcinogene, elektrofile forbindelser impliceret den i forebyggelse af kræft [1]; og 4) den selenholdig aminosyre, Sec, indtager det aktive katalytiske sted i TR1 [4] og selen vides at have potente forebyggelse af kræft egenskaber [1]. Imidlertid har TR1 også været impliceret i tumor udvikling og vedligeholdelse: 1) det overudtrykkes i mange tumorer og cellelinier [9] – [12]; 2) flere antitumorlægemidler er potente inhibitorer af TR1 antyder, at dette enzym er et mål for cancerterapi [9] – [14]; 3) den målrettede fjernelse af TR1 reverserer morfologi og andre kræft egenskaber ved maligne celler [16] (se også fig 2 og 3 og Tekst S1).; og 4) selenmangel er blevet rapporteret at nedsætte tumordannelse er nogle kræftmodeller i dyr [24].

Hvordan kan rolle TR1 i udviklingen af ​​kræft forenes med sin rolle i tumor undertrykkelse samt kendte anti-cancer egenskaber af selen, som er en katalytisk bestanddel af TR1? Det er fristende at spekulere, at tilstrækkelige mængder af kosten selen i almindelighed og en tilstrækkelig ekspressionsniveauet af TR1 navnlig opretholde cellulær redox homeostase i normale celler, beskytter dem mod oxidativ stress, mutationer i DNA og beskadigelse af andre cellulære komponenter. Således TR1, sammen med andre selenoproteiner, kan fungere i forebyggelse af kræft ved at hæmme malign transformation. i nyopståede tumorer, kræver imidlertid, for TR1 i høj grad øge da dette protein synes at være forpligtet til at opretholde tumorvækst, sandsynligvis på grund af den øgede efterspørgsel efter sine reducerende ækvivalenter via TRX1 vej, og som vist i dette arbejde, DNA-replikation. Forslaget forklarer både den potente forebyggelse af kræft aktivitet af kosten selen og de kontrasterende roller TR1 i både forebyggelse og fremme af kræft. Desuden er denne undersøgelse giver grundlag for at forklare forskellige litteraturdata om den rolle, denne gådefulde protein i kræft og hæver TR1 endnu længere som en [8] – [12], [14] – [16] vil utvivlsomt have en stor indflydelse på hvordan vi vision indtaget af selen i kosten af ​​mennesker og andre pattedyr. Det har været kendt for engang, at kost, der indeholder tilstrækkelige eller supplerende mængder af selen have gavnlige virkninger i at forebygge visse kræftformer eventuelt gennem virkningen af ​​berige selenoprotein befolkning [1]. Dog bør der udvises forsigtighed udtrykkes i, at når en malignitet initieres, så tilstrækkelige eller berigede mængder af selen i kosten kan tjene til at drive tumorigenese. Vores undersøgelse tilføjer en vigtig lag til at forstå roller redox processer i udviklingen af ​​kræft og brugen af ​​kosten i forebyggelse og behandling af kræft.

Materialer og metoder

Materialer

75Se (specifik aktivitet 1000 Ci /mmol) blev opnået fra Research Reactor Facility, University of Missouri, Columbia, MO. PVDF-membran, NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler, hygromycin B, lipofectamin 2000 Dulbeccos modificerede Eagles medium (DMEM), antibiotika-antimykotisk opløsning og føtalt bovint serum var fra Invitrogen Life Technologies. siRNA vektor pSilencer 2.1-U6 Hygro blev købt fra Ambion, Inc. og ρ-iodonitrotetrazolium violet (INT) fra Sigma. Antistoffer mod DNA polymerase α, β, δ og ε blev indkøbt fra Abcam, Inc. og antistoffer mod PCNA og Cdc45 var fra Santa Cruz Biotechnology, Inc .. BCA protein assayreagens, SuperSignal West Dura Extended Duration Substrat og HRP-konjugeret sekundært antistof var fra Thermo Fisher Scientific Inc. FITC BrdU flow kit blev købt fra BD Pharmingen ™. Cancercellelinie DT, som koder oncogene

K-RAS

og opstod i NIH3T3 (parentale) celler blev generøst leveret af Dr. Yoon Sang Cho-Chung og NIH3T3-celler blev opnået fra American Type Culture Collection. LLC1 (muse Lewis lungecarcinoma) celler blev opnået som givet [16] og humane cellelinjer ACHN (human nyre renalcellecarcinom), A549 (human lunge ikke-småcellet carcinom), HCT116 (human colon celle adenocarcinom) og SNB19 (human celle glioblastoma) blev opnået fra NCI, DTP, DCTD Tumor Repository på NIH, Bethesda, MD.

Kultur af mammale celler og celle vækstassays

NIH3T3 og DT-celler blev dyrket i DMEM suppleret med 10% føtalt bovint serum og antibiotika-antimykotisk opløsning ved 37 ° C, 5% CO

2 i en fugtig inkubator. Stabilt transficerede siTR1 (TR1 knockdown) DT-celler og stabilt transficerede pU6-m3 kontrol DT-celler blev fremstillet ved transfektion med de tilsvarende konstruktioner med Lipofectamine 2000 og derefter vælge celler i nærvær af 500 ug /ml hygromycin B nøjagtigt som beskrevet [16] .

morfologi NIH3T3, DT, DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler blev vurderet under eksponentiel vækst ved at pode celler på 60 mm dyrkningsskåle, cellerne vokset eksponentielt og fotograferet med en omvendt fase-kontrast mikroskop . Vækstrater af NIH3T3 blev DT /pU6-m3 og DT /siTR1 celler vurderet ved såning 2 × 10

5 celler /60 mm dyrkningsskål og efter 48 timers vækst blev cellerne høstet med trypsin-EDTA, og cellerne tælles ved trypanblåt ekstrudering metode [16]. For at vurdere væksten af ​​celler i serum-mangelfulde tilstand, celler (5 x 10

5 celler /60 mm dyrkningsskål) var seedet og høstet efter 24 og 48 timer inkubation i medium, der indeholder alle komponenter som komplet medium undtagen 0,5% FBS i stedet for 10% FBS, og cellerne tælles som ovenfor.

Western blot-analyse og

75Se mærkning af celler

Teknikker til western blot-analyse og mærkning af celler med

75Se er blevet beskrevet andetsteds [16]. Kort beskrevet for Western blot-analyse blev celler vasket med kold PBS og helcellelysater fremstillet under anvendelse lysepuffer (20 mM Tris-CI, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0,5% natriumdeoxycholat, 10 mM NaF, 5 mM EDTA og proteinase inhibitor cocktail). Mængden af ​​protein i celleekstrakter blev målt ved anvendelse af BCA-protein assayreagens, 30 ug proteinprøver elektroforese på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-geler, de adskilte proteiner overføres til en PVDF-membran, og derefter inkuberet i første omgang med primært antistof ( polyklonalt anti-TR1, anti-DNA Pol α, β, δ, ε, anti-PCNA og anti-Cdc45) og endelig med HRP-konjugeret sekundært antistof. Membraner blev omsat med SuperSignal West Dura Extended Duration Substrat og eksponeret for røntgenfilm.

I

75Se-mærkning blev celler podet på en plade med 6 brønde (3 x 10

5 celler /brønd), inkuberet 24 timer, derefter mærket med 40 uCi

75Se i 24 timer, høstet og lyseret som beskrevet ovenfor. 40 ug af hver prøve blev påført på NuPAGE 4-12% Bis-Tris-gel, elektroforeret, proteiner farvet med Coomassie Blue farvning løsning, gelen tørres og eksponeres for en Phosphorlmager (Molecular Dynamics).

75Se-mærket selenoproteiner på udsatte geler blev identificeret ved autoradiografi [16].

blød agar-assay

Vækst af celler i blød agar for at vurdere deres evne til at opretholde forankringsuafhængig vækst har været beskrevet andetsteds [16]. Kort beskrevet i alt 1000 kontrol, DT, blev DT /pU6-m3 eller DT /siTR1 celler suspenderet i 3 ml 0,35% ædelt agar i vækstmedium med 10% FBS, og spredes jævnt på 60 mm plader dækket med et 4 ml basal lag af 0,7% ædle agar i DMEM. Plader blev inkuberet i en befugtet CO

2 inkubator i 14 dage, 0,5 ml frisk vækstmedium tilføjet på agarpladen hver 5 dage. De kolonier, der udviklede blev visualiseret ved farvning med ρ-iodonitrotetrazolium violet (INT) natten over, og pladerne fotograferet.

Cell cyklus analyse

Celler blev podet på cellekultur parabol (5 × 10

5 celler /60 mm skål) og inkuberet natten over før overførsel til serum-deficiente medier (0,5% FBS i DMEM). Celler blev inkuberet med 5-brom-2-deoxyuridin (BrdU) 6 timer før høst, BrdU-mærkede celler høstet på bestemte tidspunkter (0 timer, 24 timer og 48 timer) og farvet med antistoffer til at overvåge replikeret DNA. Høstede celler blev fikseret og permeabiliseret med BD Cytofix /CytopermTM Fiksering /Permeabilisering løsning til intracellulær farvning. For replikeret DNA-farvning, blev inkorporeret BrdU probet med anti-BrdU-antistof og hele genomisk DNA blev farvet med 7-amino-actinomycin D (7-AAD) ved at følge fabrikantens procedurer. Celler, der indeholder de respektive DNA stater blev analyseret ved flowcytometri under anvendelse af et FACS Calibur 2 Sorter (Beckton Dickinson), og antallet af celler i hver fase af cellecyklussen kvantificeret ved FlowJo (Tree Star, Inc.).

Støtte oplysninger

Tekst S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s001

(0,03 MB DOC)

Figur S1.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s002

(3,54 MB TIF)

figur S2.

doi: 10,1371 /journal.pone.0001112.s003

(0,82 MB TIF)