PLoS ONE: Multi-Purpose Utility af cirkulerende plasma-DNA Testing hos patienter med fremskreden Cancers

Abstrakt

Tumor genomisk ustabilitet og selektiv behandling pres resulterer i klonal sygdommens udvikling; molekylær stratificering for molekylært målrettet lægemiddeladministration kræver gentagen adgang til tumor-DNA. Vi antager, at cirkulerende plasma-DNA (cpDNA) i avancerede kræftpatienter er i vid udstrækning stammer fra tumor, har prognostisk nytte, og kan anvendes til multiplex tumor mutation sekventering når gentage biopsi ikke er mulig. Vi udnyttede den Sequenom MassArray System og OncoCarta panel til somatisk mutation profilering. Matchet prøver, erhvervet fra den samme patient, men på forskellige tidspunkter blev evalueret; disse omfattede formalin-fikseret paraffin-indstøbt (FFPE) arkivering tumorvæv (primær og /eller metastatisk) og cpDNA. Muligheden, følsomhed og specificitet af denne high-throughput, blev multiplex mutation afsløring tilgang testet udnytte prøver erhvervet fra 105 patienter med solide tumorer, der er nævnt for deltagelse i fase I forsøg med molekylært målrettede lægemidler. Medianen cpDNA koncentration var 17 ng /ml (interval: 0,5 til 1600); dette var 3 gange højere end hos raske frivillige. Desuden højere cpDNA koncentrationer forbundet med dårligere samlet overlevelse; der var en samlet overlevelse (OS) hazard ratio på 2,4 (95% CI 1,4, 4,2) for hver 10-dobling i cpDNA koncentration og i multivariate analyser, cpDNA koncentration, albumin, og performance status forblev uafhængige prædiktorer af OS. Disse data antyder, at plasma-DNA i disse cancerpatienter stort set er afledt af tumoren. Vi observerede også høj afsløring konkordans for kritisk ‘hot-spot’ mutationer (

KRAS

,

BRAF

,

PIK3CA

) i matchede cpDNA og arkivering tumor væv, og vigtige forskelle mellem arkivering tumor og cpDNA. Denne multiplex-sekventering assay kan anvendes til at detektere somatiske mutationer fra plasma i patienter med fremskreden cancer, når det er sikkert gentagelse tumor biopsi ikke er mulig og genomisk analyse af arkivering tumor skønnes utilstrækkelige. Samlet set cirkulerende nukleinsyre biomarkør undersøgelser har klinisk vigtige multi-purpose nytte i avancerede kræftpatienter og yderligere undersøgelser for at forfølge deres inkorporering i standarden for pleje er berettiget

Henvisning:. Perkins G, Yap TA, pave L, Cassidy AM, Dukes JP, Riisnaes R, et al. (2012) Multi-Purpose Utility af cirkulerende plasma-DNA Testing hos patienter med fremskreden kræft. PLoS ONE 7 (11): e47020. doi: 10,1371 /journal.pone.0047020

Redaktør: Jose Luis Perez-Gracia, Universitetsklinikken i Navarra, Spanien

Modtaget: 15. maj 2012; Accepteret: September 7, 2012; Udgivet: November 7, 2012 |

Copyright: © 2012 Perkins et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. Drug Udvikling enhed for Royal Marsden NHS Foundation Trust og The Institute of Cancer Research understøttes delvist af et program bevilling fra Cancer Research UK. Der blev også leveret af Experimental Cancer Medicine Center (til The Institute of Cancer Research), og National Institute for Health Research Biomedical Research Centre (sammen til Royal Marsden NHS Foundation Trust og The Institute of Cancer Research). GP blev støttet af en bevilling fra det franske nationale institut for Cancer (Institut National du Cancer, Inca, Frankrig). TY er modtager af 2011 Scott Minerd Prostata Cancer Foundation Young Investigator Award. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

udviklingen af ​​kræft skyldes primært genetiske afvigelser, der drev onkogenese og bestemmer de kliniske manifestationer af tumorer; disse kan også påvirke respons på behandling [1]. Vores forbedret viden om underliggende biologi kræft og tilgængeligheden af ​​moderne bioteknologiske værktøjer er begyndt at føre til en vellykket udvikling af nye antitumor molekylære lægemidler, samt en bedre anerkendelse af resistensmekanismer [2], [3]. Bemærkelsesværdige eksempler omfatter

KRAS

mutationer i kolorektale tumorer forudsige resistens over for anti-epidermal vækstfaktor receptor (EGFR) rettet mod monoklonale antistoffer (cetuximab [ImClone og Bristol-Myers Squibb] og panitumumab [Amgen]) [4], [5], og

KIT

mutationer forudsige antitumor svar til imatinib (Novartis) i gastrointestinale stromale tumorer [6]. Molekylær analyse af disse genomiske afvigelser er normalt udført på arkivering tumorvæv grundet etiske og sikkerhedsmæssige udfordringer forbundet med gentagne biopsier. Men i betragtning af potentialet for genomisk ustabilitet, anledning til bekymring, om gyldigheden af ​​denne fremgangsmåde til analyse arkivering tumorvæv i stedet rebiopsying tumor for molekylær analyser på hver terapeutisk beslutningspunkt. For eksempel er det uklart, om analysen af ​​arkivers tumorbiopsier taget mange år, og ofte flere behandlinger tidligere, tilstrækkeligt afspejler sygdom biologi på tidspunktet for behandlingen. Rebiopsy af en udvalgt tumor læsion kan dog ikke give tilstrækkelige oplysninger om intra-patient sygdom molekylære heterogenitet og rebiopsying flere læsioner forbliver klinisk upraktisk. Forbedret strategier til at forfølge patient molekylære lagdeling er et presserende behov for.

Vi satte os for at optimere gavn for patienter med fremskredne solide tumorer, der er nævnt for fase I kliniske forsøg ved at tildele specifikke målrettede behandlinger til patienter, der huser tumor molekylære afvigelser er omfattet af den agent pågældende [2], [3], [7]. Vi evaluerede tumorer opnået fra disse patienter med høj kapacitet Sequenom MassArray platform udnytte OncoCarta mutationen panel (version 1.0; Sequenom, San Diego, CA). Dette panel anvender præ-designet og prævalideret massespektrometrisk SNP genotyping teknologi til parallelle multiplex-analyser af 238 simple og komplekse mutationer tværs 19 fælles onkogener, minimere mængden af ​​prøven nødvendige og maksimere følsomheden [8]. Det er tidligere blevet anvendt med succes til screening af mutationer i formalinfikseret paraffinindlejret (FFPE) tumorvæv [9] [10].

En alternativ kilde til tumor-DNA cirkulerer plasma DNA (cpDNA) [ ,,,0],11], som kan være let og gentagne gange ekstraheret fra plasma og kan være tumor-afledte [11], [12], med cpDNA koncentrationer associere med sygdomsbyrden og progression [13]. Undersøgelser har også vist muligheden for mutation afsløring fra cpDNA i patienter med fremskreden kræft [14], [15], [16], [17], [18]. Vi satte os for at udforske den potentielle anvendelighed af multipleks mutation afsløring fra cpDNA med stor kapacitet Sequenom MassArray platform udnytte OncoCarta mutationen panel (v1.0) for at afgøre, om dette kan anvendes som et supplement til vævsbiopsier at berige og understøtte tumor data til patient udvælgelse. Sekundære mål var at undersøge, om målingen af ​​cpDNA koncentrationer har prognostisk værdi.

Materialer og metoder

Kliniske prøver

Patienter med sent tidspunkt fremskredne solide tumorer, der blev henvist til den Drug Development Unit i Royal Marsden NHS Foundation Trust fra september 2009 og august 2010, og som var berettiget til et fase i forsøg blev inkluderet i denne undersøgelse. Alle patienter forudsat skriftligt informeret samtykke til genetisk analyse af deres tumorer og plasmaprøver før deltagelse i denne undersøgelse. Otte ml perifert blod blev udtaget i en BD Vacutainer Cell Fremstilling Tube (CPT) indeholdende natriumheparin, som tillader plasma og mononukleære celle adskillelse under et enkelt centrifugeringstrin. Røret blev vendt mindst 8 gange for at sikre grundig blanding af prøven, og derefter centrifugeret ved 1800 g i 15 minutter. Den resulterende plasma supernatant blev overført til et rent rør og opbevaret ved -80 ° C indtil analyse. Derudover 20 raske frivillige billede 8 ml blod til analyse ved hjælp af denne metode. blev også anmodet Tilsvarende FFPE prøver (primær og /eller metastatiske steder) for hver patient. Den relevante regulerende og uafhængige etiske komité (National Research Ethics service (NRES) Udvalget London-Chelsea, Storbritannien) godkendte denne undersøgelse forud for retssagen påbegyndes.

DNA isolation og kvantificering

For analyserne af tumor prøver, hemotoxylin- og eosin-farvede objektglas blev gennemgået af en bord-certificeret patolog (KT) at sikre tilstrækkelig levedygtige tumor og at bestemme den tumoral zone til kernen. DNA fra FFPE prøver blev ekstraheret fra 1 mm kerner når det er muligt, eller fra 10 um ufarvede sektioner med mindre biopsier under anvendelse af QIAamp DNA FFPE Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), ifølge producentens anbefalinger. Det ekstraherede DNA blev efterfølgende elueres i 30 pi af ATE puffer og opbevaret ved -20 ° C indtil yderligere analyse. DNA blev kvantificeret ved anvendelse af NanoDrop 1000 spektrofotometer (Thermo Scientific).

I cpDNA ekstraktion, plasma blev optøet ved stuetemperatur og cpDNA ekstraheret fra 2 ml plasma under anvendelse af et QIAamp DNA Blood Midi Kit (Qiagen, Valencia, CA , USA), ifølge producentens instruktioner, med følgende modifikationer: for hver 2 ml prøve af plasma blev yderligere centrifugeringstrin (16000 g, 5 min, RT) tilsættes før ekstraktionen procedure for at fjerne cellerester fra plasma. Ved afslutningen af ​​proceduren blev DNA’et elueret i 100 pi AE elueringspuffer. DNA-koncentrationen blev målt med fluorescerende farvning, ved hjælp af Quant-iT ™ Pico-Green® dobbeltstrenget DNA (dsDNA) Assay Kit (Invitrogen, Carlsbad, CA) og den SynergyHT mikropladelæser (Biotek). DNA fra cancercellelinjer analyserede blev ekstraheret fra pellets ved hjælp af QIAamp DNA Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA, USA), ifølge producentens anbefalinger. Til sammenligning er alle cpDNA koncentrationer præsenteret i dette manuskript udtrykt som ng /ml plasma.

massespektrometri TypePLEX teknologi og OncoCarta panel (v1.0)

OncoCarta panel (v1 .0) består af 24 pools af primerpar og forlængerledninger primere, og har kapacitet til at detektere 238-mutationer i 19 gener. Protokollen tilvejebragt af Sequenom (San Diego, CA) blev fulgt med mindre modifikationer. Mængden af ​​DNA tilsat til polymerasekædereaktionen (PCR) var 20 ng pr reaktion til FFPE DNA-prøver. For plasma DNA prøver blev 30 pi DNA tilsat til 30 pi rent vand, og anvendes til OncoCarta panel (v1.0) forarbejdning. DNA blev amplificeret under anvendelse af OncoCarta PCR-primer pools blev inkorporerede nukleotider inaktiveret ved reje-alkalisk phosphatase (SAP), og en enkelt base extension reaktionen blev udført ved anvendelse extension primere, der hybridiserer umiddelbart ved siden af ​​mutationer og en tilpasset blanding af nukleotider. Salte blev fjernet ved tilsætning af en kationbytterharpiks. Multipleksede reaktioner blev spottet på SpectroCHIP II arrays, og DNA-fragmenter blev løst ved MALDI-TOF på Compact Mass Spectrometer (Sequenom, San Diego, CA).

Dataanalyse

Data analyse blev udført hjælp MassArray Typer Analyzer software 4.0.4.20 (Sequenom), hvilket letter visualisering af data mønstre og den rå spektre. Typer automatiserer identifikation af mutanter ved at sammenligne forhold mellem peak den vilde type som alle formodede mutanter og genererer en OncoMutation rapport med detaljer om specifikke mutationer og forholdene mellem vildtype og mutation toppe. Alle mutationer fra Oncomutation rapporten blev gennemgået manuelt af 2 blindede operatører, med udvalgte anmeldt mutationer fra OncoMutation rapporten sammenlignes og bekræftet at være samstemmende. Manuel gennemgang af mutationer på alle OncoCarta spektre blev udført for at identificere “rigtige” mutant toppe fra salt toppe eller andre baggrunde toppe. Statistiske analyser er beskrevet i den supplerende Methods S1.

FFPE mutation bekræftelse

KRAS

mutationer blev også påvist ved hjælp af TheraScreen KRAS mutation (Qiagen, Tyskland) baseret på Amplification Ildfaste Mutation System (ARMS) -Scorpion PCR [19].

BRAF

V600E mutationer blev også påvist ved hjælp af Kapillærelektroforese-single streng kropsbygning analyse (CE-SSCA). Yderligere oplysninger findes i den supplerende Methods S1.

Resultater

Patient karakteristika

I alt 105 patienter henvist til fase I forsøg deltagelse blev inkluderet i perioden september 2009 og August 2010 (tabel 1. tabel S1). En patient blev efterfølgende fundet at være uegnede til fase I forsøg og derfor dette studie, da han ikke havde udtømt alle linjer af tilgængelige antitumor behandlinger. De forskellige tumortyper repræsenteret i de resterende 104 patienter var colorectal cancer (CRC) (n = 25), brystcancer (n = 19), melanom (n = 15), ovariecancer (n = 15), kastrationsresistent prostatacancer ( CRPC) (n = 11) og andre typer tumorer (n = 19), herunder ikke-småcellet lungekræft (NSCLC), mesotheliom, sarcom, glioblastom, adenocarcinom af ukendt primær (Acup), cholangiocarcinom, og hals-, endometrial, duodenal , esophageal, bugspytkirtel og nyre kræft (tabel 1).

af de 104 patienter blev analyseret i undersøgelsen, blev FFPE primær tumor prøver opnået for 69 (66%) forsøgspersoner, med FFPE nodal og /eller metastatiske tumorprøver bliver tilgængelige i yderligere 31 (30%) patienter. cpDNA blev opsamlet fra 101 (97%) patienter; var det ikke muligt at trække blod fra 1 patient af tekniske grunde og blod blev ikke indsamlet fra 2 patienter på grund af logistiske fejl. I alt 60 patienter døde under opfølgning, mens data for 44 patienter blev censureret af hensyn til denne publikation. Den mediane opfølgningstid var 5,8 måneder (interval 0,3-17,5) (tabel 1).

DNA seriel fortynding eksperimenter for assay udvikling

Fortyndinger af DNA udvundet fra

KRAS

mutant HCT116 human coloncancer cellelinie viste at

KRAS

G13D mutation var reproducerbart påviseligt ved OncoCarta v1.0 panel ved DNA-koncentrationer så lave som 40 ng /ml (fig S1). cpDNA blev også indsamlet fra raske frivillige (tabel 2); i disse prøver blev cpDNA koncentration fundet at være lav: blev påvist median 6,5 ng /ml plasma (interval 4,5-13,3 ng /ml plasma), og ingen mutationer i nogen prøve. En patient med fremskreden brystcancer, som havde meget høje cpDNA niveauer (1600 ng /ml plasma) blev fundet at have en

PIK3CA

mutation i både FFPE og cpDNA prøver; serielle fortyndinger af denne cpDNA viste, at

PIK3CA

mutation kunne påvises op til en koncentration på 2,5 ng /ml plasma udnytte denne analyse.

Plasma cpDNA koncentrationsniveauer og mutation afsløring

Den samlede mediane cpDNA koncentration var 17 ng /ml i disse patienter med fremskredne tumorer (interval: 0,5 til 1600) (Figur 1; tabel S1). Medianen cpDNA koncentration var 18 ng /ml (interval: 5-230) for patienter med CRC; 7 ng /ml (interval: 2-50) for patienter med modermærkekræft, 17 ng /ml (interval: 0,5 til 1600) til patienter med brystkræft, 15 ng /ml (interval: 4-49) for patienter med kræft i æggestokkene og 53 ng /ml plasma (range: 7-1177). for patienter med CRPC, som havde de højeste plasma DNA-koncentrationer

Box og knurhår plots viser 25

th, 50

th og 75

th percentiler, øvre og nedre tilstødende værdier (whiskers) og Tukey outliers (•). P-værdi er for en tosidet uparret t-test på log10 DNA-koncentrationer ved hjælp Welch korrektion for ulige varianser.

Matchet plasma og FFPE var tilgængelige for analyse fra 84 patienter. blev påvist i alt 42 mutationer i enten eller både FFPE tumor og cpDNA prøver opnået fra disse patienter (tabel 3, Tabel S1, Tal S2A-S2D). Den samlede konkordans i fundne mutationer mellem FFPE og cpDNA prøver var 60% (25 af 42 fundne mutationer) (tabel 3). Parametrisk ROC-analyser blev anvendt til at vurdere grænsen for Sequenom platform til påvisning OncoCarta panel mutationer i cpDNA (figur 2A). Koncentrationen af ​​cpDNA med den optimale evne til at detektere en mutation var 29.95 ng /ml (likelihood ratio = 7,3043). AUC beregnede var 0,8075 (95% CI ,6552-,9598). Figur 2B viser de forskellige typer af mutationer i en række tumortyper ved de respektive cpDNA koncentrationer, som de blev påvist på

2A:. Parametrisk ROC-analyser blev anvendt til at vurdere grænsen for Sequenom platform til påvisning OncoCarta panel mutationer i cpDNA. Hver prik på grafen svarer til følsomhed og specificitet ved en af ​​de observerede koncentrationer. Mutationer blev betragtet »til rådighed for detektion”, hvis de blev opdaget i patientens FFPE væv. Mutationer blev påvist i FFPE prøver fra 37 patienter. Koncentrationen af ​​cpDNA med den optimale evne til at detektere en mutation er 29.95 ng /ml (likelihood ratio = 7,3043). AUC beregnede 0,8075 (95% CI ,6552-,9598). Patienter, hvis FFPE var utilgængelig eller testet negativ for mutationer blev udelukket fra analysen. De specificitet referencelinjer for kvartiler af DNA-koncentrationer er angivet i røde stiplede linjer. 2B: Graf viser de typer af mutationer og cpDNA koncentrationer, hvor de blev fundet i forskellige tumorer. Mutationer blev påvist i seks onkogener. Symboler repræsenterer forskellige tumortyper.

Korrelation med patient resultat.

Den mediane samlede overlevelse (OS) for alle patienter var 7,9 måneder (95% CI 5,8, 9,2) . Patienterne blev kategoriseret i lave og høje cpDNA koncentration grupper baseret på den maksimale raske frivillige kohorte DNA-koncentration på 13,3 ng /ml; 61 patienter blev klassificeret som havende høj cpDNA koncentrationer med 40 har lave niveauer. Den mediane OS hos patienter kategoriseret som havende koncentrationer lave cpDNA var 10,5 måneder (95% CI 6,0, NC), mens de i den høje cpDNA koncentration gruppe havde en median OS på 6,5 måneder (95% CI 4,5, 8,4) (logrank p = 0,0383) (figur 3A). Som en kontinuerlig variabel, der var en OS hazard ratio på 2,4 (95% CI 1.4, 4.2) for hver 10-gange stigning i cpDNA fusion (figur 3B).

(3A) Kaplan-Meier graf, der viser overlevelse kurver ved cpDNA koncentration i 101 patienter med fremskredne solide tumorer. Patienter i den ugunstige kategori havde koncentrationer større end en rask frivillig kohorte højst 13,3 ng /ml (logrank p = 0,0383). (3B) Survivor funktion estimeret fra univariate Cox regression viser forudsagt overlevelseskurverne for en række cpDNA koncentrationer. En hazard ratio på 2,4 (p = 0,002) er afbildet mellem tilstødende kurver.

Korrelation med RMH prognostisk score.

Vi har for nylig prospektivt valideret prognostisk score (RMH score) for patienter, der deltager i kliniske fase i forsøg baseret på kombinationen af ​​tre prognostiske faktorer: serumalbumin mindre end 35 g /l; lactat dehydrogenase (LDH) er større end den øvre normalgrænse (ULN); og to eller flere steder med metastaser. Tilstedeværelsen af ​​hver af disse variabler er forbundet med forværring udfald [20]. Den gennemsnitlige cpDNA koncentrationen var højere hos patienter med et værre RMH prognostisk score (F [3,98] = 9,97, p 0,0001); Post-test afslørede en betydelig positiv lineær tendens mellem log10 (cpDNA) og RMH score (beta = 0,247, p 0,0001) (Figur 4)

Scatterplot viser forholdet mellem cpDNA koncentration og RMH prognostisk score.. Der var en signifikant positiv lineær tendens mellem log

10 (cpDNA) og RMH score (beta = 0,252, p 0,0001)..

Sammenhæng med univariate og multivariate analyse

univariate test blev anvendt til at bestemme signifikante prædiktorer for samlet overlevelse, som omfattede cpDNA koncentration som en kontinuerlig variabel (HR 2,4 pr 10-dobling, 95% CI 1,4-4,2), albumin 35 g /L (logrank p = 0,0003 ), og ECOG performance status lig med 2 (logrank p = 0,0007). Når cpDNA, albumin og performance status blev indarbejdet i en multivariat model blev alle tre parametre sig at være uafhængige prædiktorer for overlevelse (tabel 4). Antallet af metastatiske steder blev ikke fundet at være en væsentlig indikator for overlevelse i univariate analyser og blev derfor udelukket fra multivariate model.

Mutationsanalyse detektion og overensstemmelse mellem FFPE og cpDNA

Tyktarmskræft.

af 25 patienter med CRC, blev cpDNA prøver opnået fra alle patienter, mens FFPE tumorprøver var tilgængelige for analyse for 22 patienter. Samlet set blev konstateret mutationer i 15 af 22 (68,2%) til rådighed FFPE tumorer og 14 af 25 (56%) cpDNA prøver (tabel S1). Specifikt

KRAS

,

BRAF

PIK3CA

mutationer blev påvist i 10 (45%), 3 (14%) og 2 (9%) tumorprøver henholdsvis . Forholdsvis, 9 (36%)

KRAS

, 3 (12%)

BRAF

og 3 (12%)

blev opdaget PIK3CA

mutationer i cpDNA prøver.

Overensstemmelse i påvisning af mutationer mellem matchede FFPE arkivering tumorer og cpDNA prøver af Sequenom OncoCarta analyser var 70% (7 ud af 10 patienter) for

KRAS

og 100% (3 af 3 patienter) for

BRAF

mutationsstatus (tabel 3). Ingen patienter med vildtype

KRAS

eller

BRAF

tumor væv genotyper havde mutationer i deres respektive cpDNA. Fem patienter havde påviselige

PIK3CA

mutationer i enten eller både FFPE tumor og /eller cpDNA: 1 patient havde en Q546K mutation påvist i både FFPE væv og cpDNA; 1 patient havde en E545K mutation opdaget kun i FFPE, men ikke cpDNA; 1 patient havde en E542K-mutationen detekteres i en levermetastase (FFPE), men ikke i den primære tumor (FFPE) eller cpDNA; 1 patient havde E545K opdaget kun i plasma, men ikke FFPE; og 1 patient havde en Q546K mutation findes i cpDNA men ingen FFPE prøve var tilgængelig. Den nyligt rapporterede onkogene

Akt1

E17K mutation [21] blev påvist i en patient i både væv og plasma. Der blev ikke påvist mutationer i andre testede onkogener.

Der var 90% (9 af 10

KRAS

muterede prøver) konkordans for FFPE tumoral

KRAS

mutationsstatus mellem OncoCarta panel og armene-Scorpion PCR platforme. Den BRAF overensstemmelse mellem de OncoCarta panel og CE-SSCA metode var 100% (3 af 3

BRAF

muterede prøver).

melanom.

Af de 15 patienter med modermærkekræft , FFPE tumorprøver var tilgængelige til analyse for 10 patienter, mens cpDNA prøver blev opnået fra alle 15 patienter. Samlet set blev der påvist mutationer i 8 af 10 (80,0%) til rådighed FFPE tumorer og 6 af 15 (40%) cpDNA prøver (tabel S1).

BRAF

,

NTM

og

MET

mutationer blev påvist i 5 (50%), 3 (30%) og 1 (10%) af 10 FFPE tumorprøver, henholdsvis og 3 (20%), 2 (13,3% ) og 2 (13,3%) af 15 cpDNA prøver. Overensstemmelse i påvisning af mutationer mellem matchede FFPE og cpDNA var 60% (3 af 5 patienter) for

BRAF

, 66,7% for

NTM Hotel (2 af 3 patienter), og 100% for

MET

mutationsstatus (1 af 1 patient) (tabel 3). En anden

MET

mutation, T992I, blev fundet i en cpDNA prøve, men ingen FFPE tumor eksemplar var til rådighed. Ingen patienter med vildtype tumor væv genotyper havde mutationer i deres respektive cpDNA.

Der var 100% konkordans (5 af 5 prøver) for

BRAF

mutationsstatus mellem OncoCarta panel og CE-SSCA metode.

brystkræft.

FFPE tumor prøver og cpDNA prøver var tilgængelige for analyse for alle 19 patienter med brystkræft. Samlet set blev der påvist mutationer i 5 ud af 19 (26,3%) FFPE tumorer og 4 af 19 (21,1%) cpDNA prøver (tabel S1).

PIK3CA

H1047R mutation blev påvist i 4 af 19 (21,5%) tumor prøver og 3 af 19 (15,8%) cpDNA prøver med overensstemmelse mellem 3 af 4 (75%) matchede FFPE og cpDNA prøver (tabel 3).

Akt1

E17K mutation blev fundet i en patient i både FFPE væv og cpDNA. Ingen mutationer i nogen af ​​de andre onkogener undersøgte blev detekteret med OncoCarta panelet. Ingen patienter med vildtype tumor væv genotyper havde mutationer i deres respektive cpDNA.

Kastration resistent prostatacancer.

Af de 11 patienter med CRPC, cpDNA prøver blev indhentet fra alle patienter, mens FFPE tumorer var tilgængelige for 8 patienter. Samlet set blev der påvist mutationer i 3 af 8 (37,5%) FFPE tumorer, og 3 af 11 (27,3%) cpDNA prøver (tabel S1).

PIK3CA

,

HRAS

og

Akt1

(alle n = 1) mutationer blev påvist i FFPE tumor prøver, mens

NTM

,

PIK3CA

Akt1

(alle n = 1) mutationer blev fundet i cpDNA prøver. Den tilsvarende FFPE tumor

PIK3CA

Akt1

mutationer blev fundet i cpDNA prøverne, men FFPE tumor

HRAS

mutation blev ikke fundet i matchede cpDNA prøven (tabel 3 ). Den Q61K

NTM

mutation blev fundet i 1 cpDNA prøve, men ikke i den tilsvarende FFPE tumor prøve.

Kræft i æggestokkene.

Af de 15 patienter med fremskreden kræft i æggestokkene, cpDNA prøver blev opnået fra alle patienter, mens FFPE tumorprøver var tilgængelige for 14 patienter. Samlet set blev der påvist mutationer i 5 af 14 (35,7%) FFPE tumorer og 0 af 14 (0%) cpDNA prøver (tabel S1).

KRAS

mutationer (G12V og G13D) (n = 3) og

PIK3CA

H1047R mutation (n = 1) blev påvist i FFPE tumorprøver, men ingen mutationer blev fundet i nogen cpDNA prøver (tabel 3). En patient med æggestokkene carcinosarcoma havde en

KIT

P585P mutation påvist i FFPE, men ikke i cpDNA.

Andre tumortyper.

Af de resterende 19 patienter med en række tumortyper blev cpDNA prøver fra 17 patienter, mens FFPE tumorer var tilgængelige for 12 patienter.

NTM

G12D mutation blev fundet i både FFPE tumor og plasma fra en patient med Acup ( tabel 3).

NTM

G13R mutation blev påvist i plasma, men ikke i FFPE tumor fra en patient med cholangiocarcinoma.

KRAS

G12D mutation blev fundet i FFPE tumor, men ikke i plasma fra en patient med duodenal cancer. Ingen mutationer blev påvist i de andre patienter, herunder ingen epidermal vækstfaktor receptor (

EGFR

) mutationer i de 5 patienter med NSCLC.

Overensstemmelse i mutation afsløring mellem FPFE og cpDNA for primær tumor eller metastatiske prøver

Når man overvejer alle patienter med matchede prøver, herunder uden fundne mutationer (n = 83), overensstemmelsen i detektion af mutationer mellem FFPE og cpDNA var højere i metastaser (83,3% af 18 prøver) i forhold til primær tumor (78,5% af 65 prøver). Når man overvejer kun patienter med mutationer detekteret i mindst blod og /eller primær tumor (n = 40), overensstemmelsen i detektion af mutationer mellem FFPE og cpDNA var igen højere i metastaser (70,0% af 10 prøver) sammenlignet med primær tumor (53,3% af 30 prøver). Men på grund af forskellen i antallet af primær tumor (n = 65) og metastatisk (n = 18) enheder opnået, er vi i stand til at drage statistiske konklusioner ud fra disse data.

Diskussion

Denne undersøgelse har vist, for første gang, det er muligt at multipleks påvisning af tumor DNA-mutationer udnytte multiplex OncoCarta panel fra både DNA ekstraheret fra FFPE arkivering tumorvæv og cpDNA. Vi har vist, at det samlede cpDNA niveauer i patienter med fremskredne kræftformer er generelt væsentligt højere end hos raske frivillige, med de højeste koncentrationer er fundet i patienter med fremskreden prostatacancer og brystkræft, selv om denne forskel ikke var signifikant i melanom og ovariecancer (Figur 1). Den maksimale påvist i raske frivillige koncentration viste sig at opdele patienterne i to grupper, der var forbundet med markant forskellige prognoser; patienter i lave cpDNA gruppe havde en signifikant højere OS forhold til dem i den høje cpDNA gruppen [11], [13], [22]. Desuden cpDNA koncentrationen forblev stærkt prognostisk til OS i en multivariat analyser udnytte de prognostiske biomarkører for fase I forsøg patientpopulation, som vi tidligere har beskrevet [20]. Vi har også vist en sammenhæng mellem cpDNA koncentrationer og den prognostiske score, som vi tidligere har beskrevet at forudsige resultatet af patienter henvist til fase I forsøg deltagelse; cpDNA koncentration, albumin 35 g /L og performance status havde prognostisk værdi i vores serie af patienter som selvstændige prædiktorer for overlevelse. Disse data samlet indikerer, at cpDNA i denne patientgruppe er i vid udstrækning tumor stammer, selv om dette kan være genereret af både maligne og stromale celler.

Sequenom OncoCarta Panelet har også gjort det muligt for os at analysere mere end 230 kendte mutation ‘hot -spots ‘mutationer i over hundrede patienter i en high throughput fashion. Den OncoCarta panel dækker et stort og stigende antal onkogener og kan tilpasses til at omfatte yderligere gener af interesse. Den tillader tumor mutationsdetektion selv med minimale mængder af tumor-DNA, dårlig vævskonservering og tilstedeværelsen af ​​signifikante mængder af normalt DNA. Næste generation sekventering teknologi vil gøre det muligt mere DNA dækning og dataopsamling, tillader sekventering af hundredvis af gener i fuld længde, som vil være kritisk for undersøgelsen af ​​gener, hvor mutationer kan findes i flere forskellige steder, som det er tilfældet for mange tumorsuppressor gener såsom BRCA1, BRCA2, p53 og PTEN.

som vi bevæger hen imod udviklingen af ​​molekylært målrettede midler til udvalgte populationer af patienter, er det afgørende, at den molekylære karakterisering af tumorer til forudsigelse af effekten til målrettede behandlinger inkorporeres i tidlige kliniske forsøg [2], [3]. En sådan tilgang kan øge odds for enkelte patients fordel, mindske antallet af patienter, der modtager ineffektive behandlinger og fremskynde den kliniske kvalificering af prædiktive biomarkører. Archival tumorvæv, ofte taget mange år før, bruges ofte til disse analyser. Tumor rebiopsy stadig ualmindeligt, selv om det er muligt, som påvist i den første BATTLE lungekræft adaptive forsøg [23]. Ikke desto mindre, mandat flere gentagne tumor rebiopsies udgør logistiske, skattemæssige og etiske spørgsmål, mens bremse forsøg periodisering og ikke behandle spørgsmålet om intra-patient læsion-til-læsion heterogenitet. Rebiopsy og cpDNA analyser kan både adresse bekymringer omkring tumor genomisk ustabilitet og klonede molekylær evolution grund terapeutiske valg pres samtidig potentielt afhøre den intra-patient heterogenitet problem.