PLoS ONE: tidlig påvisning af Reaktion på Eksperimentel Chemotherapeutic TOP216 med [18F] FLT og [18F] FDG PET i Human ovarie Cancer Xenografter i mus

Abstrakt

Baggrund

3′-deoxy-3 ‘- [

18F] fluorthymidin (

18F-FLT) er et sporstof anvendes til at vurdere celledeling

in vivo

. Formålet med undersøgelsen var at bruge

18F-FLT positronemissionstomografi (PET) for at studere behandlingsreaktioner til en ny anti-cancer stof. For at gøre dette, vi studerede tidlige anti-proliferative virkninger af den eksperimentelle kemoterapi TOP216 ikke-invasivt ved PET.

Metode /vigtigste resultater

In vivo

optagelse af

18F-FLT i humane ovariecancer-xenotransplantater i mus (A2780) blev undersøgt på forskellige tidspunkter efter TOP216 behandling (50 mg /kg iv på dag 0 og 48 timer) blev påbegyndt. Baseline

18F-FLT-scanninger blev foretaget før enten TOP216 (n = 7-10) eller bærer (n = 5-7) blev injiceret og gentages efter 2 og 6 timer og 1 og 5 dages behandling. En parallel undersøgelse blev foretaget med 2′-deoxy-2 ‘- [

18F] fluor-D-glucose (

18F-FDG) (n = 8). Tracer optagelse blev kvantificeret ved anvendelse af små dyr PET /CT. Imaging resultater blev valideret af tumor volumen ændringer og gen-ekspressionen af ​​Ki67 og TK1. TOP216 (50 mg /kg 0 og 48 timer) hæmmede væksten af ​​A2780 tumor sammenlignet med kontrolgruppen (P 0,001).

18F-FLT optagelse faldt betydeligt på 2 timer (-52%; P 0,001), 6 timer (-49%; p = 0,002) og Dag 1 (-47%; P 0,001) efter TOP216 behandling. På dag 5

18F-FLT-optagelse var sammenlignelig for optag i kontrolgruppen. Optagelse af

18F-FLT var uændret i kontrolgruppen under eksperimentet. I behandlingsgruppen, optagelse af

18F-FDG blev signifikant nedsat ved 6 timer (-21%; p = 0,003), Dag 1 (-29%; P 0,001) og Dag 5 (-19%; P = 0,05) i forhold til baseline.

konklusioner /betydning

en injektion med TOP216 igangsat en hurtig og signifikant fald i celle-spredning vurderbare af

18F-FLT efter 2 timer. De tidlige reduktioner i tumorcelleproliferation forud ændringer i tumorstørrelse. Vores data viser, at

18F-FLT PET er lovende for den tidlige ikke-invasiv vurdering af kemoterapi effekter i både stof udvikling og for at skræddersy behandlingen til patienter

Henvisning:. Munk Jensen M, Erichsen KD, Björkling F, Madsen J, Jensen PB, Højgaard L, et al. (2010) tidlig påvisning af Reaktion på Eksperimentel Chemotherapeutic TOP216 med [

18F] FLT og [

18F] FDG PET i Human ovarie Cancer Xenografter i mus. PLoS ONE 5 (9): e12965. doi: 10,1371 /journal.pone.0012965

Redaktør: Andrew Boswell, Genentech, USA

Modtaget: Juli 8, 2010; Accepteret: August 28, 2010; Udgivet: 24 September, 2010

Copyright: © 2010 Munk Jensen et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. AP Møller Fonden, dansk Højteknologifonden, Svend Andersens Fond, Novo Nordisk Fonden, Lundbeckfonden, Birthe og John Meyer Foundation, dansk Cancer Society, Rigshospitalets Forskningsfond, Region Danmark Hovedstaden og Topotarget A /S. De medforfattere ansat af Topotarget havde en rolle i studie design og dataindsamling og analyse. De andre finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:. Følgende medforfattere har interessekonflikter: Peter Buhl Jensen: Ejerskab Interesser og beskæftigelse i Topotarget A /S. Maxwell Sehested: Ejerandele og beskæftigelse i Topotarget A /S. Fredrik Björkling: Beskæftigelsen i Topotarget A /S. Kamille Dumong Erichsen: Beskæftigelsen i Topotarget A /S. Alle andre forfattere har ingen interessekonflikt. At nogle af medforfatterne er ansat af Topotarget A /S ændrer ikke forfatternes overholdelse af PLoS ONE politikker på datadeling og materialer.

Introduktion

Til vurdering af effekten i dyreforsøg under præklinisk udvikling af nye anticancermidler, reduktion i tumorvolumen er den mest almindeligt anvendte kriterium for effektivitet. tiden indtil tumorskrumpning, kan imidlertid være lang og det kræver gentagne målinger tumorvolumen flere gange om ugen for at vise virkning. Non-invasiv molekylær billeddannelse såsom positronemissionstomografi (PET) giver mulighed for biologiske processer, der skal visualiseres og kvantificeres ikke-invasivt over tid. En ikke-invasiv metode til at påvise tidlige biologisk respons efter anticancer behandling ville være værdifuld i anticancer lægemiddeludvikling at skelne effektive fra ikke-effektive lægemidler inden ændringer i tumorvolumen blevet tydeligt.

Øget celleproliferation er en af ​​de vigtigste træk ved cancer [1]. Megen forskning fokuserer på ikke-invasiv visualisering af celleproliferation, som kan anvendes til at definere en biologisk reaktion på behandling tidligt i løbet af behandlingen. 3′-deoxy-3 ‘- [

18F] fluorthymidin (

18F-FLT) anvendes som en PET-tracer til visualisering af celleproliferation [2].

18F-FLT er et thymidin-analog og følgelig et substrat af DNA’et syntesevej [3]. Når det tages op i celler

18F-FLT phosphoryleres af thymidinkinase-1 (TK1), hvilket fører til intracellulær trapping. TK1 aktivitet er stramt cellecyklus reguleret og hovedsageligt udtrykt i S-fasen af ​​cellecyklussen; Følgelig antages det at afspejle mængden af ​​prolifererende celler [4], [5].

18F-FLT optagelse er positivt korreleret med cellevækst og TK1 aktivitet [5] – [7]. Flere undersøgelser har vist en sammenhæng mellem

18F-FLT optagelse og tumorcelleproliferation både kræft implanteret i mus [8] – [11] og humane tumor prøver [12] – [14].

Flere prækliniske studier har evalueret proliferation målt ved

18F-FLT PET i respons på forskellige kemo- og strålebehandling i forskellige dyremodeller af cancer [8] – [11], [15] – [19]. Resultaterne fra disse undersøgelser varierer; den første ændring i

18F-FLT optagelse findes i området fra 24 timer til en uge efter påbegyndelse af behandling. Imidlertid har ikke alle undersøgelser fundet en sammenhæng mellem tumor respons og en ændring i

18F-FLT optagelse efter behandlingens start [20], [21]. Tilsyneladende, tidsrammen for at vurdere ændringer i spredningen er meget varierende efter forskellige behandlingsregimer.

Tidlig non-invasiv påvisning af anti-proliferativ aktivitet med

18F-FLT PET kunne også være nyttig i en klinisk indstilling til at afgøre, om patienterne reagerer på konventionel behandling og i fase i, II og III studier, når evaluerer reaktioner på nye lægemidler mod kræft. I dag de mest anvendte metoder til at vurdere tumor respons klinisk er med anatomiske billeddiagnostiske teknikker såsom computertomografi (CT) og magnetisk resonans imaging (MRI) ved hjælp af svar evalueringskriterier i solide kræftsvulster (RECIST). Men det kræver ofte, flere uger eller måneder, før en eventuel reaktion bliver tydelig [22], [23]. For nylig retningslinjer for undersøgelse af tumorresponser under anvendelse af PET og 2′-deoxy-2 ‘- [

18F] fluor-D-glucose (

18F-FDG) er blevet foreslået angivelse af behovet for yderligere fremgangsmåder til måling tumorresponser [24]. Nye anticancermidler er ofte tumorstatic stedet tumordræbende og ændringer i tumorstørrelse kan være minimal trods effektiv behandling hvorved der genereres et behov for nye metoder til at vurdere klinisk respons udover tumorvolumen krympning.

18F-FDG er i øjeblikket den mest anvendte radiotracer til billeddannelse i onkologi og er meget nyttigt til detektion og karakterisering af cancere. Flere undersøgelser har analyseret ændringer i

18F-FDG optagelse efter anti-cancer behandling, men med variable resultater [25].

18F-FDG lider den begrænsning, at det måske ikke detektere effekter på et meget tidligt tidspunkt, og en inflammatorisk respons efter kræftbehandling kan til en vis grad obskure påvisning af anti-cancer effekt [26], [27].

TOP216 er en mere potent og metabolisk stabile derivat af Top001, som blev opdaget af BioImage at have kraftig og selektivt drab effekt på brystcancercellelinier [28]. Top001 inhiberer mTOR pathway i en celle-selektiv måde efter forlænget inkubation (~24 timer). Sammenhængen mellem mTOR hæmning og cellelinie følsomhed er god, men ikke perfekt.

TOP216 hæmmer protein, RNA og DNA-syntese i følsomme cellelinjer efter 1-2 timers inkubation og inducerer apoptose. Induktion af apoptose som målt ved caspase 3/7 aktivitet kan spores efter 6 timer i mest følsomme cellelinjer. Top001 og TOP216 ikke signifikant hæmmer kinaser (Upstate kinase panel) eller receptorer (Cerep panel) ved relevante koncentrationer og i øjeblikket den nøjagtige mål eller virkningsmekanisme er endnu ikke identificeret. TOP216 viser potent

in vivo

effekt i mus xenograftmodeller af menneskelig brystkræft, prostatakræft, æggestokkene, og bugspytkirtelkræft, både når det administreres intravenøst og po. TOP216 undergår i øjeblikket lovgivningsmæssige sikkerhed og toksikologi undersøgelse med det formål at flytte forbindelsen ind på klinikken.

Formålet med undersøgelsen var at bruge

18F-FLT PET for at studere behandling svar på en nye anti-cancer forbindelse ikke-invasivt. For at gøre det, vi filmede celledeling

in vivo

med

18F-FLT PET i en human cancer mus tumor model efter påbegyndelse af behandling med TOP216. Optagelse af

18F-FLT var sammenlignet med optagelse af

18F-FDG og Ki67 og TK1 genekspression.

Materialer og metoder

Tumor model

Animal pleje og alle eksperimentelle procedurer blev udført under godkendelsen af ​​det danske Animal Welfare Council (2006 /561-1124). NMRI (Naval Medical Research Institute) nøgne mus (8-11 uger gamle) blev erhvervet fra Taconic Europe (Lille Skensved, Danmark) og fik lov at akklimatisere sig i en uge i dyret anlægget før ethvert indgreb blev påbegyndt. Den humane ovariecarcinom cellelinie A2780 (en gave fra R. Ozols, Fox Chase Cancer Center Philadelphia, PA, Januar 2004) blev anvendt. 10

7-celler i 100 pi medium blandet med 100 pi Matrixgel ™ basalmembranmatrix (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) blev injiceret subkutant i den venstre og højre flanke henholdsvis under anæstesi med 01:01 v /v-blanding af Hypnorm® (Janssen Pharmaceutica, Beerse, Belgien) og Dormicum® (Roche, Basel, Schweiz). Cellelinien er testet fri for mycoplasma; det har imidlertid ikke blevet godkendt. Celler blev dyrket i RPMI (Roswell Park Memorial Institute) medium 1640+ GlutaMAX (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) suppleret med 10% føtalt kalveserum (Biological Industries, Israel) og 1% penicillin-streptomycin (Invitrogen) i 5% CO

2 ved 37 ° C.

Eksperimentel design

Seks grupper af mus blev fulgt (n = 5-10 tumorer per gruppe). Behandling blev startet på dag 12-24 efter implantation af tumorceller, når tumorvolumener var i gennemsnit 225 mm

3. Mus modtog TOP216 behandling 50 mg /kg i.v. eller bærer (2% DMSO, 20% HP-b-CD i saltvand) ved 0 og 48 timer (figur 1). Denne dosis af TOP216 var i de foregående analyser vist sig at inhibere væksten af ​​A2780 xenograft tumor (data ikke vist). Før blev startet behandling blev musene scannet med

18F-FLT eller

18F-FDG for at bestemme baseline niveau af sporstof optagelse.

18F-FLT eller

18F-FDG scanninger blev gentaget ved 6, 30 (dag 1) og 126 (dag 5) timer efter injektion af TOP216 eller vehikel (figur 2) Desuden en gruppe mus blev scannet med

18F-FLT ved baseline og 2 timer efter påbegyndelse af behandling (TOP216 eller køretøjer). Tumorvolumen blev efterfulgt af CT under forsøgene [29]. Tumor volumener blev beregnet i forhold til volumen ved baseline.

Angivelse af Ki67 og TK1 blev analyseret

in vitro

i en parallel gruppe af mus, der blev behandlet med enten TOP216 eller køretøj, og biopsi før og ved 6, 30 (dag 1) og 126 (Dag 5) timer efter behandlingsstart. Biopsier blev fjernet med en 18G nål og anbringes umiddelbart i RNA later® (Ambion (Europe) Limited, Cambridgeshire, UK). Alle prøver blev opbevaret ved 4 ° C, og den følgende dag RNAlater® blev fjernet, og prøver overført til -80 ° C indtil yderligere qPCR forarbejdning.

Syntese af

18F-FLT og

18F-FDG

[18F] FLT blev syntetiseret under anvendelse af 3-N-Boc-1- [5-O- (4,4′-dimethoxytrityl) -3-O-Nosyl-2-deoxy-BD lyxofuranosyl] thymin som forstadium og syntetiseret på en GE TracerLab MX Synthesizer. Alle reagenser og FLT kassetter blev købt hos ABX (Radeberg, Tyskland). Den radiokemiske renhed blev bestemt efter måling af indholdet af fluor-18 og andre radioaktive urenheder i FLT opløsning målt med TLC og HPLC respektivt. Indholdet af ethanol og acetonitril blev bestemt ved GC-analyse. PH blev målt med et pH-meter. I separate præparater stabiliteten af ​​præparater blev undersøgt efter 8 timer. HPLC blev udført på et Gilson HPLC-system (Biolab A /S, Danmark) udstyret med en Dionex UV-detektor (Dionex Danmark A /S, Danmark) og en in-line radioaktivitet detektor. HPLC-søjlen var en Luna 5 μ C18 (2) 100A, 150 x 4,6 mm (Phenomenex, Danmark). Eluenten var vand /acetonitril 90/10 og en strømningshastighed på 1 ml /min. UV-detektion ved 267 nm. TLC plader blev opnået fra Merck og vand /acetonitril 5/95 blev anvendt som eluent. Resterende opløsningsmidler blev bestemt på en Shimatzu GC 2014 (Holm Halby, A /S, Danmark) udstyret med en Chromosorb 101, 100-120 Mesh, kolonne 1/8 “× 10”, FID detektor og helium bæregas. Temperaturen af ​​søjlen var 210 ° C. Den radiokemiske renhed af

18F-FLT var 98% med en specifik radioaktivitet spænder fra 150 til 270 GBq /pmol på EOS. Ethanolindholdet var i intervallet 7-8%, og mængden af ​​acetonitril var under detektionsgrænsen. PH var 7,5-7,8. Den radiokemiske renhed, gjorde ethanol indhold og pH ikke ændres efter 8 timers opbevaring ved stuetemperatur.

18F-FDG blev erhvervet fra daglige produktioner til klinisk brug (Rigshospitalet, København, Danmark).

microPET og microCT imaging

Mus blev injiceret iv med 10,0 ± 1,5 (gennemsnit ± SD) MBq

18F-FDG eller 6,9 ± 2,4 (gennemsnit ± SD) MBq

18F-FLT. Mus blev fastet natten over, før hver

18F-FDG scan [30]. En time efter tracer injektion mus blev bedøvet med 3% sevofluran (Abbott Scandinavia AB, Solna, Sverige) blandet med 35% O

2 i N

2 og fastgjort på en seng i tilstedeværelse af tre referencemærker markører tillader fusion af PET- og CT billeder. En 20 min PET-scanning blev erhvervet ved hjælp af en MicroPET Focus 120 (Siemens Medical Solutions, Malvern, PA, USA). Efter dataopsamling blev PET data arrangeret i sinograms og efterfølgende rekonstrueret med maksimal a posteriori (MAP) genopbygning algoritme. Pixelstørrelsen var 0,866 × 0,866 × 0,796 mm og i centrum synsfelt opløsningen var 1,4 mm fuld bredde-at-halv-maksimum.

Efter microPET scanning, en microCT scanningen blev erhvervet med Microcat® II-systemet (Siemens Medical Solutions). En 7 minutter og 10 sekunder CT-scanning blev udført med parameterindstillinger: 360 rotation trin, rør spænding 60 kV, rør nuværende 500 uA, udsmidningen 4 og eksponeringstid 310 ms. Pixelstørrelsen var 0,091 × 0,091 × 0,091 mm.

PET og microCT billeder blev fusioneret i Inveon software (Siemens Medical Solutions). Før fusion region interesser (ROI’er), er opstillet på CT billederne manuelt ved kvalitativ vurdering, der dækker hele tumorer og efterfølgende optagelse tumor volumen og sporstof, vurderet ved hjælp af standard optagelse er værdier (SUV) betyder og maksimal blev genereret ved summation af voxel inden for tomografiske fly.

Kvantitativ real-time polymerasekædereaktion (qPCR)

Totalt RNA blev isoleret fra biopsierne med TRI reagent® følge producentens instruktioner (Molecular Research center Inc., OH, USA ) og efterfølgende RNA integritet blev målt på en 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). RNA kvalitet angives som RNA integritet nummer (RIN) [31]. Koncentrationen af ​​RNA blev bestemt ved NanoDrop 1000 (Thermo Fisher Scientific, Wilmington, DE, USA). Totalt RNA (0,3 ug) blev vendt transkriberet under anvendelse af Affinityscript ™ QPCR cDNA Synthesis kit (Stratagene, La Jolla, CA, USA) ifølge producentens anvisninger. Prøver blev afkølet og opbevaret ved -20 ° C indtil yderligere anvendelse.

Genekspression blev kvantificeret på Mx3000P® real-time PCR-system fra Stratagene. Ki67 og TK1 blev hver kvantificeret i en duplex med TATA-boks-bindende protein (TBP). Den Brilliant® QPCR Core Reagent Kit (Stratagene) blev anvendt. Optimering af assays resulterede i 50% stigning i dNTP og Taq-polymerase. En MgCl koncentration på 5,5 mM blev anvendt til alle eksperimenter. Det følgende termiske profil blev anvendt i alle forsøg:. 10 minutter af denaturering ved 95 ° C efterfulgt af 45 cykler med denaturering i 30 sekunder ved 95 ° C og annealing /forlængelse ved 60 ° C i 1 minut

Relativ kvantificering af den sammenlignende fremgangsmåde (2

-ΔΔCt) [32] blev anvendt. Målingerne blev korrigeret for effektiviteten af ​​PCR-reaktionen beregnes ved 5-gange fortynding kurver og dermed erstatte 2 i formlen med (E + 1) [33]. Effektivitet korrektioner blev foretaget for hvert gen i hver assay. Væv fra baseline prøver tjente som kalibrator. TBP blev anvendt som reference-genet. Dette gen er tidligere testet til at være stabil i tumor versus normale væv og senere viser sig at være stabile i denne eksperimentelle opsætning.

Primere og TaqMan dual-mærkede prober blev designet ved hjælp Beacon Designer (PREMIER Biosoft, Palo Alto, CA USA). Primere og prober er vist i (tabel 1). For hvert gen blev fundet den optimale primer og probe-koncentration. Alle prøver blev kørt tredobbelt hjælp af en pi cDNA. Til hver prøve en no-revers transkription kontrol (Nort) var medtaget, og på hver plade en no-skabelon kontrol (NTC) blev inkluderet.

Statistisk analyse

Sammenligning af tumor volumen mellem TOP216 behandlede og kontrolgrupper blev beregnet under anvendelse af en uparret t-test. Parret t-test blev anvendt til koncerninterne sammenligninger. Bonferroni korrektion af p-værdier for flere sammenligninger blev påført. Alle data blev testet til at være normal fordeles ved hjælp af Kolmogorov-Smirnov test. Beregninger blev foretaget i SPSS 16.0. Data er rapporteret som middelværdi ± SEM og P. 0,05 blev betragtet som statistisk signifikant

Resultater

Effekt af TOP216 på tumorstørrelse

TOP216 (50 mg /kg ved 0 og 48 timer) hæmmede væksten af ​​A2780 humane ovariecancer xenotransplantater i mus

in vivo

sammenlignet med kontrolgruppen (P 0,001) (figur 3). Størrelserne af de ubehandlede tumorer steg med ca. en faktor 3 i løbet af undersøgelsen og mængder af de behandlede tumorer var uændrede.

A) Virkningerne af TOP216 på væksten af ​​A2780 tumorxenoplantater. Tumor volumen blev bestemt ved microCT. Mus blev behandlet med TOP216 (50 mg /kg) eller bærer ved 0 og 48 timer. *) P 0,05, **) P 0,01 vs. baseline og

# # #) P 0,001 vs. kontrol. n = 15 tumorer per gruppe. B) ændringer i tumor volumen vurderet ved forholdet Dag 5 /baseline i kontrolgruppen som funktion af baseline FLT optagelse. n = 7 tumorer. R

2 = 0,61, P = 0,04.

18F-FLT og

18F-FDG optagelse

Baseline tumor optagelse af

18F- FLT i A2780 tumor model var relativt høj (SUVmean 1,05 ± 0,03), hvilket gør det nemt at skelne tumor fra ikke-tumorvæv henviser til

18F-FDG kun en beskeden tumoroptagelse blev observeret (SUVmean 0,48 ± 0,02). I kontrolgruppen, baseline

18F-FLT-optagelse forventet stigning tumorvolumen over 5 dage (lineær regression af SUVmean baseline vs. tumorvolumen forholdet Dag 5 /baseline: r

2 = 0,61, P = 0,04) (figur 3). Ingen sammenhæng mellem baseline

18F-FDG optagelse og tumor volumen stigning blev observeret.

Optagelse af

18F-FLT vurderet af SUVmean faldt betydeligt fra 1,09 ± 0,03 ved baseline til 0,53 ± 0,02 (-52 %; P 0,001) ved 2 timer, til 0,56 ± 0,06 (-49%; P 0,001) ved 6 timer og til 0,58 ± 0,03 (-47%; P 0,001) på dag 1 efter TOP216 behandlingsstart (figur 4 5).

A) De otte billeder på venstre er repræsentative koronale smeltet PET /CT-billeder af to mus scannet med

18F-FLT ved baseline og efter 6 timer og 1 og 5 dage efter behandlingens start . Billederne øverst viser en mus behandlet med TOP216 og billeder på bunden viser en kontrol mus, som modtog køretøj. De fire billeder på højre viser smeltet PET /CT-billeder af to repræsentative mus behandlet med enten TOP216 eller køretøj, og scannet ved baseline og 2 timer efter behandlingsstart. Pilene peger mod tumorerne. B) Repræsentative koronale smeltet PET /CT-billeder af to mus scannet med

18F-FDG ved baseline og 6 timer og 1 og 5 dage efter behandling start. Billederne øverst viser en mus behandlet med TOP216 og billeder på bunden viser en kontrol mus, som modtog køretøj. Pilene peger mod tumorerne.

TOP216 /bærestof-behandling påbegyndt ved 0 timer og gentaget ved 48 timer efter den første injektion. N = 5-10 tumorer per gruppe. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 sammenlignet med baseline. De to grafer på venstre viser data fra de

18F-FLT forsøg og de to grafer i rette viser data fra de

18F-FDG eksperimenter.

Efter 5 dage

18F -FLT optagelse (1,33 ± 0,08) var sammenlignelig med baseline optagelse. SUVmean var uændret i kontrolgruppen under eksperimentet. SUVmax værdier faldt markant fra 2,01 ± 0,09 ved baseline til 0,89 ± 0,05 på 2 timer (-55%; P 0,001), til 0,94 ± 0,08 på 6 timer (-53%; P = 0,002) og til 0,84 ± 0,03 på dag 1 (-58%; P 0,001). SUVmax værdier steg til 2,26 ± 0,12 på dag 5 efter behandlingsstart (13%; P = 0,04). SUVmax var uændret i kontrolgruppen, men steg en smule på dag 5 efter behandlingsstart i forhold til baseline (13%; P = 0,03).

Optagelse af

18F-FDG vurderet af SUVmean faldt signifikant fra 0,49 ± 0,03 ved basislinje til 0,39 ± 0,02 (-21%, P = 0,003) ved 6 timer, til 0,35 ± 0,01 (-29%; P 0,001) på dag 1 og 0,40 ± 0,02 (-19%, P = 0,05 ) på dag 5 (figur 4 + 5). Optagelse af

18F-FDG i kontrolgruppen var signifikant forøget på dag 5 sammenlignet med baseline optagelse (27%, P = 0,05). SUVmax værdier faldt betydeligt fra 0,92 ± 0,06 ved baseline til 0,64 ± 0,04 ved 6 timer efter injektion (-31%, p 0,001), til 0,53 ± 0,02 ved dag 1 (-42%; P 0,001) og 0,66 ± 0,03 på Dag 5 (-29%, p = 0,01). SUVmax var uændret i kontrolgruppen under eksperimentet.

Angivelse af Ki67 og TK1

Angivelse af henvisningen gen TBP var konstant gennem hele eksperimentet. Forskelle i Ct-værdier mellem normale prøver og Nort prøver var 13 (median). RNA integritet numre (RIN-værdier) var 9,1 ± 0,1 (middelværdi ± SD) for alle prøver.

Gene ekspressionsniveauer af Ki67 og TK1 er vist i figur 6. I behandlingsgruppen ekspression af Ki67 var signifikant lavere 6 timer efter injektion (-31%, P = 0,01) og dag 1 (-71%; P 0,001) efter behandling starter i forhold til baseline. Ekspression af Ki67 var 21% øget på dag 5 (P = 0,04) i forhold til baseline. Ekspression af Ki67 i kontrolgruppen var signifikant lavere ved 6 timer (-17%; P = 0,01). Sammenlignet med baseline

Data er præsenteret som fold ændringer efter behandling med TOP216 /køretøj i forhold til baseline niveau (n = 7 tumorer per gruppe). TOP216-behandling påbegyndt ved 0 timer og gentaget ved 48 timer efter den første injektion. *) P 0,05, **) P 0,01, ***) P 0,001 sammenlignet med baseline

I behandlingsgruppen udtryk for TK1 blev signifikant nedsat ved dag 1 (-56%. , P 0,001) i forhold til baseline. På dag 5 udtryk for TK1 blev øget (30%, P = 0,013) sammenlignet med baseline. I kontrolgruppen udtryk for TK1 uændret under forsøget.

Diskussion

En injektion med TOP216 igangsat en hurtig og signifikant fald i celleproliferation på 52% vurderbare af

18F-FLT PET så tidligt som 2 timer efter injektion. Dette fald varet i mindst 1 dag, men på dag 5 (3 dage efter 2

nd behandling) optagelse af

18F-FLT var sammenlignelig for optag i kontrolgruppen tyder på, at tumorcellerne havde genvundet deres proliferation kapacitet. Optagelse af

18F-FLT i kontrolgruppen ændrede sig ikke under eksperimentet derved valideret anti-proliferative effekt af TOP216. I modsætning til den stejle fald i

18F-FLT-optagelse efter behandlingens start, en lille, men signifikant, fald i

18F-FDG optagelse blev observeret ved 6 timer og på dag 1 efter initiering af TOP216 behandling, og dette fald varede indtil Dag 5. ændringer i

18F-FLT optagelse (maks fald: 52%, 2 h) var mere udtalt end ændringer i

18F-FDG optagelse (maks fald: 29%; Dag 1). Men ved afslutningen af ​​forsøget,

18F-FDG optagelse forblev lavere end ved baseline i TOP216 gruppen, mens den blev øget i kontrolgruppen.

Faldet i

18F-FLT optagelse tidlige post-injektion var ikke ledsaget af et fald i tumor volumen som volumen af ​​tumorerne ændrede sig ikke i løbet af behandlingen. Dette illustrerer, at anvendelsen af ​​ikke-invasiv billeddannelse at vurdere tumorrespons er vigtigt, eftersom evaluering reduktion i tumorvolumen som et endepunkt ville have genereret et falsk negativt resultat. Anti-volumen virkning TOP216 blev dog stadig set i forhold til kontrolgruppen. Ændringer i sporstof tilgængelighed f.eks som en konsekvens af tumor perfusion ændringer efter behandling, kunne redegøre for nogle af effekten på faldet

18F-FLT optagelse. Den omstændighed, at

18F-FDG-optagelse ikke faldt på samme måde som

18F-FLT fører til den antagelse, at falde i

18F-FLT optagelse er ikke kun på grund af en ændring i tumor perfusion men også en fysiologisk ændring i tumorcelleproliferation. Dette blev yderligere bekræftet af et tilsvarende fald i Ki67 genekspression.

Målingerne af sporstof optagelse på dag 5 kan tolkes både som et mål for celledeling 5 dage efter behandlingsstart og som spredning status 3 dage efter anden injektion af TOP216. Følgelig én injektion af TOP216 inhiberede proliferation et sted mellem 1 og 3 dage, derefter tumorcellerne udvundet deres proliferation kapacitet. Denne information kan være nyttig, når du planlægger behandlingsplaner i prækliniske undersøgelser, og i fremtidige kliniske protokoller for at finde den optimale behandlingsplan.

På dag 5 efter behandlingsstart

18F-FDG optagelse var 19% lavere i forhold til baseline, mens optagelse af

18F-FLT var sammenlignelig med baseline. Optagelse af

18F-FDG blev derfor påvirket i længere tid end

18F-FLT-optagelse. Dette indikerer, at selvom celledeling efter 5 dage (3 dage efter 2

nd behandling) var sammenlignelig med baseline, biologiske virkninger af behandlingen stadig eksisterede og blev visualiseret ved

18F-FDG. Optagelse af

18F-FDG var signifikant lavere ved 6 timer efter start af behandling i forhold til baseline-optagelse. Men faldet på 21% fra et allerede lavt optag er ikke nemt visualiseres på PET /CT-billeder (figur 4).

Vores resultater som

18F-FLT var bedre

18F-FDG til vurdering af de tidlige reaktioner efter anti-cancer behandling er i overensstemmelse med andre undersøgelser [8], [11], [21]. Baseline niveauer af

18F-FDG optagelse i tumoren modellen var lave og kun omkring halvdelen af ​​de grundlæggende niveauer af

18F-FLT optagelse, som er i overensstemmelse med resultaterne af andre [11], [17]. Imidlertid har andre undersøgelser fundet en højere

18F-FDG optagelse i flere xenograftmodeller forhold til

18F-FLT optagelse [16], [19], [21]. Det er tidligere blevet vist, at det er vanskeligere at måle behandlingsrespons i tumorer med lav basislinie sporstofoptagelse, hvilket er i overensstemmelse med de i resultater fundet i denne undersøgelse [11], [21], [34].

resultaterne fra andre undersøgelser ved hjælp af

18F-FLT PET at vurdere tidlige reaktioner på anti-cancer behandling har været meget varierende, hvor der blev observeret reaktion på en histondeacetylaseinhibitor efter 4 dage [10], respons på cisplatin ses efter en dag [9], reaktion på cyclophosphamid og mTOR hæmning er tydeligt efter 2 dage [16] og ErbB-inhibitoren indledt et fald i

18F-FLT optagelse 2 dage efter behandlingsstart mens ingen respons blev observeret ved 6 og 24 timer [11]. Men sammenligning af studierne er vanskelig på grund af forskellige behandlings- og scanning tidsplaner og variable tumormodeller. Sammenlignet med andre undersøgelser fandt vi en stejl nedgang i

18F-FLT optagelse vurderet af PET og dette fald blev observeret meget tidligere (2 og 6 timer). Det er endnu ikke fastslået, om denne tidlige reaktion er sammensatte specifikke eller simpelthen på grund af vores protokol være den første til at vurdere respons så tidligt efter behandlingen.

Hvorvidt den tidlige ændring i

18F-FLT og

18F-FDG kan være en indikator for kliniske resultater er der er behov for endnu ukendte og yderligere undersøgelser undersøger tidlige ændringer og samlet overlevelse for at besvare dette spørgsmål.

Sammenligning af

18F-FLT optagelse og Ki67 genekspression viste en lignende ændring efter behandling med TOP216. Men Ki67 mRNA-niveauer ikke falde så meget som

18F-FLT optagelse 6 timer efter behandlingsstart. En mulig forklaring kunne være, at ændringer i enzymatisk aktivitet forekomme, før ændringer i mRNA-niveauer. Sammenhængen mellem Ki67 genekspression og

18F-FLT optagelse i vores undersøgelse er i overensstemmelse med andre undersøgelser at finde en stærk korrelation mellem Ki67 på proteinniveauet og

18F-FLT optagelse [8] – [11]. Vi fandt en signifikant fald i

18F-FLT optagelse så tidligt som 2 og 6 timer efter behandlingsstart; Men på trods af en markant lavere

18F-FLT optagelse på 6 timer, et fald i TK1 genekspression blev først tydelig på dag 1 efter behandlingsstart. TK1 enzymaktivitet er positivt korreleret med

18F-FLT optagelse [6], [7] og det har vist sig, at transkriptionelle mekanismer kan deltage i reguleringen af ​​TK1 aktivitet, hvor både TK1 protein og mRNA niveauer var relateret til et fald i

18F-FLT optagelse efter behandling med en histondeacetylaseinhibitor [10]. Tidlige ændringer i

18F-FLT optagelse uden ændringer i TK1 mRNA-niveauer sandsynligvis på grund af ændringer i protein niveauer, posttranslationelle protein modifikationer eller ændringer i ATP-niveauer [7], [10], [35]. ATP er påkrævet for TK1 aktivitet [36] og andre undersøgelser har ligeledes fundet en formindsket

18F-FLT-optagelse, trods et højt TK1 niveau, hvilket kunne forklares ved et lavt niveau af ATP [8].

Afslutningsvis fandt vi et fald på 52% i

18F-FLT optagelse så tidligt som 2 timer efter den første injektion af TOP216.

18F-FLT var bedre

18F-FDG som en noninvasiv redskab til at vurdere tidlige biologiske reaktioner til TOP216.