PLoS ONE: En Cancer Vaccinen inducerer Udvidelse af NY-ESO-1-specifik regulatorisk T-celler hos patienter med fremskreden Melanoma

Abstrakt

Kræft-vacciner er designet til at udvide tumor antigen-specifikke T-celler med effektorfunktion. De kan dog også uforvarende udvide regulatoriske T-celler (Treg), som i alvorlig grad kan hæmme kliniske effekt. For at løse denne mulighed, har vi udviklet et hidtil ukendt assay til påvisning af antigen-specifik Treg baseret på nedregulering af overfladen CD3 følgende TCR engagement, og anvendt denne metode til at screene for Treg specifikke for NY-ESO-1 tumorantigenet i melanomapatienter behandlet med /ISCOMATRIX

TM kræft-vaccine NY-ESO-1. Alle testede patienter havde Treg (CD25

lyse foxp3

+ CD127

neg) specifik for mindst ét ​​NY-ESO-1 epitop i blodet. Påfaldende, sammenligning med prøver før behandlingen viste, at mange af disse responser blev induceret eller forstærket ved vaccination. Den oftest opdaget reaktion var mod HLA-DP4-begrænset NY-ESO-1

157-170 epitop, som også genkendes af effektor T-celler. Især var funktionelle Treg specifikke for et HLA-DR-begrænset epitop i NY-ESO-1

115-132-peptidet også identificeret ved høj frekvens i tumorvæv, hvilket antyder, at NY-ESO-1-specifik Treg kan undertrykke lokal anti-tumor immunrespons. Sammen vores data leverer overbevisende dokumentation for evnen af ​​en kræft-vaccine til at udvide tumor antigen-specifik treg i fastsættelsen af ​​fremskreden kræft, en konstatering, der bør gives alvorlig overvejelse i udformningen af ​​fremtidige cancer vaccine kliniske forsøg.

Henvisning: Ebert LM, MacRaild SE, Zanker D, Davis ID, Cebon J, Chen W (2012) En Cancer Vaccinen inducerer Udvidelse af NY-ESO-1-specifik regulatorisk T-celler hos patienter med fremskreden melanom. PLoS ONE 7 (10): e48424. doi: 10,1371 /journal.pone.0048424

Redaktør: Derya Unutmaz, New York University, USA

Modtaget: Juni 25, 2012; Accepteret: September 25, 2012; Udgivet: 26 oktober, 2012 |

Copyright: © 2012 Ebert et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Dette arbejde blev støttet af Cancer Råd Victoria tilskud til LE (603103, 433.626), en National Health og Medical Research Council (NHMRC) projekttilskud til WC (433.608) og operationelle infrastruktur Støtte af den victorianske delstatsregeringen. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

cancervacciner lover godt i behandling af solide tumorer såsom melanom, og har været i fokus for omfattende præklinisk og klinisk afprøvning i de seneste år. På grund af sin usædvanlige immunogenicitet, har NY-ESO-1 vist sig som en af ​​de mest lovende mål i sådanne tilgange [1]. I løbet af de sidste mange år har vi gennemført en række kliniske forsøg i melanom patienter, der bruger en kræft-vaccine bestående af fuld længde rekombinant NY-ESO-1 protein formuleret med ISCOMATRIX

TM adjuvans (CSL Limited, Australien). Selv om denne vaccine havde potente anti-tumor effekt i prækliniske dyreforsøg [2] og viste lovende resultater i den indledende fase I studie [3], den ikke væsentlig forbedring kliniske resultat i melanom patienter i de efterfølgende forsøg [4] og manuskript som forberedelse). Desuden mens patienter med fuldt resektion (tidlige fase) sygdom udviklet stærke effektor T-celle (Teff) respons til NY-ESO-1 efter vaccination [3], [5], patienter med fremskreden modermærkekræft havde langt mindre robuste svar [4] .

Ligesom vores erfaring med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vaccine, har mange andre cancervacciner heller ikke fremkalde vigtig klinisk fordel, ofte på trods af induktion af tilsyneladende potent tumor antigen-specifik teff svar [6], [7]. Der er mange potentielle forklaringer på dette, men en, der har fået særlig opmærksomhed i de senere år centre rundt rolle CD4

+ CD25

+ foxp3

+ regulatoriske T-celler (Treg). Treg er afgørende for forebyggelse af autoimmunitet [8]. Men en voksende mængde af beviser understøtter konceptet, at Treg også kan blokere generation af effektive immunitet anti-tumor [9]. Det er derfor bydende nødvendigt, at kræft vaccine tilgange undgå at udvide disse celler.

Indtil for nylig havde beviser for anerkendelse af tumor antigener ved treg været knappe, og det var uklart, om eller ikke treg ville aktiveres og ekspandere i svar til vaccination mod tumorantigener. I de senere år er der imidlertid en række rapporter har identificeret Treg specifik for en række tumorantigener i human cancer, herunder NY-ESO-1, survivin, TRP-1, gp100, MAGE-A3, Melan-A, carcinoembryonisk Ag ( CEA), telomerase, HER2 /neu, WT-1, MUC-1 og papillomavirus-antigener E6 og E7 [10] – [16]. Tilstedeværelsen af ​​disse celler hos kræftpatienter rejser alvorlige bekymring for potentielle af cancervacciner at udvide ikke blot Teff men også treg. I hvilket omfang dette rent faktisk sker, men er dårligt forstået.

I den foreliggende undersøgelse har vi vurderet effekten af ​​vaccination med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM på hyppigheden af ​​NY- ESO-1-specifik treg i patienter med sen-fase melanom. Som de fleste treg ikke producerer cytokiner ved aktivering [17] – [19], er der i øjeblikket ingen egnet assay til rådighed for skærmen for antigen-specifikke treg. Vi har derfor udviklet en ny, systematisk tilgang, hvor antigen-specifik treg detekteres af nedregulering af overfladen T-celle receptor (TCR) /CD3-komplekser efter

in vitro

stimulering med et bibliotek af korte antigene peptider. Optimering af denne metode er for nylig blevet beskrevet [20]. Her har vi brugt denne metode til at screene for NY-ESO-1-specifik treg i melanom patienter, før og efter vaccination med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vaccine. Denne undersøgelse har gjort det muligt for os at få en hidtil uset forståelse af tumor antigen-specifikt treg i fastsættelsen af ​​fremskreden kræft, herunder deres funktion, placering, rækken af ​​epitoper anerkendt, og hvordan deres frekvens påvirkes af vaccination.

Resultater

en roman tilgang baseret på nedregulering af overfladen CD3 registrerer Teff og treg specifik for NY-ESO-1-peptider

for at screene for NY-ESO-1-specifik treg i en saglig måde, vi udviklet et assay baseret på det princip, at T-celler nedmodulere antallet af CD3 /TCR-komplekser på celleoverfladen efter bindingen af ​​dertil hørende antigen [21], [22]. Dette kan detekteres som en reduceret niveau af celleoverflade CD3-farvning ved flowcytometri. På grund af deres knaphed, NY-ESO-1-specifik kan næsten aldrig blive opdaget Teff direkte

ex vivo

i blodprøver ved hjælp standard (IFN-γ intracellulær cytokin farvning) metode, men i stedet kræve forudgående ekspansion

i vitro

. Indledende undersøgelser viste, at dette var også tilfældet for NY-ESO-1-specifik Treg påvist under anvendelse af CD3-nedregulering metode (upublicerede observationer). Følgelig patient PBMC blev dyrket med et panel af 28 delvist overlappende 18 aminosyre-peptider, som tilsammen spænder over hele sekvensen af ​​NY-ESO-1 [23], for at muliggøre udvidelse af NY-ESO-1-specifik Teff og Treg til påviselige frekvenser . Betingelser, herunder kultur tid, IL-2-koncentration og kilde til serum, blev optimeret til Treg ekspansion [20]. Efter 21d ekspansion blev kulturer restimuleres med individuelle 18mer peptider og niveauet af overfladen CD3 bestemt ved flowcytometri, sammenholdt med farvning for Treg markører.

Et eksempel på de opnåede resultater er vist i figur 1. disse data viser, at der kunne påvises en tydelig population af formodede treg i CD4

+ T-celle population ved co-farvning for CD25 og foxp3 (fig 1A, venstre). Inden for denne treg delmængde, en tydelig sub-population af CD3-lav (antigen-specifikke) celler var tydelig efter re-stimulation med peptid NY-ESO-1

157-174, men ikke NY-ESO-1

127 -144 eller i fravær af restimulering (fig 1A, øvre paneler). Omvendt kunne påvises en CD3-lav delpopulation i Teff delmængde efter re-stimulering med peptid NY-ESO-1

127-144, men ikke NY-ESO-1

157-174 (fig 1A, lavere paneler). Et resumé af resultaterne for denne patient ved hjælp af alle 28 peptider viser to forskellige Treg svar, inden for regioner NY-ESO-1

37-60 og NY-ESO-1

157-180 (Fig 1B), og en større teff svar, i regionen NY-ESO-1

127-144 (fig 1C).

CD3

. PBMC fra patient 113 blev dyrket med poolede NY-ESO-1 18mer peptider som beskrevet i

Methods

, efterfulgt af re-stimulation med de angivne individuelle peptider under dyrkning natten at tillade CD3-nedregulering. Celler blev farvet med antistoffer mod CD4, CD25, foxp3 og CD3 og analyseret ved flowcytometri. (

A

): et eksempel på farvningsmønstrene observeret, illustrerer gating af treg og Teff (på gated levedygtige CD4

+ T-celler) og nedregulering af CD3 inden for hver population. (

B

–

C

): En sammenfatning af de fundne i treg (B) og teff (C) populationer svar. Stiplede linjer angiver basisniveauet af CD3-low celler (nul peptid tilstand).

Vi søgte også at analysere cytokinproduktion profil af NY-ESO-1-specifik treg i fire patienter, hvis Treg ned -regulated CD3 som respons til NY-ESO-1-peptider, ved hjælp af intracellulær cytokin-farvning. CD3-low Treg produceret lav til ikke-detekterbare niveauer af IL-4, IL-10 og IL-17 i alle patienter. Imidlertid produktion af IFN-γ og TNF-α var variabel, med to patienter viser ubetydelig produktion af CD3-low Treg, og to patienter viser høje niveauer af produktion (fig S1). Udskillelsen af ​​pro-inflammatoriske cytokiner, såsom IFN-γ af Treg er tidligere blevet beskrevet [16], [24] – [26], og synes at være en unik egenskab ved Treg identificeret hos cancerpatienter. Men vores resultater viser, at denne egenskab er sporadisk, og kan ikke påberåbes for treg identifikation.

Celler identificeret af CD25

+ foxp3

+ fænotype har fænotypiske og funktionelle egenskaber treg

Både CD25 og foxp3 er kendt for at være forbigående induceret på Teff efter aktivering, hvilket betyder, at aktiverede Teff kan potentielt forveksles med treg [27] – [30]. I betragtning af den udvidede kultur periode anvendt (21d), er det usandsynligt, at cellerne er identificeret som CD4

+ CD25

+ foxp3

+ i vores kultur-system repræsenterer aktiveret Teff, da udtryk for foxp3, og i mindre omfang CD25, vender tilbage til baseline efter ~ 10 dage [12], [27], [28], [30]. Imidlertid er yderligere at påvise, at disse celler er faktisk Treg, kulturer blev co-farvet med et antistof mod CD127, som udtrykkes til reducerede niveauer på Treg sammenlignet med Teff [31], [32]. Figur 2A viser, at cellerne identificeret som Treg (CD4

+ CD25

+ foxp3

+) udtrykte næppe påviselige niveauer af CD127, mens celler identificeret som Teff (CD4

+ foxp3

-) udtrykt ensartet højt niveau. Endvidere, når hovedparten Treg var FACS-sorteret fra 21d kulturer (ifølge en CD4

+ CD25

+ CD127

– /low fænotype), disse celler inducerede et dosisafhængigt fald i proliferation af CD8

+ T-celler (fig 2B)

Patient PBMC blev dyrket til 21d med NY-ESO-1 18mer peptid (er) kendt fra indledende undersøgelser til at fremkalde en treg respons og derefter:. (

a

) analyseret for CD127-ekspression ved flowcytometri, gating på treg (CD4

+ CD25

+ foxp3

+) eller Teff (CD4

+ foxp3

-) som angivet. De viste resultater er repræsentative for tre eksperimenter med lignende resultater; eller (

B

): Treg blev renset ved sortering CD4

+ CD25

+ CD127

lave celler og testet for deres evne til at undertrykke proliferationen af ​​CFSE-mærket CD8

+ T-celler præ-stimuleret i 16 h med pladebundet anti-CD3. Grafen viser% suppression i forhold til kulturer udføres i fravær af tregs, mens flowcytometri histogrammer nedenfor illustrerer CFSE profiler opnået for responder-T-celler alene (venstre) eller ved 01:02 forholdet med Treg (højre). Data er repræsentative for tre uafhængige eksperimenter under anvendelse prøver fra tre forskellige individer. I (C), dyrket PBMC blev re-stimuleret med det relevante peptid og ekspression af LAP på overfladen af ​​tregs eller Teffs blev bestemt ved flowcytometri under CD3-lav (peptid-responsive) population til tre patienter.

Endelig har vi forsøgt at bestemme, om antigen-specifik aktivering af Treg medførte induceret ekspression af TGF-β latens-associeret peptid (LAP) på celleoverfladen. Induktion af LAP ekspression efter aktivering er en karakteristisk unik for Treg, og dette molekyle udtrykkes ikke på teff celler, selv efter aktivering [18], [33]. For direkte at sammenligne aktiverings-induceret LAP-ekspression på Treg og Teff identificerede vi tre patienter, hvor Treg og teff populationer både nedreguleret CD3 som reaktion på det samme peptid. PBMC fra disse patienter blev dyrket i 21d med peptid, restimuleres natten over og vurderet for CD3 nedregulering og overflade LAP ekspression. Som vist i figur 2C blev LAP klart fremkaldt på en sub-population af treg reagere på NY-ESO-1 peptid, som identificeret af CD3-lav fænotype. I modsætning hertil CD3-lav Teff reagerer på det samme peptid undladt at opregulere LAP.

Sammen ekspressionen af ​​en CD4

+ CD25

+ foxp3

+ CD127

-. fænotype kombineret med

in vitro

undertrykkende kapacitet og evnen til at inducere LAP udtryk antyder kraftigt, at de analyserede celler her er funktionelle treg stedet aktiveret Teff som midlertidigt har opreguleret foxp3 udtryk

nedregulering af CD3 ved treg er afhængig af peptidkoncentration

i denne undersøgelse er nedregulering af overfladen CD3 anvendes som en markør af antigen-specifik aktivering af tregs via TCR. Således ville omfanget af CD3 nedregulering forventes at være strengt afhængig peptidkoncentration. For at bekræfte dette, blev peptidtitrering undersøgelser udført under anvendelse af PBMC fra 4 forskellige patienter. For hver patient blev to peptider testet, der blev udvalgt på grundlag af foreløbige screeningsforsøg som værende i stand til at inducere en CD3 nedregulering respons ved 1 x 10

-4. Som vist i figur 3, var der en klar dosisafhængig sammenhæng mellem andelen af ​​CD3-low Treg og koncentrationen af ​​peptid anvendt til restimulering. Et antal af disse reaktioner kan titreres ned til 1 × 10

-7 peptid, som er sammenlignelig med flere tidligere beskrevne CD4

+ teff responser på NY-ESO-1-peptider [5], [34]. Det er også vigtigt at bemærke, at 18mer peptider anvendes her sandsynligvis ikke udgør den optimale epitop for T-celle genkendelse, i hvilket tilfælde svaret opdages, når peptidkoncentration bliver begrænsende kan være en betydelig undervurdering.

PBMC fra fire patienter blev dyrket i 21d med NY-ESO-1 18mer peptider og derefter re-stimuleret natten over med individuelle peptider ved de angivne koncentrationer. Andelen af ​​treg nedregulering CD3 som reaktion på peptid blev bestemt ved flowcytometri.

NY-ESO-1-specifik treg ofte påvises i blodet af sen-stadie melanom patienter og kan være udvidet med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vaccine

En kohorte af ni patienter med fremskreden modermærkekræft blev screenet for NY-ESO-1-specifikke treg, både før og 42 dage efter vaccination med NY -ESO-1 /ISCOMATRIX

TM. Resultaterne er opsummeret i figur 4A. Efter vaccination havde alle patienter Treg responser er specifikke for mindst én region af NY-ESO-1 protein; flere havde svar på to eller tre forskellige regioner. Påfaldende, en sammenligning med prøver før vaccination viste, at mange af disse responser blev induceret af vaccinen, som de var upåviselige før vaccination. Et eksempel på en sådan reaktion er vist i figur 4B. Desuden er nogle reaktioner, der var påviselige forud for vaccination syntes at blive styrket med vaccine (defineret som en 2-fold stigning i responsive celler efter vaccination, når de to prøver blev sammenlignet parallelt under identiske betingelser). For eksempel i Patient 120, hyppigheden af ​​Treg specifik til peptid NY-ESO-1

37-54 var 4,4% før vaccination, men 18,3% efter vaccination, og hyppigheden af ​​Treg specifik til peptid NY-ESO-1

79-96 var 3,3% før vaccination og 16,3% efter vaccination

(

a

):. for hver patient i kohorten, hver valideret treg svar opsummeres med en kasse. Reaktioner anses valideres, hvis de blev observeret i mindst to uafhængige kulturer, under anvendelse af to uafhængigt syntetiserede partier af peptid. Positionen af ​​æsken, viser hvor i NY-ESO-1 peptidsekvensen responsen blev lokaliseret. I tilfælde af at responser blev detekteret til to peptider hosliggende i rækkefølge, er dette vist som en enkelt reaktion spænder de to peptider. Skraverede felter angiver, at størrelsen af ​​responset var forøget mindst 2-fold i prøver efter vaccination sammenlignet med prøver forud for vaccination, når begge prøver blev testet parallelt under identiske betingelser. Faste felter angiver, at reaktionen kun var påviseligt i prøver indsamlet efter vaccination. Åbne kasser indikerer, at størrelsen af ​​responset var den samme før og efter vaccination. (

B

): Et eksempel på en reaktion, der blev induceret ved vaccination (patient 124) er vist. Treg blev gated på grundlag af CD25 og foxp3 ekspression og CD3 nedregulering blev vurderet efter restimulering med enten kontrol peptid eller det samme peptid anvendt til ekspansion (NY-ESO-1

85-102).

treg og Teff reagere på en identisk epitop i regionen NY-ESO-1

157-170

Figur 4A viser, at treg svar blev mest almindeligt set mod peptid NY- ESO-1

157-174, med tregs specifikke for denne 18mer peptid påvises i 5/9 patienter testet. Denne region indeholder en epitop (NY-ESO-1

157-170), som tidligere er karakteriseret for Teff [35], øge muligheden at Treg kunne reagere på den samme epitop. For at løse denne mulighed, to patienter (102 og 103) blev identificeret som havde reaktioner på NY-ESO-1

157-174 peptid i både Treg og teff delmængder, og evnen af ​​disse celler til at reagere på den offentliggjorte epitop (NY-ESO-1

157-170) eller forskellige trunkering eller udvidelse varianter, blev vurderet. Som vist i figur 5, såvel Treg (venstre paneler) og Teff (højre paneler) reagerede på NY-ESO-1

157-170 peptid. Trunkering af enten 1 eller 2 aa ud fra N-terminalen, eller 1 aa ud fra C-terminalen, havde lille indvirkning på disse reaktioner. Imidlertid viste begge populationer stærkt reduceret modtagelighed efter trunkering af 2 aa fra C-terminalen (peptid NY-ESO-1

157-168). Tilsvarende udvidelse af kernen sekvens ved 1 aa ved enten C eller N-terminalen også reduceret modtagelighed inden for begge populationer.

Patient PBMC blev dyrket i 21d med 18mer peptid NY-ESO-1

157- 174 og derefter igen stimuleret med de angivne korte HPLC-oprenset peptider enten med direkte til kulturen som sædvanligt (

A-D

) eller ved pulsering på BCL efterfulgt af vask (

E-F

). Efter inkubation natten over blev celler farvet og analyseret ved flowcytometri, gating på Treg (CD4

+ CD25

+ foxp3

+

A, C og E

) eller Teff (CD4

+ foxp3

–

B, D og F

). Peptider anvendes til re-stimulering var baseret på den offentliggjorte epitop NY-ESO-1

157-170, med enten trunkering (

A-B

) eller udvidelse (

C-D

) ved hver terminus. Grafer i

A-D

viser resultater opnået for Patientsikkerhed 102; lignende resultater blev også opnået for Patientsikkerhed 103. Grafer i

E-F

show betyde + SEM fra patienter 102 og 113; en stjerne indikerer AP værdi. 0,05 (t-test)

Den tidligere beskrevne NY-ESO-1 er blevet vist

157-170 epitop til at være begrænset af HLA-DP4 klasse II allel [35], og molekylær typning viste, at de testede i figur 5 patienter udtrykte HLA-DPB1 * 0401 molekyle. For at bekræfte at tregs også reageret på denne epitop når det blev præsenteret på HLA-DP4, et panel af EBV-transformerede B-cellelinjer (BCL) blev pulseret med NY-ESO-1

157-170 peptid, vasket og testet for evnen til at inducere CD3 nedregulering i Treg og teff celler (fig 5E-F). En BCL mangler DP4 udtryk (9902) undlod at inducere CD3 nedregulering i enten population, mens en BCL udtrykker HLA-DPB1 * 0401 (linje 9004) inducerede en signifikant respons i begge populationer. Således NY-ESO-1

157-170 peptid præsenteres for både Treg og Teff på HLA-DP4.

Tilsammen tyder disse resultater på, at den minimale sekvens af den tidligere beskrevne NY-ESO- 1

157-170 epitop [35] kunne revideres til NY-ESO-1

159-170, eller måske endda til NY-ESO-1

159-169, selv om netop dette peptid ikke blev testet i vores assays. Vigtigere, men de data viser, at Treg og Teff reagere på nøjagtig samme epitop, og i begge tilfælde, er denne reaktion begrænset af HLA-DP4.

NY-ESO-1-specifik treg er fremherskende inden tumorvæv

for at bestemme, om der kan påvises NY-ESO-1-specifik Treg i tumoren samt blodet, blev friske vævsprøver opnået fra patient 126 efter tre runder af vaccination med NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM og en enkelt celle suspension genereret. Den resulterende blanding af tumorceller og stromaceller, herunder TIL, blev dyrket i nærvær af højdosis IL-2, men uden tilsætning af nogen exogent peptid, antigen eller mitogen. Udvidet TIL blev stimuleret natten over med peptider NY-ESO-1

85-102 og NY-ESO-1

115-132 (begge inducerede reaktioner i perifert blod Treg fra denne patient) og vurderet for CD3 down- regulering. Desuden blev en prøve af tumoren digest analyseret ved flowcytometri før dyrkning, der viste, at 41,1% af CD4

+ T-celler i tumoren havde en Treg fænotype, der repræsenterer en tilnærmet 10-fold berigelse over frekvenser, i blod (ikke vist).

Peptide NY-ESO-1 mislykkedes

85-102 at stimulere nogen reproducerbare reaktioner fra enten treg eller Teff inden tIL. På den anden side, peptid NY-ESO-1

115-132 inducerede et let detekterbart respons ved teff celler i udvidet TIL (Fig 6A). Påfaldende er størrelsen af ​​reaktionen på det samme peptid var -4 gange højere i Treg befolkningen med 40% af Treg nedregulering CD3 som reaktion på dette peptid. For at demonstrere reproducerbarheden af ​​denne forskel blev tre uafhængige TIL-linjer genereret fra frosne alikvoter af de samme tumorprøver, og hver linie testet 1-3 gange. I hver analyse var andelen af ​​celler, der reagerer på NY-ESO-1

115-132-peptid var altid højere i Treg befolkning end Teff befolkningen, med en gennemsnitlig fold forskel på 3,1 (figur 6B). Præ-inkubation med et blokerende antistof til HLA-DR næsten fuldstændigt hæmmede både de Treg og teff reaktioner på dette peptid, hvorimod blokerende antistoffer mod HLA-DP eller HLA-DQ havde ingen virkning, hvilket indikerer, at svar inden begge populationer var begrænset af HLA -DR (fig 6C).

Tumor væv blev opnået fra patient 126 og TIL-linjer genereret som beskrevet i

Metoder

. (

A-B

): Celler blev behandlet natten over med peptid NY-ESO-1

115-132 eller kontrol-peptid, og derefter farves og analyseret ved flowcytometri, gating på Treg (CD4

+ CD25

+ foxp3

+) eller Teff (CD4

+ foxp3

-) som angivet. Repræsentant flowcytometri dot plots (A) viser gating af treg og Teff, og CD3 nedregulering respons observeret i hver population efter re-stimulering, mens (B) viser en oversigt over opnåede resultater i fem forsøg, hver ved hjælp af en af de tre forskellige tIL-linjer genereret. (

C

): Effekten af ​​blokerende antistoffer mod HLA-DR, HLA-DP eller HLA-DQ på respons på peptid NY-ESO-1

115-132 inden treg (til venstre) og Teff (til højre) populationer. Lignende resultater blev opnået i et andet eksperiment. (

C

): TIL blev stimuleret natten over med NY-ESO-1

115-132 peptid og derefter peptidspecifik (CD3

lo) og ikke-specifikke (CD3

hi) Treg (CD4

+ CD127

lo CD25

hi) blev oprenset ved cellesortering og testet for deres evne til at undertrykke proliferationen af ​​CFSE-mærket CD8

+ T-celler forud-stimulerede i 4 timer med anti- CD3 i de angivne treg: responder-forhold. Som sammenligning blev Treg også sorteret fra den tidligere frosne PBMC opnået fra en rask donor. Lignende resultater blev observeret i et andet eksperiment, selv om højere Treg:. Responder nøgletal skulle se undertrykkelse

I figur 2, viste vi, at hovedparten treg isoleret fra 21-dages kulturer undertrykte spredning af CD8

+ T-celler. Det var imidlertid også af interesse at bekræfte, at NY-ESO-1-specifik Treg havde en lignende aktivitet. Ekspanderet TIL fra patient 126 stimuleret med NY-ESO-1

115-132 peptid natten over for at inducere CD3 nedregulering og peptid-specifikke Treg blev efterfølgende sorteret på basis af en CD4

+ CD25

+ CD127

– CD3

lav fænotype og testet i en undertrykkelse assay. Disse celler undertrykte proliferation af anti-CD3-stimulerede CD8

+ T-celler fra en rask donor i et tilsvarende omfang som bulk-Treg isoleret fra en rask donor (figur 6D). Interessant, CD3

hi tregs sorteres fra TIL linje (dvs. treg som havde undladt at reagere på peptid stimulation) også undertrykt CD8

+ T-celle proliferation, hvilket tyder på, at de seneste antigen stimulation ikke var afgørende for erhvervelse af suppressor funktion af disse celler. Muligvis blev tilstedeværelsen af ​​tumorceller under etableringen af ​​TIL linje aktiveret tregs specifikke for en bred vifte af tumor antigene epitoper, og dette aktiverede tilstand opretholdes under ekspansion, således at Treg med en række antigenspecificiteter at udøve suppressiv aktivitet.

Sammen viser disse resultater, at tumorvæv fra patient 126 indeholder en fremtrædende population af treg specifikke for et HLA-DR-begrænset epitop i NY-ESO-1

115-132 peptid. Desuden kan treg specifikke for denne epitop undertrykke CD8

+ T-celle proliferation og derfor er fuldt funktionel. Immunhistokemi farvning af tumorvævet afslørede, at tumorceller stadig udtrykte høje niveauer af NY-ESO-1 på dette tidspunkt (data ikke vist), hvilket antyder, at væv-resident NY-ESO-1-specifik Treg kan aktiveres lokalt.

diskussion

i den foreliggende undersøgelse har vi anvendt en hidtil ukendt fremgangsmåde, der tillader objektiv identifikation af Treg specifikke for epitopen inden for en given tumor antigen. Vi viser, at NY-ESO-1-specifik treg er meget almindelige i blodet hos patienter med sen-fase melanom, som de var påviselige i 9/9 patienter testet. Desuden er der i seks af disse ni patienter, NY-ESO-1 /ISCOMATRIX

TM vaccine enten induceret mindst en ny reaktion, der ikke kunne påvises før vaccination eller boostet de allerede eksisterende reaktioner.

på grund af knapheden på tumor antigenspecifikke T-celler (herunder Treg) i blodet, var det nødvendigt at udvide disse celler in vitro med antigen. Denne kultur trin kan have fremkaldt en midlertidig opregulering af foxp3 og CD25 på teff celler, som er blevet rapporteret tidligere [27] – [30], og disse celler kunne teoretisk have været forvekslet med treg. Men flere linjer af beviser tyder stærkt på, at dette ikke er tilfældet. Først, disse celler undertrykte proliferationen af ​​CD8

+ T-celler, når de vurderes som enten en bulk population (figur 2) eller isoleres ifølge NY-ESO-1 specificitet (figur 6). For det andet, de udtrykte lav til ikke målbart niveauer af CD127 udtryk. For det tredje, de op-reguleret LAP ved aktivering med beslægtet peptid. Endelig Treg og teff befolkninger i individuelle patienter undertiden anerkendt distinkte epitoper (som i den i figur 1 eksempel), der beviser, at disse er adskilte populationer, og Treg blev ikke blot genereres ved omdannelse fra Teff genkender den samme epitop. Vores konklusion, at CD4

+ CD25

+ foxp3

+ celler til stede i 21-dages kulturer er Treg og ikke aktiveret Teff er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser, der viser, at erhvervelsen af ​​disse markører ved Teff er midlertidig, og udtryk er i vid udstrækning tabt ved dag 10 kultur [12], [27], [28], [30]. Notatet har to tidligere undersøgelser også identificeret NY-ESO-1-specifik treg i blodet hos melanom patienter ved hjælp af alternative metoder, yderligere støtte vores resultater [12], [24].

Treg respons påvist i vores undersøgelse spænde en stor del af NY-ESO-1 protein. Selvom detaljeret karakterisering af hver af disse epitoper er uden for rammerne af denne undersøgelse, kunne vi bekræfte, at de ofte opdaget treg svar på 18mer peptid NY-ESO-1

157-174 skyldtes anerkendelse af den tidligere beskrevne DP4- begrænset immunodominant NY-ESO-1

157-170 epitop. Vi har således påvist, at Treg og Teff kan genkende præcis samme minimale epitop præsenteres på samme HLA allel. Dette vil til gengæld tyder på, at den menneskelige Treg og Teff deler i det mindste delvist overlappende TCR repertoirer, hvilket er i overensstemmelse med tidligere undersøgelser i mennesker [36] og mus [37]. På den anden side, er en af ​​de Treg responser detekterede her (i regionen NY-ESO-1

49-72) ikke indeholder nogen tidligere beskrevne teff epitoper (se https://www.cancerimmunity.org/peptidedatabase) og denne respons blev ikke detekteret i Teff befolkning i denne patient (data ikke vist). Således kan denne specificitet være unikke for treg befolkning.

Det er stadig et spørgsmål om forhandling om treg mægle deres undertrykkende virkninger primært i de sekundære lymfoide organer, på lokale steder i periferien (såsom tumorvæv) eller, mere sandsynligt, en kombination af begge. Af praktiske årsager har vi vurderet NY-ESO-1-specifikke Treg responser overvejende i blodet, som bør afspejle cellerne cirkulerer gennem sekundære lymfoide organer. Men for Patient 126, kunne vi desuden få friske vævsprøver og viser, at Treg specifikke for et HLA-DR-begrænset epitop i peptid NY-ESO-1

115-132 ikke var kun til stede i blodet, men var også til stede ved højfrekvens i tumoren. Disse NY-ESO-1

115-132-specifikke Treg var fuldt funktionelle, da de undertrykte CD8

+ T-celleproliferation. I betragtning af at patient 126 udtrykker HLA-DRB1 * 04-allelen, denne reaktion sandsynligvis vil blive rettet mod den tidligere beskrevne DR4-begrænset NY-ESO-1

121-130 epitop [34].