PLoS ONE: surt miljø fører til ROS-induceret MAPK signalering i Cancer Cells

Abstrakt

Tumor micromilieu viser ofte udtalt acidose tvinger celler til at tilpasse deres fænotype i retning af øget tumorigenese fremkaldt af ændrede cellulære signalering og transkriptionel regulering. I gaver undersøgelse mekanismer og potentielle konsekvenser af krydstale mellem ekstra- og intracellulær pH ​​(pH

e, pH

i) og mitogenaktiverede-protein-kinaser (ERK1 /2, p38) de blev analyseret. Data blev opnået primært i AT1 R-3327 prostatacarcinomceller, men princippet betydning blev bekræftet i 5 andre celletyper. Ekstracellulær acidose fører til en hurtig og vedvarende fald i pH

i parallelt med p38 phosphorylering i alle celletyper og ERK1 /2 phosphorylering i 3 af 6 celletyper. Endvidere blev p38 phosphorylering fremkaldt af tunge intracellulær lactacidosis ved normal pH

e. Inhibering af ERK1 /2 phosphorylering under acidose førte til nekrotisk celledød. blev opnået Ingen beviser for inddragelse af kinaser c-SRC, PKC, PKA, PI3K eller EGFR eller ændringer i celle volumen i acidose-induceret MAPK aktivering. vores data viser imidlertid, at acidose øger dannelsen af ​​reaktive oxygenarter (ROS), sandsynligvis stammer fra mitokondrier, der efterfølgende udløser MAPK phosphorylering. Scavenging af ROS forhindrede acidose-induceret MAPK phosphorylering henviser tilsætning af H

2O

2 forstærkede den. Endelig acidose øget phosphorylering af transkriptionsfaktoren CREB via p38, hvilket fører til øget transkriptionel aktivitet af en CRE-reporter selv 24 timer efter skift af cellerne tilbage til en normal miljømæssig miljø. Således kan en sur tumormikromiljøet inducerer en længerevarende p38-CREB-medited ændring i den transskriptionelle program, som kan opretholde den ændrede fænotype, selv når cellerne forlader tumoromgivelsen

Henvisning:. Riemann A, Schneider B , Ihling A, Nowak M, Sauvant C, Matthews O, et al. (2011) surt miljø fører til ROS-induceret MAPK Signaling i kræftceller. PLoS ONE 6 (7): e22445. doi: 10,1371 /journal.pone.0022445

Redaktør: Wael El-Rifai, Vanderbilt University Medical Center, USA

Modtaget: April 2, 2011; Accepteret: Juni 21, 2011; Udgivet: 26 Jul 2011

Copyright: © 2011 Riemann et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Denne undersøgelse blev støttet af Deutsche Krebshilfe (Tilskud 106774/106906), BMBF (Pronet-T3 Ta-04) og Wilhelm-Roux program Medical School, Universität Halle-Wittenberg. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

To mikromiljøer kan skelnes med hensyn til faste tumorer: (i) vævet miljø, hvor tumorcellerne opholde (patologisk væv miljø) og (ii) det lokale miljø skabt af tumorcellerne (tumormikromiljøet) , der kan generere en patologisk væv miljø for naboceller. Den patologiske væv miljø understøtter tumor fremme og tumor mikromiljø understøtter tumor progression [1] – [4]. Tumormikromiljøet er karakteriseret ved oxygenmangel (hypoksi), som følge af strukturelle og funktionelle abnormiteter i det vaskulære netværk [5], hvilket fører til utilstrækkelig perfusion af fast tumor [5], [6]. For at opretholde de energiefterspørgslen tumorceller skifte deres stofskifte til glycolyse, hvilket resulterer i øget glucose forbrug og udtalt mælkesyre-produktion. Dette fænomen kan endda forekomme i tumorer, når ilttilførslen er tilstrækkelig – kendt som Warburg effekten. For nylig dokumentation blev præsenteret hvilket viser, at splejsningsisoform ekspression af pyruvatkinase er nødvendig for det ændrede stofskifte, som giver en selektiv fordel for tumorceller [7]. Tilsammen disse funktioner udgør et komplekst netværk og skabe en metabolisk mikromiljø, bestående af hypoxi, lav glukose, høje laktat koncentrationer og ekstracellulær acidose. pH-værdier i de faste tumorer er i området fra 6,5 ​​til 6.8 [6]. Denne sure miljø er import til tumor fremme og progression.

Det er velkendt, at den metaboliske microenvironment konsekvenser tumor celle adfærd. For eksempel er effekten af ​​strålebehandling, fotodynamisk terapi og kemoterapeutika hæmmes af tumoren miljø [8], [9]. Vækst og migration egenskaber samt apoptose følsomhed kan påvirkes, også. Således fænotypen af ​​tumorceller – og dermed af tumoren selv – afhænger, udover den genetiske bestemmelse, om den metaboliske mikromiljø. Den “frø og jord” man fremsætter hypoteser selv postulerer, at efter erhvervelsen af ​​alle nødvendige kræft genetiske ændringer kun dannelsen af ​​tumor mikromiljø tillader tumorceller at vokse [10].

For en detaljeret mekanistisk forståelse er det vigtigt at dekonstruere denne mikromiljø og bestemme virkningerne af de forskellige parametre individuelt for at evaluere deres bidrag. At der er rigelig litteratur om hypoksi, er betydningen af ​​metabolisk acidose mindre godt undersøgt. vi for nylig viste, at metabolisk acidose per se forbedrer kemoresistens i prostata tumorceller under normoxiske og normoglykæmiske vej [9], [11], hvilket indikerer, at acidose er en vigtig microenvironmental determinant for tumor fænotype ændringer. Denne acidose-induceret stimulering af P-glycoprotein-afhængig kemoresistens afhænger MAP-kinaser, men det er uklart, hvordan aktivering af disse kinaser ved et ekstracellulært pH-reduktion forekommer [9]. Det kan afhænge af intracellulære ændringer i pH-homeostase og regulering som respons på ekstracellulære acidose. Desuden er der flere mulige signalveje, der kunne forbinde pH-ændringer MAPK-aktivering, fx kinaserne PKA, PKB, PKC, c-Src eller EGFR [12]. Dermed formålet med den foreliggende undersøgelse var at undersøge (i) pH-homeostase af tumorceller under metabolisk acidose af mikromiljøet, (ii) de mekanismer ERK1 /2 og p38 phosphorylering under disse betingelser og (iii) eventuel relation mellem disse to processer samt konsekvenserne af at påvirke disse veje.

Materialer og metoder

Cell kultur

sublinie AT1 af rotte R-3327 Dunning prostata carcinom blev brugt som beskrevet før [9]. Celler blev dyrket i RPMI medium suppleret med 10% føtalt kalveserum (FCS) ved 37 ° C under en fugtig 5% CO

2 atmosfære og sub dyrkede to gange om ugen. LS513 celler (American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; CRL-2134) blev dyrket under de samme betingelser som AT1 celler. OK celler (normale epitelceller fra renal proximal tubulus af opossum nyre) [13] og NCI-H358-celler (human bronchioalveolar karcinom, American Type Culture Collection, Rockville, MD, USA; CRL-5807) blev dyrket i DMEM medium suppleret med 10% FCS, MDCK-C7-celler (normale renale samlekanal epitelceller af hunde) [14] i MEM-medium suppleret med 10% FCS og CHO-celler (immortaliserede ovarieceller fra kinesisk hamster) [15] i Hams F-12 medium suppleret med 10% FCS. For alle eksperimenter blev celler dyrket i petriskåle (Western blot) eller dækglas (måling af pH

i) og overført til medium uden yderligere FCS tilskud i 24 timer. Kontrolceller blev eksponeret for bicarbonat-HEPES pufret Ringer-opløsning indstillet til pH 7,4. Intracellulær acidose blev induceret erstatte 40 mM NaCl med 40 mM mælkesyre og reduktion af chlorid ved helt at erstatte NaCl ved natriumgluconat (7,4 mM resterende chlorid). Ekstracellulær acidose (pH 6,6) blev påført ved anvendelse af bicarbonat-MES (morpholinoethansulfonsyre syre) pufret Ringer-opløsning pH-justering til 6,6. Bufferen kapacitet (β) er 5,9 mmol /lxΔpH for bikarbonat-HEPES bufferet Ringer opløsning ved pH 7,4 og 3,9 mmol /lxΔpH for bikarbonat-MES bufferet Ringer løsning.

Eksperimentel setup

efter serum udtømning i 24 timer blev cellerne inkuberet med et af de ovennævnte buffere (1 ml) i op til 3 timer. Alle inhibitorer eller aktivatorer anvendte sattes i løbet af denne inkubationsperiode.

Cytosolisk pH

Cytosoliske pH af enkeltceller blev bestemt ved anvendelse af pH-følsomt farvestof BCECF (2 ‘, 7’-bis- ( 2-carboxyethyl) -5- (and-6) -carboxyfluorescein, acetoxymethyl ester, Invitrogen, Paisley, UK) som beskrevet før [16], [17]. Kort fortalt blev celler inkuberet med Ringer-opløsning indeholdende 5 uM BCECF-AM i 15 minutter. Derefter blev dækglas skyllet 2 gange med overhældning løsning for at fjerne overskuddet af farvestoffet og overføres til den fase af en omvendt Axiovert 100 TV mikroskop (Zeiss, Oberkochen, Tyskland). De excitationsbølgelængder var 450 nm /490 nm, udsendte lys blev målt gennem et bandpass-filter (515-565 nm). Købet datahastighed var en fluorescensintensitet forholdet hver 10 s. Efter baggrund subtraktion, blev fluorescens nøgletal intensitet beregnes. pH-kalibrering blev udført efter hvert forsøg ved nigericin (Sigma, St. Louis, USA) teknik [18], [19] under anvendelse af en to-punkts kalibrering (pH 6,8 og 7,5). Kalibreringsopløsningerne indeholdt 132 mM KCl og 1 mM CaCl

2, 1 mM MgCl

2, 10 mM HEPES og 10 pM nigericin.

Cell volumen

Effekten af ​​acidose på celle volumen blev bestemt elektronisk med en Casy celletæller (Innovatis, Reutlingen, Tyskland). Derfor blev celler inkuberet som ovenfor nævnt, løsgøres ved trypsinering og cellevolumen og levedygtighed blev målt efter 10 min eller 3 timer i de respektive Ringer løsninger.

Western blot-

Western blotting blev udført ifølge standardprotokoller. Cellerne blev lyseret (0,1% Triton X-100 i PBS, protease inhibitor cocktail, 37 mg /l natriumorthovanadat eller 150 mM NaCl, 10 mM Tris pH 7,4, 1% Nonidet P-40, 0,1% SDS, 1% natriumdeoxycholat, 0,1% Triton X-100, 1 mM EDTA, protease inhibitor cocktail, 184 mg /l natriumorthovanadat), celleprotein bestemt ved BCA-methode (BC assayreagenser fra Uptima), adskilt ved SDS-PAGE og overført til en nitrocellulosemembran . Efterfølgende blev membranerne inkuberet med antistoffer specifikke for ERK1 /2, p38, MKK3 /6; phospho-ERK1 /2, phospho-p38, phospho-MKK3 /6, CREB og phospho-CREB (1:1000, Cell Signalling). Det bundne primære antistof blev visualiseret under anvendelse af peberrodsperoxidasekonjugeret sekundære antistoffer og ECL-systemet (Pierce /Thermo Fisher Scientific) med Molecular Imager ChemiDoc XRS System (Biorad, Munchen, Tyskland). Kvantitativ analyse blev udført med Mængde One-software (Biorad).

CRE-SEAP reportergenassay

Transaktivering blev vurderet af Mercury ™ Pathway Profilering reportergenassay system fra Ciontech Inc. hjælp sekretorisk alkalisk phosphatase (SEAP) under kontrol af definerede cis-regulerende responselementer (CRE) som reporter, i det væsentlige som beskrevet tidligere [20], [21]. Kort fortalt blev cellerne transficeret med et PCRE-SEAP-konstruktioner eller tomme vektorer. SEAP-aktivitet i medierne blev bestemt med AttoPhos® System fra Promega (Mannheim, Tyskland) og normaliseret til transfektion kontrol (ß-galactosidase).

LDH frigivelse

LDH aktivitet i medierne og i cellelysater blev målt ved hjælp af standard-protokol [22] tilpasset lavere skala (200 pi) i en flere brønde læser (Infinite, Tecan, Berlin).

Caspase-3-aktivitet

Celler blev vasket en gang med PBS-buffer (4 ° C) og inkuberet med 100 pi cellelysis puffer (10 mM TRIS, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0,01% Triton X-100, pH 7,5) i 10 minutter på is, høstet, og centrifugeret ved 16000 g i 10 minutter ved 4 ° C. 60 pi af supernatanten blev inkuberet med 65 pi reaktionsbuffer (20 mM PIPES, 4 mM EDTA, 0,2% CHAPS, 10 mM DTT, pH 7,4) indeholdende 42 uM DEVD-AFC (slutkoncentration) ved 37 ° C, og fluorescens af det spaltede produkt, 7-amino-4-trifluormethylcoumarin (AFC), blev målt ved 400 nm excitation og 505 nm emission frekvensbånd med en flere brønde tæller (Infinite, Tecan, Berlin). Kløvede AFC blev kvantificeret ved en kalibreringskurve under anvendelse af kendte AFC-koncentrationer. Proteinindhold blev bestemt med bicinchoninsyre-assay (Interchim, Montluçon, Frankrig) under anvendelse af bovint serumalbumin som standard.

Bestemmelse af ekstracellulært pH, glucose og lactat

pH blev målt med en blodgasanalysator (ABL5, Radiometer, København, Danmark). Til bestemmelse af koncentrationen af ​​glucose blev glucose (HK) assaykit fra Sigma (G3293) anvendt (2 eller 5 pi prøve henholdsvis plus 200 pi kit) ifølge producentens instruktioner. Lactat blev bestemt under anvendelse lactat reagens (Trinity) ifølge fabrikantens instruktioner (10 pi prøve plus 100 pi kit). Hvert forsøg blev udført mindst tredobbelt.

ROS-dannelse

Dannelse af reaktive oxygenarter (ROS) blev vurderet med det fluorescerende farvestof DCFDA-AM (Molecular Probes, Leiden, Holland), som reagerer med en stigning i fluorescens i nærvær af H

2O

2, når esterbindingen er blevet spaltet af cellulære esteraser. Celler blev podet i 24-brønds-plader og inkuberet i 30 minutter med farvestof efter de angivne behandlinger. Efterfølgende fluorescens (excitation 485 nm; emission 535 nm) blev målt ved anvendelse af en flere brønde tæller (Infinite, Tecan, Berlin, Tyskland). Derudover tomme værdier uden celler og tomme værdier uden farvestof blev bestemmes og trækkes. Forøgelsen af ​​fluorescens over blank værdi udtrykt pr mg protein blev anvendt som et mål for ROS-dannelse.

Bestemmelse af mitokondrie aktivitet

For at vurdere mitokondrie-aktivitet, vi bestemt ophobning af rhodamin 123 efter udsættelse for pH 7,4 eller pH 6,6. Efter 3 timers udsættelse blev cellerne inkuberet i 20 min med 0,1 pM rhodamin 123 i HEPES-Ringer-opløsning og i nærvær af 20 uM CCCP eller 2 pM nigericin [23], [24]. Ved afslutningen blev cellerne lyseret med 0,1% Triton X-100 og cellulær fluorescens bestemmes ved anvendelse af en flere brønde tæller (Infinite, Tecan, Berlin). Mitokondrie optagelse af rhodamin 123 forhindres i tilstedeværelse af CCCP fordi Ψ

m kollapser. Derimod mitokondriel optagelse af rhodamin 123 er maksimal i nærvær af nigericin, hvilket kollapser pH-gradienten tværs den indre mitokondrielle membran. Som følge heraf hele energi fra elektrontransportkæden transformeres i Ψ

m. Således optagelsen af ​​rhodamin 123 i nærvær af nigericin minus optagelse af rhodamin 123 i nærvær af CCCP repræsenterer et groft estimat af mitokondriel aktivitet og eliminerer eventuelle ikke-specifikke virkninger. Optagelse af rhodamin 123 blev kalibreret ved hjælp af lysis buffer indeholdende kendte koncentrationer af rhodamin 123.

Materialer

Hvis ikke andet er angivet, kemikalier var fra Sigma-Aldrich, München, Tyskland.

Dataanalyse

data er præsenteret som gennemsnit ± SEM. For alle eksperimenter, N lig med antallet af dyrkningsplader eller celler, der anvendes til at udføre målingerne, hvis ikke andet er opgivet. Alle eksperimenter blev udført med mindst to passager. Statistisk signifikans blev bestemt ved uparret t-test eller ANOVA som passende. Forskelle blev betragtet som statistisk signifikant, når P. 0,05

Resultater

Intracellulær pH ​​efter ekstracellulær acidose

Fig. 1A viser den intracellulære pH af de forskellige celletyper. Sænkning ekstracellulære pH altid førte til et fald i pH

i, omend graden af ​​denne reduktion afveg stærkt mellem cellelinierne. Under kontrolbetingelser (pH 7,4) den intracellulære pH var altid lavere end i det ekstracellulære rum. , Under acidose (pH 6,6) den intracellulære pH var dog højere i de fleste cellelinjer. Denne omvendte pH-gradient er blevet beskrevet tidligere for massive tumorer

in vivo

[6], som angiver, at den anvendte model i den foreliggende undersøgelse ligner

in vivo

situationen korrekt. Selvom den intracellulære pH i CHO og H358 er faldet til under den ekstracellulære pH der er indikation for en udtalt netto proton ekstrudering. Fra termodynamiske overvejelser i celler uden proton ekstrudere (forudsat et membranpotentiale på -40 mV) den intracellulære pH ville være ca. 0,65 enheder lavere i forhold til den ekstracellulære pH. I forsøgene (pH

e 6.6) en pH-værdi

i af ~6.0 ville forventes fra passiv fordeling. Det er klart, CHO og H358 celler ekstrudere protoner aktivt mod den passive ligevægt selvom deres kapacitet synes at være noget mindre end i de andre cellelinjer.

(A) pH

i målt under kontrolbetingelser (pH 7,4 ) og under ekstracellulær acidose (pH 6,6) (N = 3-7). (B) pH-gradient i AT1 celler under kontrol (pH 7,4) og surt (pH 6,6) betingelser for to forskellige tidspunkter; cirkel: pH

e, firkantet: pH

jeg

Ændringen af ​​det intracellulære pH følger hurtigt den ekstracellulære acidose og var stabil i flere timer.. For eksempel i AT1 celler intracellulære pH (pH

i) hurtigt faldt fra pH 7,22 ± 0,08 til pH 6,75 ± 0,09 inden for 10 min (fig. 1B). Denne pH-ændring blev opretholdt i løbet af 3 timer (fig. 1B), men reversible, når du skifter tilbage til en fysiologisk pH

e (til regulering af pH-homeostase i AT1 celler se fig. S1). Faldet i pH

e i 3 h inkubation resultater fra omfattende dannelse af mælkesyre (Warburg effekt, fig. S2).

acidose-induceret MAPK-aktivering i forskellige celletyper

udsætter celler til moderat ekstracellulær acidose fører til en markant aktivering af ERK1 /2-og p38 MAP-kinaser. Fig. 2A viser phosphorylering af begge kinaser efter inkubation AT1-celler i tre timer ved en pH på 6,6. Analyse af tidsforløbet viser, at phosphorylering allerede blev observeret efter 5 minutter og varede op til 3 timer (fig. 2B). Virkningen på p38-aktivering blev set i et bredt spektrum af forskellige tumor eller normalt væv cellelinier (fig. 2C). Disse fund indikerer, at p38-phosphorylering ved acidose øges i forskellige celler, uanset om afledt af tumor eller normalt væv, der peger på en universel mekanisme af stress-induceret signalering. Derimod blev acidose-induceret ERK1 /2-aktivering ikke observeret i alle celletyper undersøgt og var ikke relateret til tumorigeniciteten af ​​cellerne (fig. 2C), selv om intracellulær pH ​​faldt i alle cellelinjer. Således ændringer i pH

i synes ikke at være en universel udløser acidose-induceret ERK1 /2 phosphorylering. For både MAPK nogen kvantitativ korrelation mellem pH

I eller ændringer i intracellulær pH ​​og p38 eller ERK1 /2 phosphorylering for de forskellige celletyper blev observeret (Fig. S3). Tilsammen disse resultater førte til den konklusion, at bulke intracellulær pH ​​eller ændringer i pH

jeg er ikke de vigtigste regulatorer til ERK1 /2 fosforylering induceret af ekstracellulær acidose men tjene som universel udløser for p38 phosphorylering. Da de vigtigste mekanismer (intracellulær forsuring, p38 fosforylering) blev observeret i AT1 celler yderligere forsøg blev udført med denne særlige celletype.

(A) Typisk western blot for phosphoryleret og samlet protein af ERK1 /2 og p38 i AT1 celler efter en inkubationsperiode på 3 timer i enten pH 7,4 eller pH 6,6. (B) Tidsforløb for acidose-induceret ERK1 /2 og p38-phosphorylering i AT1 celler. Værdier er phosphoryleret protein divideret med den samlede protein, er 180 min HEPES-Ringer pH 7,4 defineret som 100%. (N = 3-10). (C) Virkninger af sure betingelser for ERK1 /2 og p38 phosphorylering præsenteres som% af kontrol (pH 7,4) i forskellige cellelinier. (N = 5-12); (*) P. 0,05

Effekt af acidose på cellernes levedygtighed

For at vurdere forskellige ordninger for celledød proteinindholdet pr parabol (samlet cellelevedygtighed), induktion af apoptose (caspase-3-aktivitet) og nekrose (LDH-frigivelse) blev analyseret. Acidose per se fremkaldte ingen signifikant ændring i celleoverlevelse (fig. 3). Men når ERK /2-vejen blev hæmmet nekrotisk celledød steg markant, hvilket fører til et tab af celler. Caspase-3 aktivitet blev ikke påvirket, hvilket tyder på nogen ændring af apoptose sats. Inhibering af p38-vejen var næsten uden virkning. Disse data indikerer, at acidose-induceret ERK1 /2 phosphorylering aktiverer en rednings program forhindrer nekrotisk celledød. På nuværende tidspunkt har det komplette sæt af eksperimenter i denne serie kun udført hos AT1 celler. Af denne grund er det tilgængeligt, om trinnene acidose-induceret ERK1 /2-aktivering efterfulgt af nekrose sker i alle cellelinier som en generel mekanisme. Da nogle cellelinjer ikke viser en aktivering af ERK1 /2 ved acidose (fig. 2C) kan det være muligt, at ERK1 /2-afhængighed af cellelevedygtighed er mindst kvantitativt forskellig blandt forskellige cellelinjer. Her er der behov for yderligere forsøg.

(A) indhold Cell protein, (B) caspase-3-aktivitet (apoptose) og (C) LDH-frigivelse (nekrose) af AT1 celler efter 3 timer inkubering ved forskellige pH med eller uden inhibitorer af ERK1 /2 (U0126) eller p38 (SB203580) pathway (n = 12-18); (*) P. 0,05

Intracellulær forsuring og p38 fosforylering

Virkningen af ​​intracellulær forsuring under hæmning af bikarbonat transport med DIDS og /eller ekstra belastning med laktat på MAPK-aktivering var studerede. Ved en normal ekstracellulær pH ​​(7,4) enten isoleret inhibering af bicarbonat transport (200 uM DIDS) eller inkubering af cellerne med lactat (40 mM) resulterede i en ret svag forsuring med 0,1 pH-enheder (fig. 4A). Kombinationen af ​​begge behandlinger faldt pH markant med 0,3 enheder. Analyse MAPK-aktivering under disse betingelser viste, at eneste inhibering af bicarbonat transport med DIDS eller eksponering af AT1 celler til lactat ved fysiologisk ekstracellulære pH ikke var tilstrækkelig til at ændre p38 eller ERK1 /2 phosphorylering (fig. 4B), sandsynligvis fordi pH

Jeg genvinder meget hurtigt i nærvær af ekstracellulært lactat (fig. S1B). Samtidig tilsætning af DIDS og lactat resulterede i signifikant forøget p38-phosphorylering (fig. 4B). Disse data understøtter den hypotese, at masseændringer i intracellulær pH ​​medierer den stimulerende virkning af ekstracellulær acidose på p38, men ikke på ERK1 /2. ERK1 /2 fosforylering er stimuleret af en reduceret ekstracellulær pH, men ikke af reduceret intracellulær pH ​​(fig. 4B).

(A) Langtidsvirkninger (3 h) udsættelse for DIDS (200 um) og /eller tilsætning af 40 mM lactat (N = 14-56) på pH

i. pH-ændringer sammenlignet med kontrolgrupper betingelser (pH 7,4) (*) p 0,05. (B) Ratio af phosphoryleret MAPK /samlet protein som% af kontrol (pH 7,4); N = 3-7 for pERK; N = 4-9 for phospho-p38; (*) P. 0,05

acidose-induceret ERK1 /2 og p38 fosforylering er uafhængig af fosfataseaktivitet, men afhænger af MAPK kinaser MEK1 /2 og MKK3 /6, henholdsvis

Da øget fosforylering kunne enten være et resultat af øget kinase aktivitet eller af nedsat fosfatase sats indvirkning fosfatase hæmning på acidose-induceret MAPK aktivering blev undersøgt. Når tyrosin- eller theronine /serin-phosphataser blev inhiberet under anvendelse af enten orthovanadat (100 uM) eller ocadaic acid (100 nM) virkningen af ​​ekstracellulær acidose på ERK1 /2 og p38-phosphorylering var additiv (fig. S4). I alle eksperimenter pp38 uden phosphataseinhibitorer blev induceret ved faktor 3-4 (fig. S4 og S5) sammenlignelig med den, der findes i tidligere eksperimentelle serie (fig. 2C). Det er således usandsynligt, at virkningen af ​​acidose medieres af ændringer af phosphataseaktivitet. Et vigtigt skridt i ERK1 /2-aktivering er den opstrøms kinase MEK1 /2, som integrerer de fleste af de signalveje konvergerende på ERK1 /2 [12]. Når MEK1 /2 blev inhiberet af 10 pM U0126, blev baseline phosphorylering af ERK1 /2 reduceret betydeligt, og effekten af ​​acidose blev ophævet (fig. S5). U0126 forhindrede acidose-induceret ERK1 /2 phosphorylering selv i nærvær af de to phosphatase inhibitorer orthovanadat og ocadaic syre, hvilket indikerer, at MEK1 /2 er afgørende for effekten observeret. p38-aktivering blev ikke inhiberet af U0126 (fig. S5), men i løbet 3 timer acidose (pH 6,6) kinasen MKK3 /6, som er opstrøms for p38, blev phosphoryleret i et pH-afhængig måde (Fig. 5). Tilsammen vore data antyder, at acidose-inducerede virkninger på MAPK ikke afhænger af ændringer i phosphatase aktivitet, hvorimod MEK1 /2 er afgørende for ERK1 /2-aktivering og øget p38 phosphorylering skyldes øget aktivitet af MKK3 /6 under sure betingelser.

Værdier repræsenterer forholdet af phosphoryleret protein (pp38 eller pERK) divideret med totalt protein (p38, ERK). Disse værdier er derefter blevet normaliseret til forholdet mellem kontroleksperimenter ved pH 7,4. (*) P 0,05 versus pH 7,4. (N = 4).

acidose-induceret MAPK aktivering er ikke afhængig af EGFR, PKC, PKA, PI3K eller Src-familiekinaser

For at afsløre mulige signalveje fører fra ekstracellulær acidose til en aktivering af ERK1 /2 og p38, blev adskillige lovende mål analyseret ved at blokere dem med specifikke inhibitorer. Rolle epidermal vækstfaktor receptor (EGFR), protein kinase C (PKC), proteinkinase A (PKA), phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K) og Src-familien af ​​tyrosinkinaser blev undersøgt under anvendelse AG1478, Bisindolylmaleimide I (BIM), Rp-isomer, LY294002 og PP2 hhv. Alle disse kinaser kan spille en vigtig rolle i tumor promotion og progression. Imidlertid er ingen af ​​inhibitorerne viste en signifikant virkning på acidose-induceret ERK1 /2 eller p38-aktivering som vist i fig. S6 og S7, selvom maksimale koncentrationer blev brugt.

cAMP har et potentiale dobbelt effekt på MAPK signalering [12], [25]. Aktivering af PKA af cAMP kan føre til inhibering af MEK1 /2 og /eller Raf-1 (C-Raf). Men aktivering af EPAC af cAMP aktiverer B-Raf via Rap1. Anvendelse af membranen permeabel analoge dibutyryl-cAMP (db-cAMP, cAMP-clamp)

per se

førte til reduceret ERK1 /2, men ikke p38-phosphorylering (fig. S7). Derudover virkningen af ​​ekstracellulær acidose blev fuldstændig ophævet. Stimulering af endogen cAMP dannelse af forskolin (aktivator af adenylyl cyclaser) fremkaldte en lignende effekt som db-cAMP (fig. S7). Således ERK1 /2, men ikke p38 signalering er cAMP-følsomme og effekten er sandsynligvis medieret af PKA eventuelt via hæmning af C-Raf.

OGR1 er ikke afgørende for MAPK-phosphorylering i et surt mikromiljø

for at belyse mekanismen af ​​pH-sensing for MAPK-aktivering yderligere rolle G-protein-koblede receptorer, kunne fornemme ekstracellulær protoner /pH, er blevet undersøgt. Heraf har ovariecancer G-protein-koblet receptor 1 (OGR1) blevet vist at aktivere MAPK-vejen [26]. Der er ingen specifikke inhibitorer til OGR1 rådighed, men det har vist sig, at proton-induceret aktivering af ERK1 /2 ved OGR1 ophæves af pM kobber ionkoncentrationer. Selv om dette er ingen specifik inhibering det kan bruges til at forfalske hypotesen om OGR1 engagement. I nærvær af 10 uM CuCI

2 en stigning i ERK1 /2 og p38-phosphorylering blev set som blev yderligere forstærket af ekstracellulær acidose (fig. S8A). Således OGR1 betyder sandsynligvis ikke mægle effekten af ​​ekstracellulær acidose på MAPK signalering

En rolle for Na

+ /K

+ -.? ATPase i acidose-induceret ERK1 /2-aktivering

en anden mulig mekanisme for pH- “sensing” ville være Na

+ /K

+ – ATPase, et enzym, som inhiberes af acidose og kan inducere MAPK-aktivering enten via ændringer i cellulær elektrolyt homeostase eller ved signalering via EGFR [27], [28]. Fig. S8 viser, at acidose-induceret hæmning af Na

+ /K

+ – ATPase kan bidrage til ERK1 /2 phosphorylering i AT1 celler. Men da celle volumen ændringer, der er en del af den signaleringskaskade [29] var temmelig heterogene for de forskellige cellelinjer, argumenterer imod en afgørende rolle for acidose-induceret ERK1 /2 phosphorylering.

Virkningen af ​​ROS i acidose-induceret MAPK aktivering

da reaktive ilt arter (ROS) kan fungere som en intracellulær signalering molekyle [30], vi analyseret, om ROS produktionsændringer i ekstracellulær acidose. Eksponere celler til ekstracellulært acidose induceret ROS-dannelse (fig. 6A). For at skelne mellem virkningen af ​​ekstra- og intracellulære forsuring celler blev desuden inkuberet med laktat og DIDS ved normal ekstracellulære pH, hvor kombinationen af ​​begge stoffer havde størst indvirkning på den intracellulære pH (fig. 4A) og fremkaldte en betydelig stigning i ROS-dannelse (fig. 6B). Fjernende ROS med Tiron reducerede ROS niveau under kontrol tilstand (pH 7,4) såvel som under acidose (fig. 6A og B). DPI (diphenyleneiodonium chlorid), en inhibitor af flavoproteiner, såsom NO syntase eller NADPH oxidase, ikke reducere ROS-dannelse.

(A) ROS dannelse under ekstracellulær acidose med anvendelsen af ​​ROS skraldemanden Tiron, DPI eller rotenon (N = 9-12). (A) ROS-dannelse (målt ved DCF-DA fluorescens) under intracellulær acidose (induceret af lactat + DIDS, se figur 4A.) Med anvendelse af ROS skyllevæsker Tiron, DPI eller rotenon (N = 3). (C) Relativ mitokondriel aktivitet (målt ved rhodamin 123 akkumulation) ved kontrolbetingelser (pH 7,4) og under ekstracellulær acidose (pH 6,6); N = 12. (*) p. 0,05

Ved tilstedeværelse af rotenon, en inhibitor af mitokondriel kompleks I, blev ROS dannelse forbedret under sure, men ikke under kontrol betingelser (fig 6A og B. ), dvs. acidose stimulerer rotenon-induceret ROS-dannelse. Disse resultater er blevet bekræftet ved anvendelse mitokondrier-specifik fluorescens probe MitoSox. Med denne probe mitokondrie forøget ROS-dannelse i nærvær af rotenon til 236 ± 44% ved pH 7,4, men til 903 ± 219% ved pH 6,6 (n = 6; p 0,05), hvilket bekræfter en kraftig indvirkning af sure pH på ROS-produktion i mitokondrierne . Disse data udelukker mitochondrial reverse elektrontransport som en kilde til ROS men er indikativ for en forøget NADH /NAD

+ forhold som udløser [31]. Complex I producerer superoxid anion i nærværelse af NADH og denne generation forstærkes af rotenon og ΔpH tværs mitokondriemembranen. kunne ikke påvises en grov aktivering af mitokondrie-aktivitet (fig. 6C).

inkubere cellerne med H

2O

2, en forholdsvis stabil ROS molekyle, førte til en dosisafhængig aktivering fortrinsvis af p38 MAP-kinase (fig. 7B). ERK1 /2-phosphorylering blev også forøget. Inkubering af cellerne med Tiron som kan markant reducere ROS-dannelse (fig. 6A og B) hæmmede både p38 og ERK1 /2-aktivering (fig. 7A og B), der viser, at ROS-dannelse er opstrøms for MAPK-phosphorylering.