PLoS ONE: Calcitonin Receptor-zonula occludens-1 Interaktion er kritisk for Calcitonin-stimuleret Prostata Cancer Metastase

Abstrakt

rolle neuroendokrine peptid calcitonin (CT) og dets receptor (CTR) i epitelial kræft progression er en ny koncept med stor klinisk potentiale. Ekspression af CT og CTR ofte forhøjet i prostatacancere (PC’er) og aktivering af CT-CTR aksen i ikke-invasive PC celler inducerer en invasiv fænotype. Her viser vi ved gær-to hybrid skærme, CTR associerer med tight junction-protein zonula occludens-1 (ZO-1) via interaktionen mellem type 1 PDZ motiv ved carboxy-terminalen af ​​CTR og PDZ3 domænet af ZO-1 . Mutation af enten CTR C-PDZ-bindende motiv eller ZO-1-PDZ3 domænet påvirkede ikke binding af CTR med dens ligand eller G-protein-medieret signalering, men ophævede destabiliserende virkninger af CT på tætte forbindelser og dannelse af fjernmetastaser ved orthotopisk implanterede PC celler i nøgne mus, hvilket indikerer, at disse PDZ domæne interaktioner var patologisk relevant. Endvidere observerede vi CTR-ZO-1 interaktioner i PC prøver ved nærhed ligation immunhistokemi, og identificeret, at antallet af interaktioner i metastatiske PC prøver var adskillige gange større end i ikke-metastatisk PC. Vores resultater for første gang demonstrere en mekanisme, hvorved PDZ-medieret interaktion mellem CTR og ZO1 er påkrævet for CT-stimuleret metastase af prostatacancer. Da mange receptorer indeholder PDZ-bindende motiver, ville dette tyder på, at PDZ-bindende motiv-adapter protein interaktioner udgør en fælles mekanisme til kræft metastase

Henvisning:. Aljameeli A, Thakkar A, Thomas S, Lakshmikanthan V, Iczkowski KA, Shah GV (2016) Calcitonin receptor-zonula occludens-1 Interaktion er kritisk for Calcitonin-stimuleret Prostata Cancer metastaser. PLoS ONE 11 (3): e0150090. doi: 10,1371 /journal.pone.0150090

Redaktør: Natasha Kyprianou, University of Kentucky College of Medicine, UNITED STATES

Modtaget: 29 oktober, 2015; Accepteret: 9. februar 2016 Udgivet: 2. marts, 2016

Copyright: © 2016 Aljameeli et al. Dette er en åben adgang artiklen distribueres under betingelserne i Creative Commons Attribution License, som tillader ubegrænset brug, distribution og reproduktion i ethvert medie, forudsat den oprindelige forfatter og kilde krediteres

Data Tilgængelighed:. Alle relevante data er inden for papir og dens Støtte Information filer

Finansiering:.. NIH CA096534

konkurrerende interesser:. forfatterne har erklæret, at der ikke findes konkurrerende interesser

Introduktion

Calcitoninreceptor (CTR) er et medlem af B-familie af G-protein-koblede receptorer (GPCR’er), som indeholder en lang række lægemiddelkandidater. CTR binder neuroendokrin peptid CT at opretholde calcium homeostase i knogler og nyrer [1]. sit udtryk i flere organer og dens handlinger i udvikling, cellevækst og differentiering antyder dog, at CTR kan have mere forskelligartet rolle Tolcos et al. [2], [3,4]. Den overflod af CT- og CTR transkripter forøges i maligne prostata, og korrelerer positivt med Gleason kvalitet af prostatacancer (PC). Desuden aktivering af CT-CTR autokrin akse stimulerer flere processer, der er forbundet med tumorvækst, invasion, angiogenese, kemoresistens og metastase, hvilket antyder, at CTR fungerer som en vigtig faktor i udviklingen af ​​en lokaliseret PC til sin metastatisk form [5-7] .

CTR mRNA-sekvens isoleret fra human prostata mangler en 16-aminosyre insert i den første intracellulære loop, en egenskab ved isoform 2 i CTR [8,9]. CTR2 par til begge stimulatoriske GTP binding protein G

aS og G

αq at co-stimulere adenylylcyclase og phospholipase C [10]. Desuden CTR destabiliserer stram og adherensovergange og aktiverer ikke-G-proteinkoblede signaleringsveje såsom PI-3-kinase (PI3K) -Akt-survivin og WNT /ß-catenin [5,11]. den præcise mekanisme, hvormed CTR stimulerer Men prostatakræft metastaser er ikke blevet identificeret.

Siden afbrydelse af intercellulære kryds og erhvervelse af invasiv fænotype er obligate skridt i tumorprogression undersøgte vi virkningen af ​​CTR på tætte forbindelser (TJs) og dens betydning i CTR-stimuleret metastaser af PC celler. I denne rapport viser vi, at det cytoplasmatiske (C) halen af ​​CTR associerede med tight junction (TJ) protein zonula occludens-1 (ZO-1) via interaktionen mellem type 1 PDZ-bindende motiv i carboxyterminalen af ​​CTR og PDZ3 domæne af ZO-1. Dette samspil er afgørende for de handlinger CTR på TJ destabilisering samt fjernmetastaser af prostata kræftceller.

Materialer og metoder

Dyr

Male BALB /c nu /nu mus (6-8 uger gamle) blev erhvervet fra Harlan (Madison, WI), og huset to pr bur i microisolator enheder i en barriere facilitet på en højeffektiv partikler arrestance (HEPA) -filtered rack under standardbetingelser på 12-timers lys /mørke cyklus, fodres

ad libitum

på en standard autoklaveret laboratorium kost, og karantæne i en uge forud for deres anvendelse i undersøgelsen.

Cell Culture

LNCaP, PC-3 og DU-145-cellelinjer blev opnået fra American Tissue Culture Collection (Manassas, VA), og vedligeholdes som anbefalet af leverandøren i vores laboratorium i mindre end seks måneder efter modtagelsen. PC-31 sublinie var en isoleret PC-3 ortholog der manglede CT og CTR mRNA (S1 Appendiks, S1A-S1D Fig). PC-3M-cellelinje blev leveret af Dr. Isiah Fidler (MD Anderson Cancer Center, Houston, TX). PC-3, PC-31 og PC-3M cellelinjer blev bekræftet af STR profilering (S1 Appendiks)

DNA konstruktioner:. FLAGCTRwt og FLAGCTRΔESS

CTR C-PDZ bindende motiv ( ESSA) blev erstattet med alaniner ved at indsætte uoverensstemmelser i de respektive codon som understreget. Primersekvenserne var som følger:

Forward Primer: 5′-AAG /CTT /ATG /GAC /tac /AAG /GAC /GAC /gat /GAC /AAG /AGC /TTC /ACA /ttt /aca /AGC /CGG /TGC /TTG-3 ‘

Reverse primere:

CTRwt: 5′-ctc /gag /TCA /AGC /ag /tga /CTC /TTG /CTC /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /ctc-3 ‘

CTRΔESS: 5′-CTC /gag /TCA /AGC /AGC /AGC /AGC /TTG /ctc /tat /gat /att /CAA /agg /gat /gat /ctc-3 ‘

fuld længde FLAG-CTRwt og FLAG-CTRΔESS blev indsat i pcDNA3.1 ekspressionsvektor ved retningsbestemt kloning (Invitrogen) [12].

ZO-1ΔPDZ mutanter

ZO-1-cDNA-sekvens var muteret ved at slette hver /eller alle tre PDZ-domæner for at opnå følgende fire mutanter: ΔPDZ1 (aa 2-156) , ΔPDZ2 (aa 159-252), ΔPDZ3 (aa 294-633) og ΔPDZX (aa 67-1033) [13]. Alle ZO-1 konstruktioner blev myc tagget ved C-terminalen og klonet i pCB6 eukaryote ekspressionsvektor [13].

cDNA-konstruktioner blev transficeret i PC-3-celler ved anvendelse af FuGene 6 ™, valgt i G418, flere kloner blev undersøgt, og dem der udtrykker stabil transgenekspression blev udvalgt til efterfølgende undersøgelser som beskrevet tidligere [11,14].

Gær to-hybrid screening

cDNA-sekvensen svarende til C-terminale domæne af hCTR2 (resterne 411-476) blev indsat i ramme i pNLex-NLS gærekspressionsvektor [15]. Denne agn plasmid blev anvendt til at transformere gær stammen RFY231:

MAT ± ura3-1 his3 trp1î Mærkat ::

hisG

3LexAop-

LEU2 Mærkat ::

leu2

. Den transformerede gær blev derefter parret med gær (RFY309:

MAT

α

his3î200 leu2-3 lys2î201 ura3-52 trp1îhisG

: pSH18-34) pre-transformeret med et humant prostata-cDNA-bibliotek i pJG4 -5 vektor (Origene). Alle reddede kolonier blev opsamlet og deres galactose afhængighed, Leu og lacZ fænotyper blev testet [15,16]. ORF’er af alle galactose-afhængige kloner blev isoleret ved PCR og klonet ind transkriptionsaktiveringsdomæne (AD) vektor ved mellemrummet reparation. AD kloner blev derefter parret mod lokkemad for at bekræfte, at Leu og lacZ fænotyper var afhængige af ORF. Positive AD kloner blev yderligere testet for specificitet ved at parre sig med 7 agn stammer udtrykker ubeslægtede lokkemad (

Campylobacter

proteiner) [16].

For at kontrollere styrken af ​​interaktion, original agn stamme blev parret med stammer, der udtrykker hver isoleret AD-klon, og reporter aktivering blev scoret på 0-3 skala for vækst på leu-plader (0 = ingen vækst; 3 = maksimal vækst); og 0-5 skala for lacZ-aktivitet på X-gal-plader (0 = hvid; 5 = mørkeblå). Alle interaktionskandidater i denne skærm scorede maksimal vækst på leu; og fraværet af lacZ-aktivitet viste en svag, men reproducerbar interaktion.

Cyklisk (c) AMP, proteinkinase A (PKA), og proteinkinase C (PKC) Assays Salg

PC-3CTR og PC-3CTRΔESS celler blev dyrket i plader med 24 brønde, vasket og stimuleret med forskellige koncentrationer af CT (0-100 nM) i 3 minutter. Cellerne blev lyseret med iskold 10% TCA-opløsning, og lysaterne blev analyseret for cAMP-niveauer ved radioimmunanalyse.

I PKA og PKC assays lysaterne af ubehandlede /CT-behandlede celler blev inkuberet med respektive PKA eller PKC-substrat peptid og

32P-ATP som beskrevet i protokollen tilvejebragt af producenten (Promega, Madison, WI). Kort fortalt behandles cellerne med CT eller køretøjet i 10 minutter (2 x10

6 celler pr 100-mm-skål) blev høstet i lysispuffer (50 mM Tris, pH 7,5, indeholdende 5 mM EDTA, 50 mM NaF, 1 mM natriumpyrophosphat, 0,5 mM EGTA, 10 mM ß-mercaptoethanol, 1 ug /ml leupeptin og 1 ug /ml aprotinin), sonikeret, og debris blev fjernet ved centrifugering. Ekstrakterne blev derefter inkuberet i 5 minutter ved 30 C i reaktionspuffer [slutkoncentration var 50 mM Tris, pH 7,5; 10 mM MgC

2; 100 uM ATP; 4 nM [

32P] ATP; 0,25 mg /ml BSA; og 50 uM PKA eller PKC substratpeptider (Promega Corp., Madison, WI)]. 10 uM cAMP (total PKA-aktivitet), tjente som en positiv kontrol og 1 uM PKI plus cAMP tjente som en negativ kontrol for PKA-assays (total baggrund aktivitet). Triplikater af hver prøve blev analyseret, og blottet på SAM2 biotin capture membraner i slutningen af ​​inkubationen (Promega Corp., Milwaukee, WI). Membranerne blev derefter vasket grundigt med 2 M NaCl samt 2 M NaCl 1% H

3PO

4, og det bundne phosphorylerede substrat på en filterskive blev kvantificeret i en scintillationstæller. PKI-inhiberbare kinase aktivitet blev beregnet, og dataene blev rapporteret som picomol ATP pr minut pr g protein.

Immunofluorescens

Cellerne (ca. 5×10

4 celler) blev dyrket enten på transwell kamre (0.4μm porestørrelse) og dyrket til konfluens (ca. 5 dage). Cellerne blev derefter fikseret, og immunolabeled med det egnede primære antistof (muse-anti-CTR, acris Laboratories; kanin anti-ZO-1-serum, Invitrogen; kanin-anti-claudin 3 antiserum, Invitrogen) natten over ved 4

0 C . De tilsvarende sekundære antistoffer konjugeret med fluoroforer blev anvendt. Efter vaskene blev objektglassene observeret under Nikon Optiphot-2 mikroskop udstyret til epifluorescens. Billederne blev taget med Retiga 1300 kamera tilsluttet en iMac computer fyldt med ivision billede analyseprogram (BioVision Technologies, Exton, PA). Alle antistoffer blev karakteriseret for specificitet og krydsreaktivitet som beskrevet i S1 tillæg S2A-S2C Fig.

Måling af transepitelialt Electric Resistance (TER) og paracellulær permeabilitet (PCP)

Ca. 5×10

4-celler blev udpladet på Transwell-filtre (0.4μm porestørrelse) og dyrket til konfluens (som regel 5-6 dage). TER (i dobbelte brønde) blev målt på flere tidspunkter med EVOM volt-ohm meter som beskrevet tidligere [11]. Aflæsningerne blev korrigeret for de datoer (TER værdier af filteret i badevand medium). Integriteten og celle tæthed af monolag blev nøje overvåget.

For PCP målinger blev cellerne dyrket til sammenflydning på Transwell filtre. Tetra methyl rhodamin-dextran (1 mg /ml, ~ 4 kDa, Sigma) blev tilsat til det øvre kammer. Fluorescens af det nedre kammer medium blev målt i Modulus Microplate Reader (Turner Biosystems) efter en time.

In vitro

Invasion Assay

blev udført Invasion forsøg i 24-brønds , to rumopdelt, Matrigel ™ invasion kamre som beskrevet tidligere [17]

vækst Korrektion:. da CT også inducerer proliferation af PC cellelinier, bestemte vi faktor til at korrigere for eventuel proliferation af celler, der kan have migreret i tidlige fase af 24 timer inkubationsperiode. 25 x 10

4-celler blev udpladet ved timeintervaller i seks brønde og dyrket i 1-24 timer. Mean procent stigning i celletal i hver brønd blev bestemt. Denne korrektion blev anvendt på resultaterne af invasion assays.

CTR-C Pull-down Assay

cDNA kodende det intracellulære domæne af CTRwt og CTRΔESS (aa 441-476) blev klonet i pGEX-vektor (GE Healthcare, Piscataway, NJ). Kontrol (C) -cDNA konstruere (tilfældig cDNA-sekvens af tilsvarende længde) blev fremstillet til en negativ kontrol. CDNA’erne blev udtrykt i BL-21

Escherichia coli

stammen, og tilsvarende mængde af hvert fusionsprotein (ca. 2 mg) blev absorberet på glutathion-Sepharose 4B (GE Healthcare). Perlerne indeholdende GST-fusionsproteiner C-peptid, CTR-CWT og CTR-CΔESS blev derefter inkuberet med PC-31-cellelysat. De bundne proteiner blev elueret med reduceret glutathion. Tilstedeværelsen af ​​ZO-1 i eluatet blev detekteret ved Western blotting.

Overlay assays

Overlay assays blev udført som tidligere beskrevet [18]. Cellelysater fra stabile PC-3M transfektanter udtrykkende enten ZO-1 vægt-MYC eller ZO-1ΔPDZ-myc-mutanter blev fremstillet, fraktioneret på en SDS-PAGE-gel og overført til nitrocellulosemembraner. Blottet blev skåret i strimler, der repræsenterer hver bane af gelen. Strimlerne blev derefter blokeret i langt Western buffer og inkuberet med oprenset GST tagged CTRwt fusionsprotein natten over ved 4 ° C, og forarbejdet til GST immunblotting. For protein lastning kontrol blev blots strippet og testet igen for MYC.

Co-immunoprecpitation

Serum-sultede PC-31-V, PC-31-CTRwt eller PC-31-CTRΔ ESS-celler (2 x 10

6 pr 100 mm skål) blev stimuleret med /uden 50 nM CT i 3 minutter, vasket og lyseret i undersøgelsesperioden buffer som tidligere beskrevet [19]. CTR i normaliserede lysat proteiner blev immunpræcipiteret med anti-FLAG EZ-view perler (Sigma), og elueret med FLAG-peptid (600 ug /ml i PBS). CTR immunopreciptates blev behandlet for ZO-1 immunoblotting. For at kontrollere for protein lastning og overførsel blev blots strippet og testet igen med immunpræcipitering antistof.

Acceptor Foto-blegning fluorescensresonansenergioverførsel (FRET) Mikroskopi

PC-31-celler blev udpladet på glas nederste kamre og dyrket natten. Cellerne blev transficeret med CTRwt-ECFP-N1 (eller CTRΔESS-ECFP-N1) og ZO-1 vægt-EYFP-N1 (eller ZO1-ΔPDZ3-EYFP-N1) plasmider ved anvendelse af Lipofectamin ™, dyrket i yderligere 36 timer, og filmede levende efter behandling med 50 nM CT (eller kontrol) ved stuetemperatur ved hjælp Nikon Eclipse 2000 TE forbundet med Sensicam-qe (Cooke Corporation, Romulus, MI). Fælles fiskeripolitik og YFP billeder blev erhvervet med excitation ved 436 nm og emission ved 480/535 nm. En 505 nm dikroisk filter sat i Dual View blev brugt til at opdele billederne (Optiske Insights, Santa Fe, NM). FRET blev indspillet ved at overvåge quenching af den fælles fiskeripolitik under YFP fotoblegning. Billederne blev analyseret med IPLab 4,0 imaging software (Scanalytics, Inc, Rockville, MD) og FRET effektivitet blev beregnet ved hjælp af formlen: FRET

Effektivitet = (donor fælles fiskeripolitik

efter blegning-donor fælles fiskeripolitik

før blegning) /donor fælles fiskeripolitik

efter blegning. Tærskler for donor (FFP), acceptor (YFP), og FRET billeder blev sat i begyndelsen af ​​dataindsamling og blev holdt uændret for hele datasættet.

In situ

nærhed ligeringsassayet (PLA)

Faste PC celler eller væv blev immunolabeled med primære antistoffer (anti-kanin ZO-1 serum og anti-gede-CTR serum) i natten over ved 4 ° C. De sekundære antistoffer med vedhæftede PLA sonder leveres i duoLink ™ kit (Olink Bioscience, Uppsala, Sverige). CTR-ZO-1 interaktion blev observeret af konfokalmikroskopi på 400X. En rød fluorescerende prik angiver de to proteiner er inden 35 nm afstand. Antallet af punkter pr celle blev bestemt ved Blobfinder ™ billede analyse software [20].

Frosne Prostata tumorer

Snap-frosne menneskelige prostata tumor prøver blev opnået fra Louisiana Cancer Research Center, og var forarbejdet til co-immunfældning som tidligere beskrevet [21]. De menneskelige prostatakræft tumorvæv blev opnået fra Louisiana Cancer Research Consortium (LCRC, New Orleans, LA) med skriftlig patient samtykke og godkendelse af begge institutioner Institutional Review Board, IRB fra University of Louisiana at Monroe og Tulane Forskningsudvalget Universitet ( Turc) af Tulane University Medical center og Louisiana Cancer Research center. For en lignende undersøgelse se Liu et al [22].

ortotopisk tumorvækst og metastase

For at detektere mikrometastaser af implanterede tumorceller i mus, vi transficeres stabilt de cellelinjer med DsRed-MCherry- Hyg-N1 (Clontech, Palo Alto, CA). Hygromycin resistente kolonier der udtrykte stærk rød fluorescens på et stabilt niveau i løbet af observationsperioden blev udvalgt, og bruges til ortotopisk implantation.

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med de principper og procedurer, der er skitseret af NIH og Institutional Animal Pleje og brug Udvalg på University of Louisiana at Monroe. Dyret procedurer, der anvendes i denne undersøgelse blev godkendt af IACUC fra University of Louisiana at Monroe. Den orthotopisk implantation kirurgi blev udført under Ketamin /Xylazin anæstesi som beskrevet tidligere [6]. Tumor cellesuspensioner (1×10

6 celler /20 pi) blev injiceret i den dorsale prostata blev dyrene overvåget for tumorvækst og metastase ved fluorografi under anvendelse af Kodak 4000 MM imaging station, og aflivet inden tres dage [23]. Dyrene blev observeret dagligt og humant aflives ved CO

2 inhalering, da de mødtes følgende humane endpoint kriterier: udmattelse, hudlæsioner, betydelig krop vægttab, åndedrætsbesvær, næseblod, roterende bevægelse og kropstemperatur dråbe. Adskillige organer blev opsamlet, fikseret og undersøgt for tumormetastase. Eutanasi blev udført af uddannede efterforskere Drs. Arvind Thakkar og Vijaybasker Lakshmikanthan. Dr. Shibu Thomas var involveret i begyndelsen af ​​studiet, hvor han bidrog til udviklingen af ​​konstruktioner, generering af cellelinjer og etablering af ortotopisk implantation model.

Ved obduktion primær tumor og andre organer blev høstet og vejet . Våde sektioner af organer blev undersøgt for tilstedeværelse af RFP. De resterende væv blev fikseret i neutral bufret formalin og bearbejdet for H 0,05 (-CT vs + CT, en way ANOVA og Newman-Keuls test). E. I et eksperiment svarende til 2B PCP blev bestemt ved diffusion af ~ 4kDa TRITC-konjugeret dextran fra den øvre til det nedre kammer i to timer. Resultaterne er udtrykt som ug /m /time af TRITC-Dextran diffust ± sem for n = 6. * p 0,05 (-CT vs + CT, En-vejs ANOVA og Newman-Keuls test). F. PC-3mV og PC-3MCTR

KD celler blev testet for PCP som beskrevet i fig 2C. Igen, knock-down af CTR produceret et signifikant fald i PCP af PC-3M-celler, hvilket viser betydningen af ​​endogene CTR i regulering TJ stabilitet PC-3M-celler. Resultaterne er udtrykt som ug /m /time af TRITC-Dextran diffust ± sem for n = 6. * p 0,05 (-CT vs + CT, En-vejs ANOVA og Newman-Keuls test). G. Invasion: PC-3V, PC-3CTRwt og PC-3CTRΔESS celler blev tilsat til øvre insert på invasion kamre sammen med /uden 50 nM CT, og celler, der passerede gennem Matrigel ™ barriere ™ blev talt efter 48 timer. Resultaterne er udtrykt som middelværdi antal invaderede celler pr 400X felt ± s.e.m. for n = 6. * p 0,05 (PC-3V vs. PC-3CTR-wt); $ P 0,05 (PC-3CTR-wt vs. PC-3CTRΔESS); $ $ -p 0,05 (PC-3CTRwt + CT vs PC-3CTRΔESS + CT) (En-vejs ANOVA og Newman-Keuls test). H. CTR immunoreaktivitet i PC-3V, PC-3-CTRwt og PC-3CTRΔESS celler. Cellerne blev behandlet med /uden 50nM CT. CTR i normaliserede lysat proteiner blev kvantificeret ved immunoblotting. Repræsentant blot af tre separate eksperimenter.

B. PCP.

TJs danner en barriere, der regulerer transport af ioner, opløste stoffer og vækstfaktorer mellem celler. For at detektere, om CT påvirker “lækage sti”, dvs. barriere for store ladede molekyler, vi målte diffusion af fluorophor-konjugeret dextran tværs polariseret pc cellelinje monolag. PC-3V celler udviste relativt lav PCP og eksogent CT ændrede ikke det (Fig 2D). Ekspression af CTRwt i PC-3-celler forårsagede en lille stigning i deres PCP, og tilsætningen af ​​CT forøgede PCP betydeligt. I modsætning hertil CTRΔESS ekspression havde ringe virkning på PCP i nærvær eller fravær af CT. Når testet på forskellige CT-koncentrationer, CT inducerede en stigning i PCP af PC-3CTRwt celler ved doser på 1 nM eller højere efter 2 timer inkubation (fig 2E). Igen havde CT ikke ændre PCP af PC-3CTRΔESS celler på alle testede koncentrationer (figur 2E). For at undersøge betydningen af ​​endogene CTR i TJ stabilitet, vi igen anvendte PC-3M-celler [30]. Som forventet, CTR

KD faldt betydeligt PCP af PC-3M-celler (Fig 2F). Når betragtes samlet, disse resultater antyder, at CT-CTR-aksen kan være involveret i dynamisk regulering af TJs i prostata celler.

C. Invasion.

CT forøger invasivitet, og selv inducerer en invasiv fænotype i ikke-invasive PC celler [14]. Vi undersøgte rollen af ​​PDZ-bindende motiv i CT-stimuleret invasion. Ekspression af CTRwt i PC-3-celler forøget invasion ved 2,5 gange (fig 2G). Men ekspressionen af ​​CTRΔESS ikke forårsage en tilsvarende stigning. Når stimuleret med 50 nM CT, PC-3-CTRwt celler reagerede med yderligere 2,5 gange stigning i invasionen, men PC-3CTRΔESS ikke gjorde. Da CTRwt og CTRΔESS havde dramatisk forskellige virkninger på TER, PCP og invasion, vi ønskede at gøre sikker på, at varianserne ikke var på grund af forskellene i deres CTR-niveauer. Immunreaktivt CTR niveauer var ens i alle cellelinier i nærvær eller fravær af CT (figur 2H), hvilket tyder på, at interaktionen af ​​CTR med sin partner protein gennem sin PDZ-bindende motiv er kritisk for dets destabiliserende handlinger på TJs og fremme invasion

CTR også destabiliserer TJs og øger invasion af andre pc-cellelinjer

Vi har også testet, om CT producerer lignende virkninger i LNCaP, PC-3M og DU-145-cellelinjer, der udtrykker endogene CTR (fig 1A ). CT reduceret TER og øget PCP af disse cellelinjer, hvilket tyder CT destabiliserer TJs i androgen-responsive samt androgen-refraktære PC cellelinjer (Fig 3A og 3B). Tilsvarende CT signifikant forøget invasion af mindre invasiv LNCaP samt mere invasive DU-145 og PC-3M-celler (Fig 3C).

LNCaP, PC-3M og DU-145-celler blev behandlet med 50 nM CT og deres TER (A), PCP (B) og invasion (C) blev målt som beskrevet i Methods. Resultater er præsenteret som gennemsnit ± SEM (n = 6). * P 0.05 fra tilsvarende kontrol (-CT vs + CT, En-vejs ANOVA og Newman Keuls test). ^ P 0,01 (-CT vs + CT, En-vejs ANOVA og Newman-Keuls test)

Identifikation af CTR-interagerende protein

Da virkningen af ​​CTR på TJ. stabilitet og invasion kræves PDZ-bindende motiv, søgte vi at identificere CTR-interagerende protein ved Y2H komplementering screening. Efter screening 1×10

6 transformanter, 11 interagerende kloner blev identificeret, oprenset og sekventeret (tabel 1). Mest positive kloner indkodede plasmamembran proteiner og /eller proteiner associeret med adenylylcyclase systemet. Som en hidtil ukendt konstatering, en klon kodet tight junction protein ZO-1, og denne klon gav også det stærkeste signal i den sekundære screening. Siden CTR destabiliseret TJs kun i overværelse af PDZ-bindende motiv, vi karakteriseret CTR-ZO-1 interaktion yderligere

CTR-C-hale interagerer med ZO-1:. A. Pull-down assay

CTR-C hale-ZO-1 interaktion blev undersøgt ved hjælp af GST pull-down-analyser.