PLoS ONE: ornithindecarboxylase Antizyme inducerer hypometylering af Genome DNA og histon H3 lysin 9 dimethylering (H3K9me2) i Human Oral Cancer Cell Line

Abstrakt

Baggrund

Methylering af CpG øer af genom-DNA og lysinrester i histon H3 og H4 haler regulerer gentransskription. Inhibering af polyaminsyntese af ornithindecarboxylase antizyme-1 (OAZ) i human oral cancer cellelinje resulterede i akkumulering af decarboxyleret

S-

adenosylmethionin (dcSAM), der virker som en kompetitiv inhibitor af methylering reaktioner. Vi forventede, at ophobning af dcSAM nedsat methylering reaktioner og resulterede i hypometylering af genom DNA og histon haler.

Metode /vigtigste resultater

Global methylering tilstand af genom DNA og lysin rester af histon H3 og H4 haler blev analyseret ved methylering af Isoschizomers (MIAMI) fremgangsmåde og western blotting, henholdsvis i nærværelse eller fravær af OAZ ekspression. Ektopisk ekspression af OAZ medieret hypometylering af CpG øer af genom-DNA og histon H3 lysin 9 dimethylering (H3K9me2). Protein niveau af DNA methyltransferase 3B (DNMT3B) og histon H3K9me specifik methyltransferase G9A blev nedreguleret i OAZ transfektant.

Konklusioner /Betydning

OAZ induceret hypometylering af CpG øer af global genom-DNA og H3K9me2 ved at nedregulere DNMT3B og G9A proteinniveau. Hypometylering af CpG øer af genom-DNA og histon H3K9me2 er en potent mekanisme af induktion af de gener relateret til tumor undertrykkelse og DNA dobbelt streng pause reparation

Henvisning:. Yamamoto D, Shima K, Matsuo K, Nishioka T, chen CY, Hu Gf, et al. (2010) ornithindecarboxylase Antizyme inducerer hypometylering af Genome DNA og histon H3 lysin 9 dimethylering (H3K9me2) i Human Oral Cancer Cell Line. PLoS ONE 5 (9): e12554. doi: 10,1371 /journal.pone.0012554

Redaktør: Shuang-Yong Xu, New England Biolabs, Inc, USA

Modtaget: May 3, 2010; Accepteret: 31 Juli 2010; Udgivet: 3 September, 2010

Copyright: © 2010 Yamamoto et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Finansiering:. National Institutes Sundhedsstyrelsen (National Cancer Institute) Research Grant RO1-CA10044 for Takanori Tsuji. De finansieringskilder havde ingen rolle i studie design, indsamling og analyse af data, beslutning om at offentliggøre, eller forberedelse af manuskriptet

Konkurrerende interesser:.. Forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

ornithindecarboxylase (ODC; EC4.1.1.17) er det første og hastighedsbegrænsende nøgleenzym for polyaminbiosyntese ved at katalysere fra L-ornithin til putrescin [1], og er impliceret i celleproliferation og differentiering [2 ]. Ornithindecarboxylase antizyme underfamilie består af tre relaterede antizyme medlemmer og ornithindecarboxylase antizyme-1 (OAZ) blev først opdaget og identificeret som en ornithindecarboxylase (ODC) hæmmende molekyle ved at stimulere nedbrydning af ODC protein [3], [4]. OAZ vides at binde forskellige proteiner og mediere nedbrydning eller stabilisering af målproteiner. Disse proteiner indbefatter ODC [5], antizyme inhibitor [6], cyclin D1 [7], [8] og HPV16 E2 [9]. Som vist i fig. 1, hæmning af ODC-aktivitet og den efterfølgende polyaminsyntese af OAZ [10] og kemiske forbindelser, α-difluormethylornithin (DFMO) [5] medførte ophobning af dcSAM. dcSAM tjener som en aminopropyl donor for polyaminsyntese men det virker som en kompetitiv inhibitor af S-adenosylmethionin, næsten i alle methylering reaktioner, herunder DNA, RNA, lipid og protein [5], [11]. Ektopisk ekspression af OAZ i hamster cancer oral celler induceret global hypometylering, og transaktiveres de gener relateret til tumor suppression og epitheldifferentiering [10]. Efterfølgende vi profileret generne induceret eller opreguleret i humane orale cancerceller ved OAZ, og fandt induktion af gener relateret til DNA dobbeltstrengsbrud reparation af non-homolog endesammenbinding mekanisme [10].

ODC er et nøgleenzym af polyaminsyntese ved at katalysere fra L-ornithin til putrescin. OAZ er en inhibitorisk molekyle af ODC-aktivitet ved at mediere nedbrydning af ODC protein. SAM tjener som en methylgruppe donor i methylering reaktioner samt forløber for dcSAM produktion. dcSAM er en aminopropyl donor af polyaminbiosyntese men det fungerer også som en kompetitiv inhibitor af SAM næsten i alle methylering reaktioner. Hæmning af ODC aktivitet fører til polyamin udtømning og dcSAM ophobning, som hæmmer methylering reaktioner.

DNA methylering af CpG øer og histon modifikation, især acetylering og methylering af lysin rester af histon haler er tæt korreleret til at regulere genekspression. Histonacetylering er generelt korreleret med transkriptionel aktivering, men histon methylering regulerer transkriptionel aktivering eller repression afhængigt af stedet for lysin methylering [12]. Histon lysin methylering opstår på seks lysin rester af halerne fra histoner H3 (K4, K9, K27, K36, K79) og H4 (K20) [13], [14]. Hver af disse lysiner kan være mono-, di- eller trimethyleret [13]. Methylering af H3K4, H3K36 og H3K79 er primært korreleret med transkriptionel aktivering mens methylering af H3K9, H3K27 og H4K20 forekommer hovedsagelig i forbindelse med transkriptionelle lyddæmpning [15], [16]. Den indbyrdes afhængige forhold mellem DNA methylering og histon methylering er en af ​​de renter emner i genregulering. H3K9 methylering og DNA-methylering er tæt forbundet i heterochromatin og transskriptionelt undertrykt euchromatic regioner. Voksende beviser afsløret, at DNA cytosin methylering sameksisterer med repressive H3K9 methylering fordi DNA methyltransferaser, methyl-CpG bindende protein (MeCP2), og heterokromatin protein1 (HP1) rekruttere H3K9 specifik methyltransferase at methylere histon lysinrester [17] – [19]. Denne mekanisme er vendt i nogle systemer [20]. H3K9 methylering er en forudsætning for methylering af DNA [21] – [24]. Vi hypotesen, at akkumulering af dcSAM ved ektopisk OAZ ekspression fører til hypometylering af genom-DNA og histon haler og hypometylering af genom-DNA og histon haler opregulerer eller transaktiverer gener involveret i DNA dobbeltstrengsbrud reparation. De genomiske data tjene som et fundament til at forstå det indbyrdes forhold mellem transskription faktor og kromatin baserede veje. I den foreliggende undersøgelse, vi screenet og verificerede OAZ medieret global hypometylering af genom-DNA og histon H3 og H4 haler.

Resultater

ODC aktivitet

OAZ protein fremmer nedbrydning af ornithin decarboxylase (ODC) protein og reduktion af ODC enzymaktivitet. For at undersøge om OAZ protein transkriberes og translateres fra OAZ transfektanten (UM1-pMT /CB6

+ HuFSAZ-wt) er et biologisk aktivt protein, blev ODC enzymaktivitetsassay udført som tidligere beskrevet [10]. Den ODC aktivitet i OAZ transfektant med ZnSO

4 behandling udstillet reduceret ODC enzymaktivitet (1629,0 ± 61,7 /picomol CO

2 per time per milligram protein) med 72,6% sammenligne med den mock vektor transfektant (UM- 1pMT /CB6

+) behandlet med ZnSO

4 (5930,0 ± 110,7 /picomol CO

2 per time per milligram protein) (p 0,05). Den ODC aktivitet i OAZ transfektanten uden ZnSO

4 behandling faldt (4944.1 ± 414,6 /picomol CO

2 per time per milligram protein) med 30,3% sammenligne med den mock vektor transfektanten uden ZnSO

4 behandling (7084,7 ± 284,1 /picomol CO

2 per time per milligram protein) (fig. 2). Dette er sandsynligvis på grund af udsivning af genekspression induceret af spormængde af Zn

2+ suppleret i dyrkningsmediet. Reduktionen af ​​ODC aktivitet i OAZ transfektant bekræftet, at OAZ protein induceret af ZnSO

4-behandling var biologisk funktionelt protein.

ODC aktivitet (picomol CO

2 per time per milligram protein) af forældrenes UM1, mock vektor transfektanten og OAZ transfektant med og uden ZnSO

4 behandlingen blev målt. Tredobbelt kvantificering blev udført. Korrigeret ODC aktivitet værdier blev opnået ved at trække værdien for tom. ODC aktivitet OAZ transfektant uden ZnSO

4 behandlingen blev undertrykt, fordi spor mængde ZnSO

4 i dyrkningsmedium forårsaget lækage af OAZ genekspression.

Intracellulær niveau af polyaminer og metabolitter

Vi forventes, at reduktionen af ​​ODC enzymatisk aktivitet førte til udtømning af polyamin pool og den efterfølgende ændring af intracellulær niveau af polyamin- metabolitter. Vi kvantificerede intracellulær ODC, polyaminer og metabolitter niveau ved HPLC-analyse som tidligere beskrevet [5]. Ektopisk udtryk for OAZ nedreguleret ODC proteinniveauet fra 51ng /10

6 celler til 8,4 ng /10

6 celler. Som forventet polyamingrupperne niveauer drastisk reduceret som følge af undertrykkelse af ODC-aktivitet. Putrescin niveau faldt fra 9 ng /10

6 celler til 1,3 ng /10

6 celler. Spermidin niveau faldt fra 15,1 ng /10

6 celler til 0,2 ng /10

6 celler. Spermin niveau faldt fra 72,8 ng /10

6 celler til 1,0 ng /10

6 celler (fig. 3A). S-adenosylmethionin (SAM), der er en methylgruppe donor for alle methylering reaktioner, var ganske konstant gennem eksperimenterne. Den intracellulære mængde SAM var 17,8 ng /10

6 celler i OAZ transfektanten og 14.3 ng /10

6 celler i mock vektor transfektant. Den intracellulære niveau af dcSAM i kontrollen mock vektor transfektant var 1,22 ng /10

6 celler, men det steg drastisk til 87,9 ng /10

6 celler i OAZ transfektant. Den intracellulære niveau af S-adenosylhomocystein (SAH) steg også fra 0,66 ng /10

6 celler til 3,76 ng /10

6 celler (fig. 3B).

Polyamin pulje blev udtømt (A ) men dcSAM og SAH, der var potentielle hæmmere af methylering reaktioner, øget (B) i OAZ transfektant behandlet med ZnSO

4. Cellular niveau af SAM var konstant gennem eksperimenterne (B).

Methylering tilstand af genom-DNA

Som vi allerede har offentliggjort, ektopisk ekspression af OAZ i hamster maligne orale keratinocytter induceret global hypomethylering af CCGG steder i genomet DNA [10]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi, om det samme hypometylering blev induceret ved den humane OAZ i human oral cancer cellelinie. Niveauet af methylerede cytosiner i CCGG sites blev kvantificeret ved måling af radioaktiviteten i de to store pletter, 5′[

32P] dCMP og 5′[

32p] dm

5CMP ved væskescintillationstælling. Resultatet af kvantificeringen er vist i fig. 4 procent af dm

5CMP. Den OAZ transfektant med og uden ZnSO

4 behandling udviste at 26,0% og 40,6% af CCGG sekvenser var methyleret, henholdsvis. De parentale UM1 celler med og uden ZnSO

4 behandling, og mock vektor transfektant med og uden ZnSO

4 behandling udviste 48,7% og 50,2%, og 40,4% og 40,9% af det indre cytosin var methyleret henholdsvis. Dette resultat indikerer ektopisk ekspression af OAZ er associeret med hele genomet DNA demethylering i human oral cancer cellelinie. Genomisk DNA af OAZ transfektanten er omkring 60% mindre methyleret end den mock vektor transfektant.

Global methylering niveau af 5′-methyl-CMP (dm5’dCMP) og 5’dCMP i genom DNA fra parentale UM1 celler, mock vektor og OAZ transfektant blev målt ved scintillationstælling.

32P-mærket dm

5CMP og CMP blev produceret ved spaltning af de respektive genom DNA med restriktionsenzymer

Msp

I og dens methylering følsomme isoschizomer

Hpa

II, og de var separeret på en tyndtlagschromatografi.

Methylering tilstand af histon H3 og H4 haler

Methylering tilstand af lysin rester af histon H3 og H4 haler links til dannelse af transactive euchromatin eller transrepressive heterochromatin afhængig methylering site. Udtømning af polyamin pool by OAZ førte til akkumulering af dcSAM, der fungerer som kompetitiv inhibitor af SAM i methylering reaktioner. Vi forventede akkumulering af dcSAM medieret global hypometylering af lysinrester i histon H3 og H4 haler. Som den første screening tilgang til at undersøge en potentiel sammenhæng mellem akkumulation af dcSAM og ændring af den globale histon methylering tilstand, vi analyserede de globale ændringer i status methylering af histne H3 og H4 ved western blotting. Seksten antistoffer mod mono-, di- og tri-methylering af specifikke lysinrester i histon H3 og H4 blev anvendt. Vi kunne observere et signifikant fald i den globale niveau af histon H3 Lys-9 dimethylering (H3K9me2), H3K27me1, H3K27me2, en H3K27me3 ved 41,6, 14,3, 16,4 og 17,5% henholdsvis i OAZ transfektant (fig. 5A og B). Signalet intensitet histon H3 var konstant blandt alle prøver er indlæst. I modsætning hertil andre tolv antistoffer til histoner H3 (H3K4me1, H3K4me2, H3K4me3, H3K9me1, H3K9me3, H3K36me1, H3K36me2, H3K36me3, H3K79me2) og H4 (H4K20me1, H4K20me2, H4K20me3) ikke udviser nogen signifikant forskel mellem OAZ transfektanten og mock vektor transfektant (fig. 5A og B). Di-methylering af histon H3K9 er et tegn på konstitutiv heterochromatin og gen-undertrykkelse. Hypomethylering af H3K9me2 er en ændring af kromatin tilstand fra heterokromatin til eukromatin, hvilket også betyder transkriptionel aktivitet af gener skifter fra en repressiv til aktiv tilstand. Denne demethylering af H3K9me2 af OAZ spekulerer aktivering af gener relateret til differentiering [10] og DNA dobbeltstrengsbrud reparation [25].

Signifikant hypometylering af H3K9me2 blev vist i OAZ transfektant behandlet med ZnSO

4 . Status for methylering af andre lysinrester i histon H3 og H4 haler blev ikke ændret. Histone H3 og H4 proteiner (17 kDa og 10 kDa) blev også blottet på den samme membran efter stripning at overvåge samme mængde protein lastning i hver bane. Vi viser kun H3K9, H3K27 og H4K20 resultater, fordi methylering af disse histon haler fungerer som transskriptionsrepressor (A). Værdien betegne den relative intensitet af methylerede histon protein bands i Oaz transfektanter med den mock vektor transfektanter efter at være normaliseret til PAN H3 og H4 bands. Intensitet af kontrollen (mock vektor transfektant uden ZnSO

4 behandling) blev betragtet som 100 og andre signaler blev udtrykt som relativ værdi (B).

Expression niveau DNMTs og G9A

Vi først undersøgt, om OAZ ændret mRNA ekspressionsniveauet af DNMTs og G9A af QRT-PCR. Konventionel RT-PCR blev udført før QRT-PCR for at bekræfte, at primeren sæt var i stand til at forstærke enkelt amplikon. Vi bekræftede disse PCR-primere kan amplificere crispy enkelt bånd efter 35 cyklus PCR reaktion (data ikke vist). De efterfølgende QRT-PCR-resultater viste, at OAZ ekspression eller ZnSO

4 behandling ikke påvirkede ekspressionsniveauet af DNMT1, 3A, 3B og G9A mRNA (p 0,01) (fig. 6). OAZ medieret global hypometylering af genom-DNA og histon H3K9me2. DNMTs 1, 3A, 3B og G9A /GLP histon methyltrasferase kompleks er involveret i methylering af genom-DNA og histon H3K9me2 hhv. Vi antager, at hypomethylering af histon haler var en af ​​pleiotrope mål for dcSAM-medieret hypometylering, og alle de methylerede lysiner af histon-haler blev hypomethylated men i virkeligheden kun H3K9me2 blev hypomethylated. Denne uventede resultat fik os til at undersøge protein niveau DNMTs og G9A. Methylering af den mammale H3K9 katalyseres af G9A /GLP histon methyltransferase kompleks. Western blot-analyser afslørede protein niveau DNMT3B (fig. 7) og G9A (fig. 8) var signifikant nedreguleret, men det protein niveauet DNMT1 og 3A blev ikke ændret i OAZ transfektant. Dette resultat tyder på, at den globale hypometylering af genom-DNA og histon haler skyldes ikke kun af en pleiotropisk effekt af dcSAM men bestemt måde arbejder for at hypomethylate genom DNA og histon haler.

Expression niveau af disse mRNA blev ikke ændret ved OAZ. PCR Resultatet blev normaliseret under anvendelse af -beta-actin signal. Signal af kontrollen (mock vektor transfektant uden ZnSO

4 behandling) blev betragtet som 100 og andre signaler blev udtrykt som relativ værdi.

Nuclear ekstrakter blev immunoblottedes med anti-DNMTs antistoffer. Proteinniveau af DNMT1 (183 kDa) og DNMT3A (101 kDa) blev konstant, men proteinniveau af DNMT3B (110 kDa) blev signifikant reduceret i OAZ transfektant behandlet med ZnSO

4. De Fain bands optrådte i DNMT3A og DNMT3B klatter er isoformer af DNMT3A og 3B. Oct-1 (89 kDa) blev anvendt til at overvåge samme mængde protein lastning i hver bane.

Nukleare ekstrakter blev immunoblottet med anti-G9A antistof. Ekspression af G9A protein (140 kDa) blev nedsat i OAZ transfektant behandlet med ZnSO

4.

DNMT enzymaktivitet

Vi brugte poly (di-dC) poly ( di-dC) som et substrat for DNMT enzymaktivitetsassay. DNMT enzymaktivitet blev bestemt ved måling af inkorporering af markør i poly (dI-dC) poly (dI-dC) substrat. Methyl poly (di-dC) poly (di-dC) produktion blev undertrykt af -65% i OAZ transfektant med ZnSO

4 behandling sammenligne med dem i kontrolgruppen transfektanten og OAZ transfektanten uden ZnSO

4 behandling ( P 0,01) (fig 9).. Dette resultat viste, at faldet DNMT3B protein undertrykte del af den samlede DNMT aktivitet og dette faldt DNMT aktivitet er korreleret med nedregulering af DNMT3B protein ved OAZ.

Samlet DNMT aktivitet blev udført. DNMT aktivitet blev reduceret med -65% i OAZ transfektant behandlet med ZnSO

4. Dette resultat er korreleret med western blot resultat af DNMT3B.

Diskussion

Vi har rapporteret, at ektopisk udtryk for OAZ i hamster orale kræftceller resulterede i global hypometylering af genom-DNA [10 ] og fremkaldt eller opreguleret ekspression af gener relateret til DNA dobbeltstrengsbrud reparation i humane orale cancerceller [25]. Afvigende methylering af CpG-øer i promotorregionen inaktiverer gentransskription [26] – [28]. Covalente modifikationer af histon haler spiller også en vigtig rolle i transkription, DNA-replikation, DNA break reparation og chromatinkondensering i mitose [29]. Blandt disse histon modifikationer, er methylering og acetylering af histon haler involveret i regulering af gentranskription [30], [31]. I den foreliggende undersøgelse undersøgte vi den globale methylering tilstand af genom DNA og lysinrester fra histon haler i humane orale kræftceller i fravær eller tilstedeværelse af OAZ udtryk. Inhibering af polyamin syntese ved OAZ akkumuleret unormalt højt niveau af dcSAM, der virker som en kompetitiv inhibitor af

S-

adenosylmethionin næsten i alle methylering reaktioner. Vi forudsagde ophobning af dcSAM induceret hypometylering af cystin rester af CpG øer og ændrede methylering tilhørende lysin rester af histon haler. Cytosin rester af CCGG steder i genom-DNA blev globalt hypomethylated som forventet, men kun H3K9me2 blev hypomethylated blandt de methylable lysin rester af histon haler. Disse resultater fik os til at undersøge protein niveauet af DNA methyltransferaser (DNMTs) og H3K9me2-specifikke methyltransferase G9A. Vores Western blot resultater udstillet protein niveau af DNMT3B og G9A blev nedreguleret i Oaz transfektanterne. DNA methylering mønstre etableres og vedligeholdes af koordineringen af ​​DNA metyltransferaser, DNMT1, DNMT3A og DNMT3B. DNMT1 forfølger vedligeholdelse af methylering mønster efter DNA-replikation, hvorimod DNMT3A og DNMT3B er hovedansvarlige for de novo methylering [32] og vedligeholdelse af methylering i visse områder af genomet DNA under embryogenese og udvikling [33]. DNMT3B udtømning i menneskelige kræftceller reaktiveret methylering-lyddæmpet genekspression men inducerede ikke global eller juxtacentromeric satellit demethylering [34]. Udtømning af DNMT3B af OAZ kunne fremme sekvensspecifik DNA demethylering og induceret eller opreguleret ekspression af gener relateret til DNA break reparation, men ophobning af dcSAM også bidraget til tilfældig, global DNA demethylering.

G9A histon methyltransferase , som entydigt methylerer histon H3K9, er også en vigtig aktør på gendæmpning [35] og afgørende for tidlig embryogenese at regulere udviklingsmæssige genekspression [36]. Methylering af H3K9me2 medieret af G9A ændrer chromatin struktur fra afslappet euchromatin til kompakt heterochromatin og undertrykker en række genekspression [36] – [38]. Methylering af H3K9 har været kendt for at associere med hypermethylering af promotor- CpG-øer i cancerceller [39], [40]. DNA methylering og H3K9 methylering stramt samarbejder om at regulere genekspression. H3K9 methylering er en forudsætning for DNA-methylering [21] – [23] og H3K9 methylering er nødvendig for DNA-methylering [22], [23]. G9A medieret DNA-methylering kræver ikke dens katalytiske aktivitet [41], hvilket antyder, at den kan have yderligere funktioner i dirigere DNA-methylering, såsom rekruttering af DNMTs [42]. G9A protein binder til DNMT1 og fører til forøget DNA og histon methylering [43]. G9A protein rekrutterer også og binder til DNMT3A og DNMT3B proteiner gennem sin ankyrin (ANK) domænet [44], og lokaliserer dem til de steder, hvor DNA-replikation. H3K9me2 spiller ligeledes en vigtig rolle i gendæmpning i euchromatin og efterfølgende de novo DNA-methylering af embryonale og kim line gener under normal udvikling [41], og er nødvendige for opretholdelsen af ​​DNA-methylering ved endogene retrotransposoner, præget loci, og andre gener i differentieret celler [45]. Li et al og Deng et al rapporterede inhibering af global genom DNA-methylering med 5-aza-2′-deoxycytidin (5-aza-CdR) nedsatte protein ekspression af DNMT1 og DNMT3B [46], [47]. Wozniak et al rapporterede, at 5-Aza-CdR behandling hypomethylated global H3K9me2 i humane brystkræftceller ved at nedregulere G9A proteinniveauet [48]. Disse data antyder, at DNA-demethylering kan være et signal, der styrer demethylering af H3K9 under DNA-replikation.

Det er en ulige resultat, at akkumulering af dcSAM ikke ændrede methylering tilstand af lysinrester i histon haler andre end H3K9me2 fordi hæmning af methylering af dcSAM synes en pleiotropisk effekt. Transkriptionsfaktorer har også pleiotropisk virkning, men deres aktivitet er stramt reguleret af cis- og trans-virkende elementer til at regulere genekspression i vævs-, udviklingsmæssige stage-, og sygdom-specifik måde. Vi tror methylering hæmning af dcSAM er ikke pleiotropisk måde, men det er også reguleret af yderligere cis- og tras-virkende elementer til at målrette specifikke steder i generne og histon haler. Den præcise molekylære mekanisme ligger til grund for nedregulering af DNMT3B og G9A proteiner ved OAZ stadig undvigende. Vi foreslår en potent molekylær mekanisme, OAZ protein direkte eller indirekte binder til DNMT3B og /eller G9A proteiner og fremmer deres nedbrydning. OAZ proteinet er blevet kendt for at binde forskellige proteiner og fremmer deres nedbrydning [7] – [9], [49] – [51]. Den nuværende vores resultat understreger det komplekse forhold af histon methylering og modtageligheden for DNA-methylering. Disse beviser tyder på, at ekspression af gener relateret til DNA-reparation [25] kan aktiveres ved demethylering af CpG øer og H3K9me2 inden for de regulatoriske regioner.

Materialer og metoder

Cell kultur

Menneskelig oral cancer cellelinje, UM1 [52] og zink-inducerbare OAZ transfektant (pMT /CB6

+ HuFSAZ-wt) og mock vektor transfektant (UM1-pMT /CB6

+) blev dyrket som tidligere beskrevet [25]. Udtrykket af OAZ gen fra pMT /CB6

+ HuFSAZ-wt blev induceret med 100 uM ZnSO

4 behandling og protein prøverne blev høstet efter en uge ZnSO

4 behandling.

ODC aktivitet assay

for at kontrollere om OAZ protein oversat fra OAZ transfektant var biologisk aktivt protein i U1 celler, blev ODC enzymatisk aktivitet analyseres som beskrevet tidligere [10]. Kort fortalt blev ODC aktivitet kvantificeres frigivelsen af ​​[

14C] CO

2 under ODC-katalyseret omdannelse af L-ornithin til putrescin. Reaktionsblandingen indeholdt 50 pi cellelysat fremstillet ud fra OAZ transfektanten og mock vektor transfektant med og uden ZnSO

4 behandling, 75 pi 100 mM glycyl-glycin (pH 7,2), 0,2 mM pyridoxalphosphat, 4 mM dithiothreitol , 0,4 mM L-ornithin og 0,25 uCi [

14C] l-ornithin. Reaktioner blev udført ved 37 ° C i 2 timer og afsluttes ved opvarmning ved 85 ° C i 5 min. [

14C] CO

2 blev fanget med Whatman 3 mm papir filter plettet wit 10 pi 10% w /v KOH og kvantificeres ved scintillationstæller. Tredobbelte assays blev udført. Kontrolprøve var emnet indeholdende lyseringsbuffer i stedet for supernatanten. Korrigeret ODC aktivitet værdier blev opnået ved at trække værdier for blank og angivet som picomol CO

2 per time per milligram protein. Den statistiske analyse blev udført ved En faktor ANOVA-analyse.

HPLC-analyse

Intracellulær mængde ODC, polyaminer, SAM, dcSAM og SAH (S-adenosylhomecysteine) blev kvantificeret ved omvendt fase-HPLC-analyse . Hele cellelysater fra OAZ transfektanten og mock vektor transfectat med og uden ZnSO

4 behandling blev fremstillet i 0,2 M perchlorsyre. Cellelysaterne blev centrifugeret ved 13.000 x g i 10 minutter og supernatanterne blev underkastet omvendt fase HPLC-analyse på en Supercosil LC-18-DB-søjle (4,6 x 250 mm, 5 um porestørrelse) ækvilibreret med 0,2% triethylamin-phosphorsyre syre (pH 4,0). Eluering blev opnået med 20 min lineær gradient fra 0-10% acetonitril. Portionerne blev underkastet kromatografisk separation. Standarderne for ODC, polyaminer, SAM og SAH blev indkøbt fra Sigma-Aldrich. Standarden for dcSAM var en venlig gave fra Dr. Keijiro Samejima af Josai University i Japan.

Western blot-analyse af methyl-histon haler

Methylering status af hver histon haler blev verificeret ved Western blotting . De Protin prøver til western blot-analyser af histon haler blev fremstillet ved direkte at tilsætte 500 pi Laemmlis SDS-prøvepuffer til 100mm dyrkningsplade og cellerne blev høstet ved ophugning med en gummispartel. De høstede celler blev kogt i 15 minutter i prøvepuffer og centrifugeret ved 16.000 x g i 30 minutter. Proteinmængden blev estimeret ved celleantallet af det replikerede kultur. De ekstraherede proteiner svarende til 1 x 10

5-5 × 10

5 celler blev lastet og adskilt i 15% SDS-PAGE-gel, overført til en PVDF-membran, blokeret med 5% mælk i TBS-T buffer og blottet med hvert antistof ved anbefalet fortynding af fremstiller. Signalerne blev udviklet med Pierces SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrat og autografer på film. For at eliminere potentiel artefakt forårsaget af zink, vi gentog de samme eksperimenter ved hjælp af PCI-neo-hOAZ tarsnfectants (PCI-neo-hOAZ-UM1). De i denne undersøgelse anvendte antistoffer blev anskaffet fra Upstate Biotechnology. Antistofferne og deres katalognumre er; pan-histon H3 (07-690), pan-histon H4 (05-858), H3K4me1 (07-436), H3K4me2 (07-030), H3K4me3 (07-473), H3K9me1 (07-450), H3K9me2 ( 07-441), H3K9me3 (07-442), H3K27me1 (07-448), H3K27me2 (07-452), H3K27me3 (05-851), H3K36me1 (05-800), H3K36me2 (07-369), H3K36me3 (05 -801), H3K79me2 (05-835), H4K20me1 (05-735), H4K20me2 (07-367), H4K20me3 (07-463). De sekundære antistoffer blev anvendt, var HRP-mærket gede-anti-muse-IgG (PerkinElmer, NEF822001EA) og HRP-mærket gede anti-kanin IgG (PerkinElmer, NEF812001EA). Intensiteten af ​​hvert bånd blev målt og analyseret ved hjælp ImageJ software leveret af NIH (https://rsb.info.nih.gov/ij/).

Kvantitativ real-time PCR-analyse af DNMTs og G9A

Expression niveau af DNMTs og G9A mRNA’er blev kvantificeret ved kvantitativ realtids-PCR (QRT-PCR). Totalt RNA blev isoleret fra OAZ og mock vector transfektanter under anvendelse TRIzol® reagens (Invitrogen) ifølge producentens protokol. PCR primerne blev designet under anvendelse af MacVector Version 7.2 software baseret på cDNA-sekvenserne, der blev hentet fra NCBI-databasen. De QRT-PCR reaktioner blev udført under anvendelse af en LightCycler med LightCycler FastStart DNA Master SYBR Green I kit. Amplifikation af prøve-cDNA blev overvåget med det fluorescerende DNA-bindende farvestof SYBR Green i kombination med et ABI 5700 detektionssekvensen system. β-actin blev anvendt som en endogen kontrol for normalisering. PCR primersekvenser, optimale annealing temperaturer og amplicon størrelser er anført i tabel 1. Den statistiske analyse blev udført ved En faktor ANOVA-analyse.

Western blot-analyse af DNMTs og G9A proteiner

kerneekstrakt blev fremstillet ud fra OAZ og mock vector transfektanter under anvendelse NE-PER® Nuclear og cytoplasmiske Ekstraktion Reagenser (Thermo Scientific) i henhold til producentens protokol. Halvtreds ug af nukleart ekstrakt af hver prøve blev påsat og separeret i 5% SDS-PAGE-gel, og proteinet blev overført på en PVDF-membran. Den efterfølgende western blotting blev udført som beskrevet ovenfor. Antistofferne blev anvendt til denne undersøgelse, var en kanin polyklonalt anti-humant DNMT1 antistof (Abcam, ab19905, 1:500), en kanin-polyklonalt anti-muse DNMT3A antistof (Abcam, ab23565, 1:200), en kanin polyklonalt anti-muse DNMT3B antistof (Abcam, ab16049, 1:300) og et kanin-polyklonalt anti-humant G9A antistof (Upstate Biotechnology, 07-551,1:1,000). Den samme mængde prøve lastning blev overvåget, og bekræftet af Oct-1signal hjælp af en kanin polyklonalt anti-humant Oct-1 antistof (Santa Cruz Biotechnology, Inc., sc-232, 1:1,000).

DNMT enzym aktivitetsassay

DNMT enzymaktivitet blev bestemt ved fremgangsmåden ifølge Belinsky et al med mindre modifikationer [53]. Cellelysat blev fremstillet i lysepuffer ved frysning-optøning tre gange og centrifugeret for at fjerne cellerester. Cellelysat indeholdende 20 ug protein (125 pi) blev blandet med 125 pi reaktionsblanding (20 mM Tris-HCI, pH = 7,4, 25% glycerol, 5 mM EDTA, 1 mM DTT, 5 uCi [methyl-3H] -S-adenosyl -L-methionin, 4 ug poly [di-dC] poly [di-dC], 25 ug BSA) og inkuberet i 2 timer ved 37 ° C. Reaktioner blev standset, og DNA’et blev ekstraheret med phenol: chrolform ekstraktionsmetode. Den vandige opløsning blev suppleret med 0,1 N NaOH og inkuberet i 2 timer ved 50 ° C. Reaktionsblandingen blev neutraliseret med 1 N HCI. DNA blev udfældet med 20% TCA og fanget på G /C-filter. Radioaktiviteten blev talt med en scintillationstæller.